劉慶慶，吳 鵬，李培東，張江偉，陳創(chuàng)夫,肖陳誠(chéng)

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心,石河子 832000；3.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起，發(fā)病豬以出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖衰竭和呼吸窘迫為特征[1-2]。該病于20世紀(jì)80年代末在美國(guó)首次報(bào)道[3-4]，并于1995年在中國(guó)北京首次發(fā)現(xiàn)，此后在全國(guó)范圍內(nèi)迅速傳播[5]；2006年在中國(guó)出現(xiàn)的能引起高發(fā)病率和高死亡率疫情的高致病性PRRSV給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6-8]。2013年以后，一種與美國(guó)毒株NDC30相似性很高的新型PRRSV毒株NADC30-like在中國(guó)多個(gè)地區(qū)逐漸流行[9-10]，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了巨大的威脅。

PRRSV是一種有包膜的正鏈 RNA 病毒，屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科[11-12]。目前，根據(jù)其基因組序列的特征，將PRRSV毒株較為系統(tǒng)地分為歐洲型和美洲型2種基因型，也稱為基因Ⅰ型和基因Ⅱ型[13]。2個(gè)PRRSV基因型只有約60%的相似性，但這2種毒株所引起的PRRS的臨床癥狀較相似[14]。

核衣殼蛋白(N，15 ku)、膜蛋白(M，19 ku)和包膜糖蛋白(GP5，26 ku)是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別由ORF7、ORF6和ORF5基因編碼[15]。另外3個(gè)糖蛋白GP2、GP3和GP4代表次要結(jié)構(gòu)蛋白。N蛋白具有高度抗原性，因此成為用于檢測(cè)病毒特異性抗體以進(jìn)行診斷或監(jiān)視的候選蛋白。在感染PRRSV的豬產(chǎn)生的諸多特異性抗體中，最早產(chǎn)生的是針對(duì)N蛋白的抗體且抗體存在時(shí)間最長(zhǎng)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)以PRRSV N蛋白作為亞單位疫苗組分可增強(qiáng)疫苗保護(hù)率[16-18]。

本研究通過(guò)腺病毒包裝技術(shù)成功表達(dá)N蛋白，并在分子和動(dòng)物水平上鑒定其反應(yīng)原性和免疫原性，以期為PRRS的診斷與防控提供物質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和載體

8周齡健康昆明雌性小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP及PBHGLOX (delta)E1,3Cre均購(gòu)自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)；大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；293A細(xì)胞購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ均購(gòu)自TaKaRa公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DM2000 DNA Marker、100 bp DNA Ladder、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和HRP標(biāo)記的羊抗豬抗體均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;1 kb DNA Ladder購(gòu)自禮美生物科技(上海)有限公司；佐劑Gel和LM及臨床PRRSV抗體陽(yáng)性血清均由石河子大學(xué)人獸共患病實(shí)驗(yàn)室制備并保存；PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 目的基因設(shè)計(jì)及合成

依據(jù)PRRSV HNjz15 毒株(GenBank登錄號(hào)：KT945017.1)的N基因序列，對(duì)序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化并在末端加上His標(biāo)簽序列，同時(shí)在該序列的上、下游分別加上EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，N基因由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

1.4 重組腺病毒的構(gòu)建

將N基因與穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切，使用T4 DNA連接酶將純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定均正確后命名為pDC316-N。將穿梭質(zhì)粒pDC316-N與AdMax腺病毒系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒PBHGLOX(delta)E1,3Cre共同轉(zhuǎn)染匯合度為60%～70%的293A細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待80%左右細(xì)胞發(fā)生病變并從底部脫落時(shí)，收獲病毒液，將獲得的病毒命名為rAd-N；連續(xù)傳代進(jìn)行擴(kuò)增，濃縮后檢測(cè)病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(median tissue culture infective dose，TCID50)，提取病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定。

1.5 RT-PCR及Western blotting檢測(cè)PRRSV N蛋白的表達(dá)

取接種重組腺病毒和未接種重組腺病毒的293A細(xì)胞各一板，按TRIzol裂解法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR檢測(cè)。用收獲的重組腺病毒液接種長(zhǎng)滿單層的293A細(xì)胞，裂解后加入0.2倍體積的5×SDS蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印到0.22 μm PVDF膜上，使用臨床PRRSV抗體陽(yáng)性血清和HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG進(jìn)行Western blotting鑒定。

1.6 小鼠免疫試驗(yàn)

1.6.1 小鼠免疫接種 將50只昆明小鼠隨機(jī)分為7組，各組按照表1程序進(jìn)行免疫。每組小鼠均采用背部皮下免疫，0.5 mL/只，均在注射疫苗前用斷尾法采血，之后每次間隔7 d采血，持續(xù)5周。將采集的血液立即置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置沉淀2 h，6 000 r/min離心10 min，收集其清亮透明的上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 小鼠免疫及分組情況

1.6.2 免疫小鼠抗體水平檢測(cè) 使用PRRSV抗體ELISA試劑盒檢測(cè)免疫后各周小鼠的抗體水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

將pDC316-N菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示,得到大小約為400 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。對(duì)pDC316-N重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切得到大小約為5 850和400 bp的條帶(圖2)，測(cè)序結(jié)果與PRRSVN基因合成序列一致，表明pDC316-N穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M，100 bp DNA Ladder；1～4，重組質(zhì)粒pDC316-N PCR產(chǎn)物；5，陰性對(duì)照M，100 bp DNA Ladder；1-4，PCR products of recombinant plasmid pDC316-N；5，Negative control圖1 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-N的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant Adenovirus shuttle plasmid pDC316-N

M，1 kb DNA Ladder；1，pDC316-N雙酶切產(chǎn)物；2，pDC316-mCMV-EGFP雙酶切產(chǎn)物M，1 kb DNA Ladder；1，Double digestion products of pDC316-N；2，Double digestion product of pDC316-mCMV-EGFP圖2 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-N雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant Adenovirus shuttle plasmid pDC316-N by double enzyme digestion

2.2 重組腺病毒構(gòu)建

重組穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后10 d，細(xì)胞出現(xiàn)病變(圖3)，收集病變的293A細(xì)胞，獲得1株重組腺病毒rAd-N。將重組腺病毒連續(xù)傳代，接種后48～72 h均出現(xiàn)細(xì)胞病變，提取DNA，PCR可擴(kuò)增出400 bp的目的條帶，對(duì)照組無(wú)任何條帶(圖4)，測(cè)得濃縮后重組腺病毒病毒TCID50為10-10.239。

A，293A細(xì)胞對(duì)照；B，感染rAd-N的293A細(xì)胞A，293A cell control；B，293A cells infected with rAd-N圖3 重組腺病毒rAd-N的包裝(100×)Fig.3 Packaging of recombinant Adenovirus rAd-N (100×)

M，DM2000 DNA Marker；1、2，rAd-N PCR產(chǎn)物；3陰性對(duì)照M，DM2000 DNA Marker；1 and 2，PCR products of rAd-N;3，Negative control圖4 重組腺病毒rAd-N的PCR檢測(cè)Fig.4 PCR detection of recombinant Adenovirus rAd-N

2.3 重組腺病毒的表達(dá)檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在400 bp處出現(xiàn)明亮的條帶(圖5)，表明該重組腺病毒表達(dá)的PRRSVN基因能在293A細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在14 ku處觀察到特異性條帶 (圖6)，與預(yù)期N蛋白分子質(zhì)量大小基本一致，重組腺病毒rAd-N可與臨床PRRSV抗體陽(yáng)性血清結(jié)合，表明重組腺病毒rAd-N具有良好的反應(yīng)原性。

2.4 抗PRRSV特異性抗體的檢測(cè)

由圖7可知，每組小鼠抗體含量隨著時(shí)間的持續(xù)而變化，rAd-N各免疫組小鼠初免第1周抗體水平明顯升高，且抗體含量顯著高于G組(對(duì)照組)(P<0.05)，說(shuō)明rAd-N能激起小鼠產(chǎn)生特異性的抗PRRSV抗體。在免疫后第5周時(shí)，除A組外其他各免疫組抗體水平仍顯著高于G組(對(duì)照組)(P<0.05)。在B、D、F組中，D組于初次免疫后第1周抗體水平顯著高于B組(P<0.05)，并于初免后第2周顯著高于F組(P<0.05)， F組初次免疫后

第3周抗體水平顯著高于B組(P<0.05)，免疫rAd-N后，A、C、E組之間抗體水平雖有所差異，但差異不顯著(P>0.05)。 在所有免疫組中，D組(Gel佐劑)抗體水平較其他組稍高，最高可達(dá)7.84 U/L。在免疫后第3和5周，使用同一佐劑時(shí)，初次免疫后加強(qiáng)免疫組(B、D、F組)抗體水平高于對(duì)應(yīng)的單劑免疫組(A、C、E組)，但差異不顯著(P>0.05)。

M，100 bp DNA Ladder；1～5，rAd-N RT-PCR產(chǎn)物；6，陰性對(duì)照M，100 bp DNA Ladder；1-5，rAd-N RT-PCR product；6，Negative control圖5 重組腺病毒rAd-N RT-PCR檢測(cè)Fig.5 RT-PCR detection of recombinant Adenovirus rAd-N

1、2，重組腺病毒rAd-N與PRRSV抗體陽(yáng)性血清反應(yīng)1 and 2，Recombinant Adenovirus rAd-N reacted with PRRSV antibody positive serum圖6 重組腺病毒rAd-N Western blotting檢測(cè)Fig.6 Western blotting detection of recombinant Adenovirus rAd-N

同一時(shí)間點(diǎn)，肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)At the same time point,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖7 小鼠抗體水平變化Fig.7 Changes in mouse antibody levels

3 討 論

PRRS自發(fā)生以來(lái)給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,其病原PRRSV的高度變異給該病的預(yù)防和診治造成了很大困難，目前依然沒(méi)有治療該病的特效藥。腺病毒表達(dá)載體可承載多種異源基因，對(duì)靜止和分裂期細(xì)胞均可感染，目前已被廣泛應(yīng)用于基因疫苗的研究，在人和動(dòng)物的腺病毒構(gòu)建和臨床應(yīng)用上均有成功的案例[19-20]。N蛋白由ORF7基因編碼，是PRRSV的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是組成病毒核衣殼的唯一組分，在病毒粒子中含量較高，具有豐富的抗原表位，免疫原性最強(qiáng)。研究表明，N蛋白質(zhì)中心區(qū)域(50-66位氨基酸)在歐洲型和美洲型毒株間高度保守[21-22]。PRRSV感染機(jī)體后，體內(nèi)最先出現(xiàn)針對(duì)N蛋白的免疫反應(yīng)且可持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)PRRSV的診斷具有非常重要的意義[23]。本研究利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建PRRSVN基因重組腺病毒表達(dá)載體，以期為PRRSV的診斷和防控提供材料。

研究者利用重組腺病毒表達(dá)GP5、GP4、GP3、M蛋白及GP3-GP5和GP3-GP4-GP5等融合蛋白，并對(duì)其作為疫苗的可行性做了研究，取得了一定的效果[24-26]，但目前國(guó)內(nèi)鮮有用重組腺病毒表達(dá)N蛋白的報(bào)道。程福亮等[27]采用表達(dá)PRRSV N蛋白作為包被抗原建立了PRRSV抗體ELISA檢測(cè)方法；楊佰啟等[22]用原核表達(dá)制備的N蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。但原核表達(dá)的N蛋白并不能保證其具有天然的活性，本研究所用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)為真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的外源蛋白與天然蛋白構(gòu)象一致，具有生物活性，可為進(jìn)一步探究N蛋白功能奠定一定的基礎(chǔ)。

本研究用PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)接種小鼠不同時(shí)期血清中的特異性抗體水平，結(jié)果表明首免后抗PRRSV抗體水平迅速升高，加強(qiáng)免疫后抗體水平升高，維持時(shí)間更長(zhǎng)，表明疫苗可引起小鼠機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，且與首免后加強(qiáng)免疫可提高免疫效果的研究結(jié)果一致。佐劑能延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的保留時(shí)間，使抗原與免疫細(xì)胞有充分的接觸時(shí)間，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生較多的中和抗體，本試驗(yàn)選用LM和Gel佐劑配合重組腺病毒rAd-N免疫小鼠，結(jié)果表明，與LM佐劑相比，Gel佐劑免疫效果稍好，但只在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)差異顯著，可能是小鼠的個(gè)體差異所致。腺病毒六鄰體蛋白是激活先天免疫的有效佐劑[28]，本試驗(yàn)中設(shè)置的無(wú)佐劑免疫組抗體水平雖比含佐劑組抗體水平稍低，這與腺病毒疫苗具有天然的佐劑效果的研究結(jié)果一致，為腺病毒疫苗免疫方式和佐劑使用提供一定的參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建重組腺病毒rAd-N，RT-PCR檢測(cè)顯示該重組腺病毒能在293A細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)PRRSV N蛋白，且Western blotting分析其具有良好的反應(yīng)原性，免疫小鼠后可引起特異性免疫反應(yīng)，該研究可為PRRSV的血清學(xué)診斷(ELISA等)提供參考依據(jù)。