韋云芳，李飛翔，星 云，黃慶國，李居?xùn)|，萬九生，陳方良

(1.公安部昆明警犬基地，昆明 650204；2.警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650204；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

作為國內(nèi)獨(dú)一無二的國產(chǎn)警用工作犬品種，昆明犬于2007年被審定為犬類國家級畜禽新品種，編入《中國畜禽遺傳資源名錄》和《世界糧食與農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳資源狀況》。昆明犬屬于中國七大警用工作犬品種之一，已廣泛配發(fā)到國內(nèi)33個(gè)省級行政區(qū)的警犬使用部門及一線實(shí)戰(zhàn)單位，在治安防范、消防搜救、護(hù)衛(wèi)搜捕、安保維穩(wěn)及反恐處突等重要任務(wù)中發(fā)揮其獨(dú)特作用[1]。目前昆明犬已出口到朝鮮、新加坡、巴基斯坦、越南、柬埔寨等10多個(gè)國家，在世界工作犬領(lǐng)域占有一席之地。作為中國寶貴的犬業(yè)種質(zhì)資源，研究參與調(diào)控昆明犬生長發(fā)育的基因，深入闡明昆明犬生長發(fā)育規(guī)律，進(jìn)而應(yīng)用分子育種技術(shù)進(jìn)一步提高其生長發(fā)育性能具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

胰島素樣生長因子(insuline-like growth factors，IGFs)因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與胰島素原類似而得名，是一類多肽因子，對動(dòng)物生長發(fā)育、繁殖、營養(yǎng)代謝及組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡均有重要調(diào)控作用[2-3]。IGF2作為IGFs家族中重要成員之一，又被稱為生長調(diào)節(jié)素A(somatomedin A)，廣泛參與組織細(xì)胞的增殖分化、機(jī)體肌肉發(fā)育和體脂沉積及腫瘤細(xì)胞增殖等眾多生理過程[4-5]。分析IGF2基因結(jié)構(gòu)功能并闡明其表達(dá)規(guī)律，在畜牧生產(chǎn)中具有重要意義。目前，IGF2作為農(nóng)業(yè)動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因，在多種農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)類動(dòng)物中已有較多研究。眾多研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因遺傳變異與豬[6-8]、牛[9-11]、禽類[12-13]及經(jīng)濟(jì)型魚類[14]和鱉類[15]等動(dòng)物的生長發(fā)育存在顯著相關(guān)關(guān)系，并鑒定出了一些顯著影響目標(biāo)性狀的分子標(biāo)記，這些研究為在昆明犬上開展該基因的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

在工作犬領(lǐng)域，體型大小是工作犬篩選中最重要的性狀指標(biāo)之一。了解昆明犬體型等生長發(fā)育性狀的遺傳因素，可為研究人員提供一個(gè)改進(jìn)動(dòng)物體型和生長發(fā)育性狀的途徑[16]。警犬繁育中，2.5月齡的仔犬是考察和挑選的關(guān)鍵期，其體高、體長及體重的增長速度十分迅速，體型大小出現(xiàn)明顯差異，對調(diào)控其此時(shí)期生長發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行研究具有十分重要的意義?；贗GF2基因在生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮的重要作用，本研究首先克隆昆明犬IGF2基因CDS編碼區(qū)，并利用生物信息學(xué)方法分析其序列結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系及編碼蛋白的功能，同時(shí)在mRNA水平上探究IGF2基因在2.5月齡犬各組織和昆明犬不同生長時(shí)期肝臟中的表達(dá)水平，以期為今后深入研究IGF2基因調(diào)控昆明犬生長發(fā)育過程的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

供試的昆明犬均源自公安部昆明警犬基地，隨機(jī)選取仔犬期(2.5月齡)、幼犬期(6月齡)、青年期(1歲)、成年期(1.7和2.5歲)正常飼養(yǎng)的昆明犬各3頭，麻醉后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織樣品，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

TRIzol RNA分離試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自Vazyme公司；2×PCR Buffer、dNTP Mixture、Taq酶等PCR相關(guān)試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；膠回收純化試劑盒、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自寶生物工程(大連)有限公司。冷凍離心機(jī)(5430R)購自Eppendorf公司；電泳儀(DYY-6B)購自北京六一儀器廠；超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)購自Thermo Scientific公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Prism 7300)購自ABI公司；梯度PCR儀(T100)及凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR+)均購自Bio-Rad公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI上公布的家犬(Canislupusfamiliaris)IGF2基因mRNA序列(登錄號：XM_005631053.3)設(shè)計(jì)CDS序列擴(kuò)增引物和實(shí)時(shí)熒光定量引物，以GAPDH(登錄號：NM_001003142.2)為內(nèi)參基因，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 昆明犬IGF2基因CDS區(qū)擴(kuò)增與克隆測序

按照TRIzol法提取2.5月齡昆明犬肝臟組織樣品總RNA，通過超微量分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以昆明犬肝臟組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25 μL：PCR Buffer(2×)12.5 μL，dNTP混合物(10 mmol/L)0.2 μL，cDNA(100 ng/μL)1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后按膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收，并按pMD18-T克隆載體試劑盒說明書進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取白色陽性單克隆菌落至LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)(37 ℃)，最后進(jìn)行菌液PCR鑒定，選擇PCR鑒定正確的陽性單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5 昆明犬IGF2基因生物信息學(xué)分析

利用DNAStar軟件將克隆序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家犬(Canislupusfamiliaris，登錄號：XM_005631053.3)、赤狐(Vulpesvulpes，登錄號：XM_026004185.1)、貓(Feliscatus，登錄號：XM_023240193.1)、豬(Susscrofa，登錄號：NM_213883.2)、馬(Equuscaballus，登錄號：NM_001114539.2)、牛(Bostaurus，登錄號：NM_174087.3)、羊(Ovisaries，登錄號：NM_001009311.1)及雞(Gallusgallus，登錄號：NM_001030342.2)的IGF2基因核苷酸序列進(jìn)行相似性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。IGF2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征分析等參照韋云芳等[16]方法進(jìn)行。

1.6 昆明犬IGF2基因組織表達(dá)檢測

按照TRIzol法提取2.5月齡昆明犬心臟、脾臟、肺臟、腎臟及大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織及6月齡和1、1.7、2.5歲肝臟組織樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測IGF2基因在2.5月齡昆明犬組織中及各年齡段昆明犬肝臟中表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，2×Real-time PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.4 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)；同時(shí)以熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，程序?yàn)?5 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品檢測3次，取其平均值。以GAPDH為內(nèi)參基因,對昆明犬不同組織和不同年齡段肝臟中的表達(dá)水平進(jìn)行定量結(jié)果分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算IGF2基因的相對表達(dá)量，利用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 昆明犬IGF2基因克隆及測序

以昆明犬肝臟組織cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得IGF2基因CDS編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)單一目的條帶，片段大小約717 bp，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。測序后分析得到昆明犬IGF2基因片段長度為717 bp，編碼238個(gè)氨基酸，與PCR結(jié)果一致。

2.2 昆明犬IGF2基因相似性比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將昆明犬IGF2基因序列與其他物種序列進(jìn)行相似性比對，結(jié)果顯示，昆明犬與家犬、赤狐、貓、豬、馬、牛、羊及雞的相似性分別為100%、100%、94.1%、93.2%、89.6%、88.7%、88.3%及66.3%(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，昆明犬與家犬屬于同一分支，與同為犬科動(dòng)物的赤狐進(jìn)化關(guān)系最近，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹直觀地展示了不同物種之間IGF2基因進(jìn)化的差異，與序列相似性比對結(jié)果一致(圖3)。

M，DL10000 DNA Marker；1～2，昆明犬IGF2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M,DL10000 DNA Marker;1-2,PCR amplification products of IGF2 gene in Kunming dogs圖1 昆明犬IGF2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of IGF2 gene in Kunming dogs

圖2 不同物種IGF2基因核苷酸序列相似性比對Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of IGF2 gene in different species

圖3 不同物種IGF2基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogentic tree of nucleotide sequence of IGF2 gene in different species

2.3 昆明犬IGF2蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析

2.3.1 理化性質(zhì)及親/疏水性分析 保守結(jié)構(gòu)域分析表明，IGF2屬于ILGF-like superfamily和IGF2-C superfamily超家族成員之一(圖4)。ExPASy-ProtParam在線工具分析顯示，IGF2蛋白分子質(zhì)量為26.46 ku，等電點(diǎn)為9.61，屬堿性蛋白，半衰期為30 h；不穩(wěn)定系數(shù)為63.63，屬不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)78.70，總平均親水性為-0.241，屬親水性蛋白。IGF2蛋白共由22種氨基酸組成(表2)，其中占比最高的是精氨酸(Arg，10.9%)，最少的是天冬酰胺(Asn)和色氨酸(Trp)，均為0.8%；帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)有22個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)有33個(gè)，推測IGF2蛋白可能帶正電，肽鏈N-端為甲硫氨酸(Met)。昆明犬IGF2蛋白親/疏水性分析結(jié)果表明，在第70位氨基酸處存在疏水最大值3.011，在第210位氨基酸處存在疏水最小值-2.344(圖5)，氨基酸序列親水性殘基數(shù)大于疏水性殘基，整體表現(xiàn)為親水性，屬親水性蛋白，這與平均親水性指數(shù)相吻合。

圖4 昆明犬IGF2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Conserved domain prediction of IGF2 protein in Kunming dogs

表2 昆明犬IGF2蛋白氨基酸組成

圖5 昆明犬IGF2蛋白的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of IGF2 protein in Kunming dogs

2.3.2 信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位 通過SignalP 4.0在線軟件分析表明，昆明犬IGF2蛋白不存在信號肽剪切位點(diǎn)(圖6)，屬非分泌型蛋白。通過TMHMM 2.0在線軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，昆明犬IGF2蛋白不存在跨膜域，屬非跨膜蛋白。使用PSORT Ⅱ在線軟件預(yù)測昆明犬IGF2蛋白亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，IGF2蛋白廣泛分布于細(xì)胞核(47.8%)、線粒體(17.4%)、細(xì)胞質(zhì)(13%)、質(zhì)膜(8.7%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(4.3%)、細(xì)胞外(4.3%)及囊泡分泌系統(tǒng)(4.3%)。

圖6 昆明犬IGF2蛋白信號肽預(yù)測Fig.6 Signal peptide prediction of IGF2 protein in Kunming dogs

2.3.3 蛋白磷酸化位點(diǎn) 運(yùn)用NetPhos 3.1在線軟件分析蛋白磷酸化位點(diǎn)顯示，昆明犬IGF2蛋白存在23個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸(S)14個(gè)、蘇氨酸(T)9個(gè)，不存在酪氨酸(Y)磷酸化位點(diǎn)，上述23個(gè)位點(diǎn)可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(圖7)。

2.3.4 二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SOPMA預(yù)測昆明犬IGF2蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)IGF2蛋白結(jié)構(gòu)以α-螺旋(32.77%)和無規(guī)則卷曲(47.48%)為主，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占11.76%和7.98%(圖8)；使用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測該蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，昆明犬IGF2蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲(圖9)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

2.4 昆明犬IGF2基因組織表達(dá)譜

由圖10可知，IGF2基因在昆明犬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉中均有表達(dá)，在肝臟和脾臟中的表達(dá)極顯著高于其他組織(P<0.01)；在肺臟、腎臟和肌肉中的表達(dá)量顯著高于心臟中的表達(dá)量(P<0.05)。

圖7 昆明犬IGF2蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.7 Phosphorylation site prediction of IGF2 protein in Kunming dogs

線條由長到短分別代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲Lines from long to short represent alpha helix,extended chain,beta turn and random coil,respectively圖8 昆明犬IGF2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Secondary structure prediction of IGF2 protein in Kunming dogs

圖9 昆明犬IGF2蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Tertiary structure prediction of IGF2 protein in Kunming dogs

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01); While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below圖10 IGF2基因在昆明犬不同組織中的表達(dá)Fig.10 Expression of IGF2 gene in different tissues of Kunming dogs

2.5 IGF2基因在昆明犬不同生長階段肝臟中的表達(dá)

對昆明犬仔犬期(2.5月齡)、幼犬期(6月齡)、青年期(1歲)及成年期(1.7和2.5歲)不同生長階段肝臟中IGF2基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，IGF2基因在2.5月齡昆明犬肝臟臟組織中表達(dá)量極顯著高于其他生長階段(P<0.01)，在幼犬期(6月齡)及以上生長階段中表達(dá)較弱，但大致能看出隨著年齡的增加呈現(xiàn)出微弱降低趨勢(圖11)。

圖11 IGF2基因在不同生長階段昆明犬肝臟中的表達(dá)Fig.11 The expression of IGF2 gene in liver at different growth stages of Kunming dogs

3 討 論

IGF2是最早被證實(shí)的印跡基因之一，在遺傳水平上受親本印跡的調(diào)控，主要由父系來源染色體表達(dá)[17]。作為一種廣泛表達(dá)的多功能單鏈多肽，成年時(shí)期主要靠肝臟分泌，而胚胎時(shí)期則是在子宮內(nèi)通過胎盤分泌，是胚胎生長和發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子[18-19]。研究表明，在人胚胎時(shí)期IGF2基因過表達(dá)可能導(dǎo)致初生嬰兒罹患伯-韋綜合征(Beckwith-Wiedemann syndrome)，表現(xiàn)為組織器官的不對稱發(fā)育和過度生長，即單側(cè)肥大和生長紊亂；而IGF2基因表達(dá)不足或缺失則可能導(dǎo)致羅素銀綜合征(Silver-Russell syndrome)，表現(xiàn)為發(fā)育遲緩和身體矮小畸形[20-21]。小鼠中靶向敲除IGF2基因則會導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育缺陷[17]。IGF2基因不僅在哺乳動(dòng)物胚胎生長和發(fā)育中起著非常重要的作用，而且還參與動(dòng)物的多種生理和病理調(diào)控過程[22-25]。在豬和其他哺乳動(dòng)物上，IGF2基因啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄抑制物結(jié)合位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性改變會影響啟動(dòng)子的活力，進(jìn)而改變骨骼肌中IGF2基因的表達(dá)水平，從而調(diào)控肌肉的生長發(fā)育[26-27]。基于IGF2基因在調(diào)控動(dòng)物生長發(fā)育等方面的重要作用，本研究在犬上針對該基因進(jìn)行克隆、序列分析及組織表達(dá)分析。

目前，關(guān)于哺乳動(dòng)物IGF2的研究更多的是集中于IGF2在動(dòng)物血液中的濃度水平和IGF2基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)系及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。關(guān)于哺乳動(dòng)物IGF2基因序列分析和結(jié)構(gòu)變異的研究較少。本研究首次從昆明犬中成功克隆得到IGF2基因CDS區(qū)，序列長度為717 bp，共編碼238個(gè)氨基酸。將昆明犬IGF2基因核苷酸序列與多個(gè)物種進(jìn)行相似性比對，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列與同為犬科動(dòng)物的赤狐的相似性為100%，初步說明IGF2基因進(jìn)化在犬科動(dòng)物中是相當(dāng)保守的。另外，多物種IGF2基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹與各物種在分類學(xué)的地位基本吻合，且與物種進(jìn)化的結(jié)果相一致。本試驗(yàn)運(yùn)用多個(gè)生物信息學(xué)軟件對昆明犬IGF2蛋白進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)IGF2蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為63.63，親水性為-0.241，無信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，屬不穩(wěn)定的親水性非分泌蛋白。在遼寧絨山羊的研究中發(fā)現(xiàn)IGF2蛋白具信號肽結(jié)構(gòu)，為不穩(wěn)定的親水性分泌蛋白[28]，推測該蛋白可能存在物種間表達(dá)調(diào)控模式上的差異。昆明犬IGF2蛋白主要定位于細(xì)胞核和線粒體中，有23個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是進(jìn)行蛋白磷酸化修飾的潛在作用位點(diǎn)。二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比最高(達(dá)47.48%)，間接說明IGF2蛋白穩(wěn)定性較差，這與其不穩(wěn)定指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于40(63.63)的結(jié)果相符。

盡管IGF2基因在序列結(jié)構(gòu)上高度保守，但在不同物種中具有不同的表達(dá)模式[29]。IGF2基因在動(dòng)物各組織中廣泛表達(dá)，是控制動(dòng)物生長和脂肪沉積的重要基因之一[30-31]。本研究中，IGF2在不同組織中出現(xiàn)一定的差異表達(dá)，其在肝臟中的表達(dá)最高，進(jìn)一步說明肝臟是IGF2合成的主要器官[32]。除肝臟以外，該基因在脾臟的表達(dá)量顯著高于其他組織，由于脾臟是動(dòng)物體內(nèi)最大的淋巴免疫器官，所以推測IGF2可能參與到昆明犬的免疫調(diào)節(jié)途徑中，但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。目前，對于IGF2在免疫中所發(fā)揮的作用，也是研究者們較為關(guān)注的問題。另外，各組織中IGF2基因的表達(dá)量可能會隨著機(jī)體的發(fā)育階段而呈現(xiàn)出差異，而2.5月齡犬生長發(fā)育旺盛，是仔犬向幼犬過渡的關(guān)鍵期，此時(shí)期IGF2基因在各組織中的表達(dá)情況尤其值得關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)IGF2基因在2.5月齡仔犬肝臟中的表達(dá)量極顯著高于后期各個(gè)成長階段，這一結(jié)果從側(cè)面印證了IGF2在動(dòng)物機(jī)體早期生長發(fā)育中發(fā)揮著極為重要的作用[3,33]。Goodyer等[34]的研究結(jié)果也顯示，胎兒肝臟細(xì)胞產(chǎn)生的IGF2是IGF1的10倍。IGF2基因在不同年齡的豬、牛等家畜背最長肌中的表達(dá)量也表現(xiàn)出隨年齡增加而下降的現(xiàn)象[35-36]。此外，IGFs的高親和力結(jié)合伴侶胰島素樣生長因子4(IGFBP4)和IGFBP5在牦牛不同生長階段肝臟中的表達(dá)量與其年齡增長呈正相關(guān)，表現(xiàn)為隨年齡增加表達(dá)量也增加，并于5歲時(shí)達(dá)到峰值[37]，由此推測昆明犬不同生長發(fā)育時(shí)期肝臟中可能也存在上述IGFs結(jié)合伴侶隨年齡增加而出現(xiàn)表達(dá)量上升的現(xiàn)象，從而可能導(dǎo)致IGF2在不同生長時(shí)期肝中表達(dá)量與年齡增長呈負(fù)相關(guān)，表明IGFs與其結(jié)合伴侶以協(xié)同方式共同調(diào)控動(dòng)物組織的生長發(fā)育。后續(xù)研究可進(jìn)一步探索在犬類早期胚胎和幼體發(fā)育過程中IGF2的具體生物學(xué)作用和調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究克隆了昆明犬IGF2基因,其編碼區(qū)全長717 bp，編碼238個(gè)氨基酸，昆明犬IGF2相似性與赤狐最高(100%)，證明其在生物進(jìn)化過程中非常保守。IGF2蛋白屬于帶正電、不穩(wěn)定、親水性蛋白，主要分布在細(xì)胞核和線粒體中；二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。IGF2基因在2.5月齡昆明犬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉中均有表達(dá)，其中肝臟組織表達(dá)量最高，該基因在肝臟中的表達(dá)隨著昆明犬年齡的增加呈現(xiàn)降低的趨勢。研究結(jié)果加深了對犬類IGFs分子生物學(xué)方面的認(rèn)識，可為昆明犬生長調(diào)控及分子標(biāo)記輔助育種的研究提供一定理論依據(jù)和支持。