羅 蘭，崔 超，董瑞蘭，劉浩域，柳小斌，于光輝

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島 266109；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,膠州 266300)

精液冷凍技術是一種常見的輔助生殖技術，可以在很長一段時間內(nèi)保護有價值的遺傳資源，建立和增強保種場間遺傳聯(lián)系和跨群聯(lián)系，提高優(yōu)良種源的利用效率[1]。隨著豬冷凍精液生產(chǎn)技術的不斷完善，采用冷凍精液繁育的種豬在受孕率和仔豬分娩數(shù)方面均得到了有效提高，已經(jīng)接近鮮精的配種水平[2]。尤其是在非洲豬瘟疫情的影響下，跨地引種風險較高，冷凍精液更是解決這一問題最有效的途徑。在豬精液冷凍過程中，抗氧化劑一直是研究熱點，這是由于精子冷凍過程會損害精子線粒體功能并刺激精子產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)[3]。過量的ROS會消耗精子的抗氧化防御系統(tǒng)，使精子進入氧化應激狀態(tài)，并產(chǎn)生大量丙二醛(MDA),將精子DNA堿基或共價氫鍵氧化為DNA單堿基，導致DNA雙鏈斷裂，細胞凋亡[4]。近年來，一些天然多酚類抗氧化物以其高抗氧化性和低毒性被廣泛運用于精液冷凍保存研究中[5]。

蘆丁是一種非黃酮類的多酚類化合物，也稱為維生素P，在柑橘類水果中大量存在，其以心臟保護[6]、抗炎[7]及抗氧化[8]等功能被運用于各類研究中。Xu等[9]研究表明，蘆丁通過增強抗氧化作用來保護公豬精子免受冷凍損傷，并且在冷凍稀釋液中添加0.4和0.6 mmol/L的蘆丁效果最佳。吳琳[10]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精子冷凍稀釋液中添加0.6 mmol/L蘆丁可以顯著改善解凍后精子運動能力，提高精子的生理功能，并且還能顯著提高總有效受精率。蘆丁作為一種有效的抗氧化劑，對哺乳動物精子的影響研究還比較少，特別是對于冷凍-解凍的精子。喻宗崗等[11]在液氮面上1 cm處(高冷凍速率)或3 cm處(低冷凍速率)冷凍雞精子，結果表明，高冷凍速率下的雞精子凍后脂質過氧化水平顯著低于低冷凍速率，但凍后精子活力和線粒體膜電位水平差異不顯著。本研究擬在豬冷凍稀釋液中添加不同濃度蘆丁后，在不同冷凍速率下進行精液超低溫保存，通過檢測解凍后精子的品質來判斷添加蘆丁及冷凍速率對豬精液冷凍的影響，以及蘆丁與不同冷凍速率的互作關系，以期為豬精液超低溫冷凍保存研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 葡萄糖、檸檬酸三鈉、檸檬酸、碳酸氫鈉、EDTA-2Na、Tris、青霉素鈉、硫酸鏈霉素等均購自國藥集團；細胞凋亡試劑盒(Annexin V-FITC/PI)、MDA、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、ATP含量等檢測試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；ROS、ATP、JC-1等檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；蘆丁、SYBR Green Ⅰ、PI染液、AO染色試劑盒、臺盼藍染液、DCFH-DA 活性氧ROS熒光探針等均購自北京索萊寶生物科技有限公司；OEP購自米尼圖公司；封口粉和0.5 mL凍精細管均購自卡蘇公司。

1.1.2 主要儀器 冷凍離心機(D-37520,Thermo)、移液槍、液氮罐、恒溫箱、光學顯微鏡(CX21,Olympus)、正置熒光顯微鏡(BX63,Olympus)、水浴鍋、pH計(FE20-K,梅特勒)、高壓滅菌鍋、冰箱、酶標儀(RZ-9618,天津瑞澤)、化學發(fā)光檢測儀(GloMax 20/20,Promega)、計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASAS-QH-Ⅲ)等。

1.2 方法

1.2.1 稀釋液配制 基礎稀釋液：稱取葡萄糖2.750 g、檸檬酸三鈉0.690 g、檸檬酸0.290 g、碳酸氫鈉0.125 g、EDTA-2Na 0.235 g、Tris 0.565 g、青霉素鈉1 000 IU/mL、硫酸鏈霉素0.100 g，用滅菌超純水定容至100 mL，調整pH為7.2，用0.22 μm濾膜過濾后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。冷凍稀釋?Ⅰ液)：乳糖溶液80%、卵黃20%；冷凍稀釋液(Ⅱ液)：95.5%的Ⅰ液、3%甘油、1.5% OEP，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 精液采集 精液采自山東省平度市環(huán)山托佩克種豬場8頭體況良好、性欲旺盛且繁殖性能好的杜洛克種公豬。采用手握法采集中段精液并用雙層紗布過濾，將過濾后的8頭種豬精液混合均勻，以消除個體差異。每周采集精液1次，經(jīng)常規(guī)檢測后活力達0.8以上，密度為2.5×1012/mL方可使用，鮮精運輸前用基礎稀釋液1∶1稀釋，于2 h內(nèi)17 ℃恒溫箱保存送回實驗室。

1.2.3 精液冷凍、解凍 采用兩步法進行精液冷凍，對照組不添加蘆丁(0 mmol/L)，試驗組在Ⅱ液中分別添加0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L蘆丁，所有組均分別進行快冷凍和快冷凍，每組3個重復。快冷凍所用泡沫細管托架高度為1 cm，慢冷凍所用泡沫細管托架高度為3 cm。將精液用蒸餾水按1∶100的比例稀釋后用血細胞計數(shù)板計數(shù)，計算精子密度。將精液與17 ℃保存過夜的基礎稀釋液按1∶1等比例混合后置于17 ℃恒溫箱平衡2 h，之后在預冷的17 ℃離心機中800×g離心10 min，棄上清。將沉淀與Ⅰ液按1∶1稀釋，并用移液槍吹打混勻，離心管用6～8層紗布包裹并放入4 ℃平衡約1.5 h，使之緩慢降溫至4 ℃。平衡結束后按1∶1加入Ⅱ液稀釋，使終濃度為5×108/mL精子，再放入4 ℃平衡30 min。平衡后的樣品需在4 ℃環(huán)境中快速用口吸法罐裝進0.5 mL細管中，再用封口粉封口。準備2個泡沫箱，倒入2/3的液氮，放入快冷凍和慢冷凍細管托架，將細管平鋪到細管托架上，保證每根細管相隔0.5 cm，使其更能充分熏蒸，蓋上蓋子熏蒸10 min后迅速將細管投入液氮內(nèi)，浸泡30 min后，按組別分別裝進拇指管內(nèi)并裝入紗布袋置于液氮罐中保存。解凍時將細管從液氮罐中取出，置于50 ℃水浴鍋中解凍10 s，解凍的精液與解凍液1∶4混勻，于37 ℃水浴孵育10 min后進行檢測。

1.3 檢測指標

1.3.1 精子運動參數(shù) 采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASAS)進行精子活力檢測，每組均需檢測精子總活力(totalmotility,TM)、直線運動百分率(progressive motility,PM)、直線速度(straight-line velocity,VSL)、曲線速度(curvilinear velocity,VCL)、平均路徑速度(average path velocity,VAP)值。將精子樣品解凍后4 ℃、600×g離心3 min，棄上清，PBS重復清洗3次，再用PBS重懸，將血細胞計數(shù)板置于37 ℃載物臺預熱，再將精液樣品緩慢注入，使之均勻流入整個計數(shù)室，每個樣品觀察5個視野，每個視野至少計數(shù)200個精子。

1.3.2 質膜完整率 采用SYBR-14/PI雙染色法檢測，將精液樣品解凍后4 ℃、600×g離心3 min，棄上清，PBS重復清洗3次，再用PBS重懸，吸取100 μL精液放入1.5 mL離心管中，加入0.2 μL SYBR-14染色液，混勻，37 ℃避光染色5～10 min，再加入1 μL PI染色液，混勻，37 ℃避光染色5～10 min，吸取10 μL著色精液于熒光顯微鏡下進行檢測，其中發(fā)紅光的為PI染色的質膜損壞的死精子，發(fā)綠光的為SYBR-14染色的質膜完整的活精子。每個樣品觀察5個視野，每個視野至少計數(shù)200個精子。

質膜完整率(%)=綠色精子數(shù)/總計數(shù)精子數(shù)×100%

1.3.3 頂體完整率 采用異硫氰酸熒光素-花生凝集素(FITC-PNA)染色法檢測，樣品前處理同1.3.2，吸取10 μL精液于載玻片上，自然風干后用甲醇固定10 min，取20 μL FITC-PNA染液滴于樣品上，覆蓋樣品，37 ℃避光染色30 min，再吸取20 μL DAPI染液滴于樣品上，覆蓋樣品，室溫染色10 min。隨后用PBS沖洗3次，自然風干后用甘油密封，蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察。其中頂體發(fā)明亮綠光的為頂體完整的精子，頂體不發(fā)光或發(fā)綠光不明亮的為頂體損壞的精子。每個樣品觀察5個視野，每個視野至少計數(shù)200個精子。

頂體完整率(%)=綠色精子數(shù)/總計數(shù)精子數(shù)×100%

1.3.4 線粒體膜電位 采用JC-1熒光探針法檢測，樣品前期處理同1.3.2，取0.1 mL JC-1工作液加入100 μL精液中，混勻，37 ℃孵育20 min，孵育后4 ℃、600×g離心3 min，棄上清，再用JC-1染色緩沖液重懸精子，隨即在熒光顯微鏡下觀察，其中頭部發(fā)綠光尾部發(fā)橙光的為高MMP活精子，頭部發(fā)紅光尾部不發(fā)光或發(fā)綠光的為低MMP死精子，頭部發(fā)紅光尾部發(fā)橙光的為高MMP死精子。每個樣品觀察5個視野，每個視野至少計數(shù)200個精子。

線粒體膜電位(%)=尾部橙色精子數(shù)/總計數(shù)精子數(shù)×100%

1.3.5 DNA完整率 采用吖啶橙熒光染色標記法檢測，樣品前期處理同1.3.2，吸取5 μL AO染液加入95 μL 精液中，避光染色10 min，加入5 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，重復清洗2次后在熒光顯微鏡下觀察，其中損傷的單鏈DNA發(fā)紅色熒光，完整的雙鏈DNA發(fā)綠色熒光。每個樣品觀察5個視野，每個視野至少計數(shù)200個精子。

DNA完整率(%)=綠色精子數(shù)/總計數(shù)精子數(shù)×100%

1.3.6 ROS水平 采用DCFH-DA熒光檢測法，精子前處理同1.3.2，離心后的精子以DCFH-DA染液重懸，37 ℃避光水浴孵育30 min后在熒光顯微鏡下觀察，其中綠色熒光強度與RDS的水平成正比，明亮綠色熒光為高水平ROS，淡綠色熒光為低水平ROS。每個樣品觀察5個視野，每個視野至少計數(shù)200個精子。

ROS水平(%)=淡綠色精子數(shù)/總計數(shù)精子數(shù)×100%

1.3.7 ATP含量 精液前期處理同1.3.2，將精液用PBS清洗重懸后用超聲波細胞破碎儀破碎精子，吸取上清液，按照ATP檢測試劑盒說明書處理，用化學發(fā)光檢測儀進行檢測，根據(jù)0.1、0.3、1.0、3.0和10 μmol/L這5個濃度梯度來繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算ATP含量。試驗設置3個重復。

1.3.8 MDA水平及抗氧化酶活性 精液前期處理同1.3.2，精液用PBS清洗重懸后用超聲波細胞破碎儀破碎精子，吸取上清液進行檢測，CAT、SOD、GSH-Px活性和MDA含量嚴格按照試劑盒說明書進行處理，隨即用酶標儀進行檢測。每組重復檢測3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件進行雙因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，結果用平均值表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 精子活力及運動參數(shù)檢測結果

由表1可知，在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁進行快冷凍后解凍，與對照組相比，0.4和0.6 mmol/L蘆丁組總活力均顯著提高(P<0.05)，所有蘆丁組直線運動百分率均顯著提高(P<0.05)，0.8和1.0 mmol/L蘆丁組直線速度均顯著提高(P<0.05)，0.6和0.8 mmol/L蘆丁組平均路徑速度均顯著提高(P<0.05)，各組曲線速度均無顯著差異(P>0.05)。在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁進行慢冷凍后解凍，與對照組相比，除1.0 mmol/L蘆丁組直線運動百分率和直線速度差異不顯著外(P>0.05)，其余各試驗組各運動參數(shù)均顯著提高(P<0.05)，其中以0.6 mmol/L蘆丁組提高最為顯著(P<0.05)?；プ鹘Y果顯示，速率×濃度互作時差異顯著(P<0.05)，相較于不同的冷凍速率而言，慢冷凍各項運動參數(shù)均高于快冷凍，而且速率與濃度之間存在互作效應，在互作條件下，最適蘆丁添加量為0.6 mmol/L。

2.2 精子質膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA完整率以及ROS水平檢測結果

由表2可知，在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁進行快冷凍后解凍，與對照組相比，0.6和0.8 mmol/L蘆丁組頂體完整率、線粒體膜電位和DNA完整率均顯著提高(P<0.05)，0.6 mmol/L蘆丁組ROS水平顯著降低(P<0.05)，0.8 mmol/L ROS水平顯著提高(P<0.05)，0.2和0.4 mmol/L蘆丁組線粒體膜電位和DNA完整率也顯著提高(P<0.05)。在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁進行慢冷凍后解凍，與對照組相比，0.6、0.8和1.0 mmol/L蘆丁組質膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位和DNA完整率均顯著提高(P<0.05)，ROS水平均顯著降低(P<0.05)，0.4 mmol/L蘆丁組質膜完整率、頂體完整率和線粒體膜電位均顯著提高(P<0.05)，0.2 mmol/L蘆丁組質膜完整率和線粒體膜電位均顯著提高(P<0.05)。 互作分析顯示，速率×濃度互作時差異顯著(P<0.05)，且在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁慢冷凍組各項指標均顯著好于快冷凍，且0.6 mmol/L蘆丁效果最顯著。

表1 各組精子活力及運動參數(shù)

表2 各組精子質膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA完整率以及ROS水平

續(xù)表

2.3 精子ATP、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性的檢測結果

由表3可知，在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁快冷凍后解凍，與對照組相比，0.6 mmol/L蘆丁組ATP含量、CAT和GSH-Px活性均顯著提高(P<0.05)，0.8 mmol/L蘆丁組ATP含量和CAT活性均顯著提高(P<0.05)，0.2和0.4 mmol/L蘆丁組CAT和GSH-Px活性均顯著提高(P<0.05)，各組MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁進行慢冷凍后解凍，與對照組相比，0.4和0.6 mmol/L蘆丁組ATP含量、SOD和GSH-Px活性均顯著提高(P<0.05)，MDA含量顯著下降(P<0.05)；0.8 mmol/L蘆丁組SOD和GSH-Px活性均顯著提高(P<0.05)，MDA含量顯著下降(P<0.05)；1.0 mmol/L蘆丁組CAT和GSH-Px活性均顯著提高(P<0.05)?；プ鹘Y果顯示，速率×濃度互作時差異顯著(P<0.05)，且在冷凍稀釋液中添加不同濃度的蘆丁慢冷凍組各項指標均顯著好于快冷凍，互作條件下，最適蘆丁添加量為0.6 mmol/L。

表3 各組精子ATP、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性

續(xù)表

3 討 論

3.1 冷凍速率對冷凍保存豬精子質量的影響

冷凍精液制作過程中，冷凍速率至關重要，需要快速通過-80～0 ℃這一階段，從而提高精子的存活率，不同物種對冷休克的敏感性決定精子所能承受的最大冷卻速率，一般哺乳動物精子的冷凍速率約為0.25 ℃/min[12-13]，而豬精子的最佳冷凍速率為0.1 ℃/min[14]，過快或過慢都會造成精子存活率降低。梁鴻斌等[15]比較了3種(-100 ℃、10 min，-120 ℃、10 min，-140 ℃、10 min)不同冷凍速率,發(fā)現(xiàn)-120 ℃熏蒸10 min效果最好，本試驗中距液氮面3 cm能更好地保護豬冷凍精液，獲得較低的脂質過氧化水平，與其研究結果一致。喻宗崗等[11]研究表明，不同冷凍速率通過胞內(nèi)外化學勢能平衡決定形成的冰晶大小，進而控制對精子的損傷程度。有證據(jù)表明，精子冷凍后的存活率與冷凍速率表現(xiàn)出特征性的倒U形曲線，正是這種非線性特征提高了精子冷凍-解凍后的存活率[16]，然而在通常情況下冷凍速率是通過將樣品懸浮在液氮上方并固定熏蒸高度，在這種情況下冷卻速率會受到精液包裝和表面積大小的影響，因此對冷凍速率精確度的控制還需進一步改進。本研究發(fā)現(xiàn)，距液氮面3 cm冷凍效果好于距液氮面1 cm，這可能是由于精液在冷凍過程中需要一個溫度梯度，距液氮面1 cm溫度與進入液氮之前的溫度相差太大，導致精子在快速冷凍過程中細胞破裂而降低精子活率。

3.2 蘆丁對冷凍保存豬精子活力及運動參數(shù)的影響

冷凍精液的解凍后活力和運動參數(shù)是檢測精子質量的重要指標。有研究表明，精子運動能力差會導致不孕癥[17]，直接影響人工授精效果。 Xu等[9]研究表明，在豬冷凍稀釋液中添加0.4和0.6 mmol/L的蘆丁冷凍后解凍，精子的運動參數(shù)(VCL、VSL)均顯著提高。本研究結果顯示，在冷凍稀釋液中添加蘆丁，能有效提高冷凍后解凍精子的活力與各項運動參數(shù)，而且距離液氮面3 cm的慢冷凍比1 cm的快冷凍效果好，且蘆丁的最佳添加量為0.6 mmol/L，研究結果與Xu等[9]結果一致，說明添加蘆丁能夠提高冷凍-解凍精子的質量。

3.3 蘆丁對冷凍保存豬精子質膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA完整率以及ROS水平的影響

精子超低溫保存過程中需要保護細胞內(nèi)結構和生物分子，特別是在冷凍精子的解凍過程中對ROS和脂質過氧化具有高度敏感性[18]，ROS可直接作用于精子DNA的胞嘧啶[19]，也可作用于DNA上的鳥嘌呤形成DNA氧化損傷的標志產(chǎn)物(8-羥脫氧鳥苷(8-OHd G))，并引起DNA鏈斷裂[20]。ROS可直接損傷線粒體DNA，且與線粒體膜中豐富的PUFA(polyunsaturated fatty acid)發(fā)生LPO(lipid hydroperoxide)反應，從而引起線粒體損傷。精子質膜中的二十六碳六烯酸(DHA)在精子形成和膜流動性中起重要作用，并極易與ROS發(fā)生LPO反應，造成精子的氧化損傷，進而導致質膜完整性破壞、膜流動性和通透性降低等[21]。有研究表明，在馬鹿[22]和公羊[23]精液中添加1 mmol/L蘆丁保存于37 ℃條件下有助于提高精液質量，并推斷將蘆丁用作低溫保存精液更能激發(fā)其保護精子的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能提高血清/葡萄糖剝奪(SGD)條件下PC12細胞的活力，減少ROS和脂質過氧化的產(chǎn)生，可通過降低促凋亡蛋白(Bax、Caspase-3、Caspase-9)水平和提高抗凋亡蛋白Bcl-2水平，減輕DNA損傷，抑制細胞凋亡[24]。本研究結果表明，添加0.6 mmol/L的蘆丁顯著提高了精子質膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA完整率，同時也顯著降低了ROS水平，有效減少了精子冷凍-解凍過程中的氧化應激，提高了解凍后精液的品質。與本研究結果類似，有研究還發(fā)現(xiàn)蘆丁可通過其高效的抗氧化能力提高小鼠的線粒體功能[7，25]。然而，本研究中高濃度的蘆丁并沒有進一步提高解凍后精液的質量，這可能是由于高濃度的蘆丁引發(fā)了新的脂質過氧化反應，從而導致精液質量下降。

3.4 蘆丁對冷凍保存豬精子ATP、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性的影響

線粒體是真核細胞中能量的主要來源，通過氧化磷酸化與檸檬酸循環(huán)產(chǎn)生ATP，而ATP含量是決定精子獲能的重要因素。線粒體是產(chǎn)能單位，線粒體的氧化損傷會導致胞內(nèi)ATP含量快速減少，精子形態(tài)缺陷增加，活力降低。同時，精子中ROS水平升高會引起精子線粒體膜電位的改變[26]。有研究表明，蘆丁通過調節(jié)氧化應激和改善細胞凋亡對大鼠肝臟和腎臟起保護作用[27-28]。槲皮素作為蘆丁水解后的產(chǎn)物，在冷凍稀釋液中添加0.25 mmol/L槲皮素可提高冷凍-解凍后精子的運動性和活力，同時降低脂質過氧化水平[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然大部分蘆丁添加組ATP含量有所升高，ROS和MDA有所降低，但差別不大，這可能是由于精子冷凍后導致線粒體受損，而受損的線粒體減少了ATP的產(chǎn)生，也可能是因為受損的精子在死亡過程中釋放了大量ROS，導致精液中MDA含量升高，發(fā)生氧化損傷引起精子細胞凋亡，從而影響了解凍后精液的品質。Khan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，通過在大鼠精液中添加蘆丁，有助于提高抗氧化酶活性，并且改善了脂質過氧化產(chǎn)生的損傷。另有研究表明，飼糧中添加1.5 g/kg蘆丁可提高SOD和CAT的活性，并且降低MDA含量，從而保護銀魚肝臟免受氧化應激和凋亡的影響[31]。本研究結果表明，在冷凍稀釋液中添加0.6～0.8 mmol/L蘆丁降低了ROS和MDA的產(chǎn)生，增加了解凍后精子SOD、CAT、GSH-Px的活性，與上述研究一致。因此，添加蘆丁可以提高冷凍過程中精子的ATP含量，改善保存過程中豬精子的抗氧化能力，減少自由基的損害。

4 結 論

不同蘆丁濃度與不同冷凍速率間存在互作效應，其中在精液冷凍稀釋液中添加0.6 mmol/L蘆丁距液氮面3 cm的冷凍速率冷凍-解凍后精子質量最好。