趙明明，李星穎，江文康，樊全寶，賴健儀，何 詩，何 靜，白銀山，劉璨穎，陳勝鋒，陳志勝，張 暉，王丙云

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528231)

貓血清白蛋白(feline serum albumin,FSA)是血清中含量最高、功能較多的一種蛋白質(zhì)，在臨床上主要用于治療貓失血或燒傷引起的休克、低白蛋白血癥、肝硬化及腎病引起的水腫等疾病。目前臨床上所用的血清白蛋白制劑大多是從血液中提取[1-2]。但貓血清的供應(yīng)不足、復(fù)雜的血清來源及病毒經(jīng)血液傳播的風(fēng)險都嚴(yán)重限制了FSA的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，尋找一種新的FSA生產(chǎn)方法尤為重要。在過去的幾十年里，關(guān)于白蛋白的表達(dá)研究已涉及到大腸桿菌、酵母、動物和植物等表達(dá)系統(tǒng)[3]。人血清白蛋白的表達(dá)最早可追溯到1981年，Lawn等[4]首次將人血清白蛋白在大腸桿菌內(nèi)成功表達(dá)。1996年，Hilger等[5]通過提取貓肝臟總RNA，經(jīng)RT-PCR測定了編碼FSA基因的完整核苷酸序列。之后，Reininger等[6]將重組貓白蛋白在大腸桿菌中表達(dá)為帶有His標(biāo)簽的蛋白。除此之外，在真核表達(dá)系統(tǒng)方面，陳林濤等[7]于2018年成功構(gòu)建重組人血清白蛋白植物表達(dá)載體。王晶宇等[8]成功在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)出犬白蛋白-干擾素α2融合蛋白。目前，血清白蛋白的表達(dá)研究以人血清白蛋白為主，而類似于犬、貓等小動物的研究較少，且市場上流通的多為人和牛的血清白蛋白，在寵物臨床上，有時會使用人血清白蛋白來治療重癥狗和貓，但這種治療非常昂貴，且會發(fā)生過敏反應(yīng)[9]，存在較大爭議。為進(jìn)一步探索FSA的生產(chǎn)方法，本研究將優(yōu)化后的FSA堿基序列通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株中，并通過Western blotting驗證其表達(dá)情況，旨在構(gòu)建FSA表達(dá)系統(tǒng)，為FSA的進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 畢赤酵母GS115購自Thermo公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；重組質(zhì)粒FSA-pPIC9K由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；空白質(zhì)粒pPIC9K購自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒提取試劑盒購自上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司；Q5高保真聚合酶購自New England Biolabs公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ及核酸共沉劑均購自寶生物工程(大連)有限公司；Anti-Cat Albumin Antibody和Donkey Anti-Goat IgG H&L均購自Abcam公司；G418購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。PCR儀購自Thermofisher公司；Gene Pulser Xcell電穿孔儀和快速半干轉(zhuǎn)印儀均購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 在GenBank查找并獲取了FSA基因序列(登錄號：NM_001009961)，全長1 827 bp，根據(jù)FSA氨基酸序列及畢赤酵母密碼子的偏愛性優(yōu)化密碼子，交付南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行化學(xué)合成并通過酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ插入載體pPIC9K上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為FSA-pPIC9K。取2 μL FSA-pPIC9K重組質(zhì)粒與大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，靜置后于45 ℃水浴中熱激45 s，冰盒中靜置，接種于不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床復(fù)蘇1 h，之后涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR與雙酶切驗證。

根據(jù)優(yōu)化后FSA的堿基序列設(shè)計1對引物,引物序列為：FSA-F：5′-CGGAATTCATGAAATG-GGTTACTTTCATTAGCTT-3′；FSA-R：5′-TAA-AGCGGCCGCTCACGCCAAAGCTGCTT-3′，下劃線部分分別為EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。為保證擴(kuò)增的保真性，本試驗采用Q5高保真聚合酶進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25 μL：Q5 Buffer(5×) 5 μL,dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，DNA模板5 μL，Q5高保真聚合酶(2 000 U/mL) 1 μL，加dH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性5 s，68 ℃退火10 s，72 ℃延伸35 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對提取的質(zhì)粒FSA-pPIC9K進(jìn)行雙酶切，用空質(zhì)粒pPIC9K作為對照，37 ℃酶切4 h，將2種酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 將驗證正確的重組質(zhì)粒FSA-pPIC9K經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalⅠ進(jìn)行酶切，線性化質(zhì)粒，并用乙醇沉淀法進(jìn)行回收。取10 μL的線性化質(zhì)粒與80 μL畢赤酵母感受態(tài)GS115混合均勻，轉(zhuǎn)入提前冰浴的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min，在1.5 kV、25 μF、200 Ω的電轉(zhuǎn)條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。電擊結(jié)束后，迅速加入1 mL冰冷的山梨醇(1 mol/L)，并轉(zhuǎn)移到一個干凈的無菌EP管內(nèi)，28 ℃靜置孵育2 h。將孵育完畢的菌體均勻涂布于MD平板上,于28 ℃培養(yǎng)約2～3 d后，觀察平板上轉(zhuǎn)化子的生長狀況。將經(jīng)MD平板篩選出的陽性菌落用無菌水洗下，分別涂布到不同濃度(1、2、3和5 mg/mL)梯度的G418-YPD平板上篩選高表達(dá)株，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取經(jīng)過G418篩選出的單菌落于150 μL無菌水中稀釋并作為菌落PCR模板，采用通用引物5′-AOX1：5′-GACTGGTTCC-AATTGACAAGC-3′和3′-AOX1：5′-GCAAATG-GCATTCTGACATCC-3′，同時用未經(jīng)轉(zhuǎn)化的畢赤酵母作為對照，進(jìn)行菌落PCR。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將經(jīng)驗證有目的基因的菌落與1個轉(zhuǎn)化pPIC9K空載體的菌落分別轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、230 r/min培養(yǎng)24 h；將YPD培養(yǎng)物以1∶1 000轉(zhuǎn)接于BMGY液體培養(yǎng)基，28 ℃、230 r/min培養(yǎng)18 h；更換BMMY液體培養(yǎng)基，繼續(xù)在28 ℃、230 r/min條件下培養(yǎng)；每隔24 h加入0.5%體積分?jǐn)?shù)的純甲醇以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)96 h后停止，取表達(dá)上清，通過Western blotting進(jìn)行蛋白檢測。

1.2.4 基本誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 具體方法同1.2.3，選取能成功表達(dá)FSA的菌株進(jìn)行條件優(yōu)化，將誘導(dǎo)溫度分別調(diào)整為24、26、28和30 ℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0(每隔12 h調(diào)節(jié)一次pH),誘導(dǎo)甲醇添加量第1組每隔24 h加入0.5%的純甲醇，其余4組分別每12 h添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的純甲醇以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，每組條件做3個平行試驗。

1.2.5 Western blotting檢測重組FSA蛋白的表達(dá) 收集表達(dá)上清液進(jìn)行SDS-PAGE，通過半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并用5%脫脂奶粉封閉2 h，用Anti-Cat Albumin Antibody抗體4 ℃孵育過夜，之后用TBST溶液洗滌4次，每次10 min；用Donkey Anti-Goat IgG H&L抗體室溫孵育1 h，用TBST溶液洗滌4次，每次10 min，顯影查看結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒FSA-pPIC9K的鑒定

以提取的質(zhì)粒FSA-pPIC9K作為模板，經(jīng)特異性引物FSA-F和FSA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在約1 827 bp處有一明顯的條帶(圖1)，且與FSA基因大小相符。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對提取的質(zhì)粒FSA-pPIC9K進(jìn)行酶切驗證，同時用空質(zhì)粒pPIC9K作為對照，由圖2可知，重組質(zhì)粒FSA-pPIC9K在約1 827 bp處有一明顯的條帶，且與FSA基因大小相符，而空質(zhì)粒pPIC9K在相應(yīng)位置并無對應(yīng)條帶。測序結(jié)果表明，所克隆的FSA序列的堿基數(shù)為1 827 bp，編碼608個氨基酸,與優(yōu)化后的堿基序列進(jìn)行比對未發(fā)現(xiàn)不同堿基，相似性高達(dá)100%。

2.2 G418篩選陽性菌株

由圖3可知，隨著G418濃度的增加，菌落數(shù)量不斷地減少，當(dāng)G418濃度為5 mg/mL時，菌落數(shù)量清晰可見(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker；1～3，重組質(zhì)粒FSA-pPIC9KM，DL2000 DNA Marker;1-3，Recombinant plasmid FSA-pPIC9K圖1 重組質(zhì)粒FSA-pPIC9K的PCR驗證Fig.1 PCR verification of recombinant plasmid FSA-pPIC9K

M，DL10000 DNA Marker；1，空質(zhì)粒pPIC9K;2，重組質(zhì)粒FSA-pPIC9KM，DL10000 DNA Marker;1，Empty plasmid pPIC9K;2，Recombinant plasmid FSA-pPIC9K圖2 重組質(zhì)粒FSA-pPIC9K的酶切驗證Fig.2 Enzyme digestion verification of recombinant plasmid FSA-pPIC9K

A～D,G418濃度分別為1、2、3和5 mg/mLA-D,G418 concentrations were 1，2，3 and 5 mg/mL,respectively圖3 G418篩選高表達(dá)菌株Fig.3 Screening of highly expressed strains by G418

2.3 菌落PCR鑒定陽性菌株

菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖4可知，轉(zhuǎn)化子菌落獲得2條大小分別約為2.3和2.2 kb的目的基因條帶和畢赤酵母AOX1基因擴(kuò)增條帶，對照組僅在2.2 kb左右有一明顯的條帶，表明重組質(zhì)粒FSA-pPIC9K已整合到畢赤酵母的基因組中。

M，DL5000 DNA Marker;1～4,轉(zhuǎn)化子菌落;5,畢赤酵母GS115菌落M，DL5000 DNA Marker;1-4,Transforming sub-colonies;5,Pichia pastoris GS115 colony圖4 菌落PCR鑒定陽性菌株Fig.4 Identification of positive strains by colony PCR

2.4 重組FSA蛋白表達(dá)的檢測

將表達(dá)上清進(jìn)行Western blotting檢測，同時以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPIC9K菌株的表達(dá)上清作為陰性對照，由圖5可知，前4個樣品在約70 ku處有明顯的特異性條帶，第5個樣品由于表達(dá)量太低而條帶不明顯，陰性對照未出現(xiàn)特異性條帶，表明FSA已經(jīng)在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5，轉(zhuǎn)化FSA-pPIC9K的表達(dá)上清；6，轉(zhuǎn)化pPIC9K的表達(dá)上清M,Protein Marker;1-5,Expression supernatant transformed FSA-pPIC9K;6,Expression supernatant transformed pPIC9K圖5 重組FSA蛋白的Western blotting檢測Fig.5 Western blotting detection of recombinant FSA protein

2.5 不同條件下FSA表達(dá)的檢測

將不同條件下的表達(dá)上清進(jìn)行Western blotting檢測，由圖6可知，隨著誘導(dǎo)表達(dá)的溫度、pH增高及甲醇添加量的增多，F(xiàn)SA的表達(dá)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，即當(dāng)溫度為28 ℃、pH為6.0、每12 h添加0.5%純甲醇的條件下，F(xiàn)SA的表達(dá)量較高。

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A1、B1和C1，F(xiàn)SA陽性對照；A2～A5，依次為24、26、28和30 ℃；B2～B6，pH依次為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0；C2～C6，依次為每隔24 h加入0.5%的純甲醇、每12 h添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的純甲醇M,Protein Marker;A1,B1 and C1,FSA positive control,A2-A5,24,26,28 and 30 ℃,respectively;B2-B6,The pH was 4.0,5.0,6.0,7.0 and 8.0,respectively;C2-C6,0.5% pure methanol every 24 h,0.5%,1.0%,1.5% and 2.0% pure methanol every 12 h,respectively圖6 不同溫度(A)、pH(B)和甲醇添加量(C)條件下FSA表達(dá)的Western blotting檢測Fig.6 Western blotting detection of FSA expression at different temperatures (A),pH (B) and methanol addition (C)

3 討 論

FSA是由608個氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì)，具有約17個二硫鍵和3個螺旋結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，每個域被分為2個子域A和B，其中亞結(jié)構(gòu)域ⅡA和ⅢA被鑒定為藥物結(jié)合位點(diǎn)，命名為Sudlow位點(diǎn)Ⅰ和Ⅱ[10]。如此復(fù)雜的蛋白結(jié)構(gòu)在原核表達(dá)系統(tǒng)中易導(dǎo)致蛋白的錯誤折疊及產(chǎn)生無活性的包涵體[6,11]。因此，本研究采用畢赤酵母GS115作為FSA的表達(dá)宿主，畢赤酵母的蛋白質(zhì)表達(dá)機(jī)制與哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制非常接近，同時又具有生長迅速，操作簡便等優(yōu)勢，克服了哺乳動物細(xì)胞生長緩慢及培養(yǎng)成本高等問題[12]。畢赤酵母具有密碼子偏愛性[13],A+T含量較高的區(qū)域可能含有轉(zhuǎn)錄提前終止信號，如共有序列ATTATTTTATAAA，易導(dǎo)致目的基因轉(zhuǎn)錄中斷[14]。Yang等[15]經(jīng)過畢赤酵母偏好的密碼子優(yōu)化過后，蛋白表達(dá)水平增加了約10倍。因此，依據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，本研究將目的基因的密碼子替換為畢赤酵母高頻使用的密碼子，并優(yōu)化序列的GC含量，去除富AT區(qū)，將GC含量由最初的45.98%提高為48.11%,理論上可提高目的基因在畢赤酵母中的轉(zhuǎn)錄水平，以此提高蛋白的表達(dá)量。

有研究指出，由于外源蛋白的基因和G418抗性基因的串聯(lián)整合，那些對高濃度G418有抗性的菌株會含有更高的拷貝數(shù)[16]，而畢赤酵母可通過增加拷貝數(shù)來提高蛋白表達(dá)水平，這是由轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高所致[17]。魏東升等[18]通過G418篩選高表達(dá)株將蛋白表達(dá)量提高了8.2倍，進(jìn)一步驗證了以上說法的正確性。本試驗通過電擊轉(zhuǎn)化的方法成功將FSA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115菌株中，并將其涂布到不同濃度梯度的G418平板中，最終獲得了可以抗高濃度G418(5 mg/mL)的轉(zhuǎn)化子，但這些轉(zhuǎn)化子中目的基因的拷貝數(shù)需進(jìn)一步試驗研究，如本研究中的第5個樣品經(jīng)Western blotting驗證時發(fā)現(xiàn)其特異性條帶很不明顯，可能是該轉(zhuǎn)化子中目的基因的拷貝數(shù)少而導(dǎo)致表達(dá)量低。影響畢赤酵母表達(dá)蛋白的因素多種多樣，畢赤酵母最佳的生長溫度為28～30 ℃，但總體來說，低溫環(huán)境更有利于蛋白折疊，且可降低蛋白酶的活性進(jìn)一步提高蛋白產(chǎn)量[19]，不同蛋白酶的最適pH不同，通過選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)pH能有效降低蛋白酶活性[20]，減少目的蛋白降解，同時pH對細(xì)胞活性也有較大的影響。在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，甲醇既是誘導(dǎo)劑又可作為唯一的碳源被細(xì)胞利用，但高濃度的甲醇已造成累積，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[21]，因此，本研究針對誘導(dǎo)表達(dá)的溫度、pH及甲醇添加量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在28 ℃、pH為6.0且每12 h添加0.5%的甲醇條件下FSA表達(dá)量較高。

畢赤酵母表達(dá)的蛋白主要以糖基化形式存在，主要包括N-糖基化和O-糖基化，其中N-糖基化較多見，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含有序列Asn-Xaa-Thr/Ser(Xaa表示任意氨基酸)時,畢赤酵母可對Asn殘基上的酰胺氮進(jìn)行N-糖基化修飾[22]。本研究將表達(dá)的上清液進(jìn)行Western blotting驗證，在70 ku左右發(fā)現(xiàn)特異性條帶，比理論上分子質(zhì)量66 ku的FSA偏大，這可能是在表達(dá)過程中FSA過度糖基化造成的，而過度的糖基化會影響蛋白的合成與分泌，因此需進(jìn)一步研究去避免過度糖基化的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本試驗在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)出FSA，在誘導(dǎo)表達(dá)溫度為28 ℃，pH為6.0且每12 h添加0.5%的甲醇條件下FSA表達(dá)量較高。