翟亞瑩 張子敬 呂世杰 朱肖亭 張格陽 朱進華 李崢 于翔 王紅利 施巧婷 閆祥洲 王二耀*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河南鄭州 450008；4.河南省動物檢疫總站，河南鄭州 450000；5.河南省郟縣紅牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，河南平頂山 467100）

胚胎冷凍保存是胚胎移植過程中重要的步驟之一，在地方牛品種遺傳資源保護方面具有廣泛的應用價值，最早可以追溯到20 世紀50 年代初期，Smith用甘油作為冷凍劑冷凍了600 枚兔的胚胎，解凍培養(yǎng)只有6 枚發(fā)育。1972 年，Whittingham[1]首次將小鼠胚胎置于超低溫（-196℃）的液氮中，液氮中的細胞代謝速率下降，胚胎能長期穩(wěn)定保存，復蘇后小鼠胚胎仍能夠存活，開啟了胚胎冷凍技術的先河。胚胎冷凍技術將胚胎穩(wěn)定地存于液氮中，將體外胚胎進行跨時間、區(qū)域運輸，克服了地區(qū)和時間的限制，使這些胚胎廣泛用于胚胎移植行業(yè)。近年來，最廣泛應用的是快速冷凍法和玻璃化冷凍法，該文將從胚胎冷凍技術發(fā)展歷程、冷凍保護劑等方面展開綜述。

1 胚胎冷凍技術

胚胎冷凍技術就是將動物的早期胚胎置于冷凍保護液中，通過降溫措施，將胚胎穩(wěn)定存放在液氮中，使胚胎的生命活動減弱或暫時中止，但復溫后可以迅速恢復生長的能力，以達到長期體外保存胚胎的目的。胚胎的冷凍液可以用杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）配制，pH 保持7.2～7.4，也可用TCM-199 或生理鹽水來配制[2]。冷凍胚胎過程中溫度降至-15～-50℃時，大的冰晶易在細胞內(nèi)形成，冰晶的形成對于細胞來說是致命的，很可能導致細胞的死亡[3]。隨著人們對胚胎冷凍技術的探索，人們不斷克服常規(guī)冷凍方法存在的缺點，嘗試通過改變冷凍方法、添加冷凍保護劑等方式提高胚胎冷凍的效率。胚胎冷凍的方式主要有三種：慢速冷凍法，快速冷凍法，玻璃化冷凍法，目前玻璃化冷凍法廣泛應用于生產(chǎn)實踐。胚胎冷凍技術對于保護良種牛，發(fā)展優(yōu)秀種質(zhì)資源有著重大意義。

1.1 慢速冷凍法

乙二醇（EG）、甘油（GLY）、二甲基亞砜（DMSO）等常被作為慢速冷凍法的冷凍保護劑。胚胎被浸泡在濃度由低到高的冷凍保護劑中，分三步或四步使其完全進入胚胎，然后用冷凍裝置緩慢冷卻，降溫速度低于1℃/min，當溫度達到-30～-80℃時，將胚胎放置于在液氮中[4]。1973 年慢速冷凍法首次用于冷凍牛胚胎，解凍后經(jīng)胚胎移植成功生出小牛[5]。

慢速冷凍法的缺陷體現(xiàn)在以下幾個方面：第一，胞內(nèi)水過冷狀態(tài)不穩(wěn)定，會形成胞內(nèi)冰晶，使胚胎的存活率和著床率較低。第二，慢速冷凍需要控制冷凍速率，以減少冰晶形成對胚胎造成的傷害，因此，冷凍過程需要較長的時間。第三，慢速冷凍法會使胚胎過度脫水，必須采用慢速解凍法，緩慢復蘇胚胎，提高胚胎成活率。慢速冷凍法對胚胎傷害較大，冷凍過程煩瑣，解凍過程復雜，這些因素限制了慢速冷凍技術的廣泛應用。

1.2 快速冷凍法

快速冷凍法由慢速冷凍法改進而來，不需要使用梯度冷凍，而是直接將胚胎投入液氮中?？焖倮鋬龇▋?yōu)點是耗時短，冷凍液作用時間短，對胚胎毒性小，缺點是降溫速度快，冰晶形成多[6]。

快速冷凍法經(jīng)常使用兩種或兩種以上物質(zhì)作為冷凍保護劑。甘油和蔗糖（sucrose）首次作為胚胎冷凍劑冷凍小鼠胚胎，解凍復蘇后囊胚率達到61%～65%[7]。Chupin 將2.8mol/L 甘油和0.25mol/L 蔗糖作保護劑冷凍牛胚胎，將牛胚胎直接投入液氮冷凍，解凍復蘇后胚胎囊胚率為50%?？蒲腥藛T對該方法進一步改進，將牛胚胎置于液氮瓶頸處預冷5min，再將胚胎投入液氮，解凍后胚胎的囊胚率可達67.6%。為了進一步簡化胚胎解凍過程，國內(nèi)研究人員將1 份保護劑和3 份稀釋劑直接裝入冷凍胚胎的細管中。解凍后，輕敲管子，使溶液在管內(nèi)混合，冷凍保護劑被高度稀釋，可以實現(xiàn)將胚胎直接移植，簡化了胚胎解凍的煩瑣過程[8,9]。

1.3 玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是1985 年興起的一種胚胎冷凍方法。該方法通過添加高濃度的冷凍劑使胚胎快速脫水，在0℃以下投入液氮中對胚胎進行冷凍保存，操作簡單，不需要昂貴的儀器設備。玻璃化法高濃度的冷凍劑在低溫下呈現(xiàn)黏稠態(tài)，達到臨界值時液體發(fā)生固化，形成了沒有結構的玻璃態(tài)，從而避免冰晶的形成，減少冰晶對于細胞的損害[10]。另外，牛胚胎在慢速冷凍法中具有冷敏感性，該方法可以避免這種冷敏感，使得存活率比慢速冷凍法的存活率更高[11]。玻璃化冷凍的缺點主要體現(xiàn)在高濃度冷凍劑的毒性作用，因此需要嚴格控制冷凍劑的作用時間。雖然玻璃化冷凍還存在缺陷，但科研工作者們在不斷探索改進，相信該方法將有很大提升和廣闊的應用前景。

1.3.1 兩步法

最初Kasai 進行玻璃化冷凍的探索，以25%甘油和25%丙二醇（PG）為冷凍液，將小鼠8 細胞進行玻璃化冷凍，取得了不錯的效果。但此配方應用于牛胚胎體外培養(yǎng)時，牛胚胎到桑椹胚便停止發(fā)育。隨著科技的進步，科研人員改進了冷凍液配方，兩步法中的冷凍液由40%乙二醇、18%聚蔗糖（ficoll）以及0.26%蔗糖（sucrose）在TCM-199 中組成。冷凍步驟分兩步進行：凍存前，胚胎在0.8mL 的20%乙二醇液中存放3min，繼而轉移至0..8mL 的玻璃化冷凍液中短暫停留，隨后裝入0.25mL 凍精細管，在30～45s內(nèi)投入液氮罐中保存[12]。通過兩步法凍存的牛胚胎可以更好地發(fā)育，凍存液對于胚胎的各個發(fā)育時期均具有保護作用。丁家桐通過該方法凍存山羊胚胎，解凍移植后的妊娠率達到61.5%，產(chǎn)羔率達到40%[13]。朱世恩通過兩步法凍存兔囊胚胚胎，解凍后發(fā)育率達到90%，妊娠率達到29.2%[14]。

1.3.2 開放式細管法（OPS 法）

OPS 冷凍法是使用OPS 薄壁吸管，加熱后將其拉至管的一半直徑和厚度，利用毛細管現(xiàn)象將極少量的冷凍液與胚胎一起吸至OPS 管的末端，最后將OPS管直接放入液氮中進行冷凍保存[14]。OPS 法操作便捷，不要冷凍儀器，極少的冷凍液可達到迅速冷凍、快速解凍以及快速去除保護劑的目的。由于管中冷凍液量很少，還減少了對胚胎的毒害作用。此方法近年來已經(jīng)廣泛用于牛胚胎的冷凍保存。

1.3.3 Cryotop 冷凍法

Cryotop 法與OPS 法有類似之處，將含有胚胎的玻璃化液滴（約0.1μL）放置在細聚丙烯條內(nèi)，然后立即垂直放入液氮中完成冷凍，冷凍后用塑料帽蓋住Cryotop 板，存放在液氮中[15]。該方法使用的冷凍液體積更小，冷凍和解凍速率更高。用Cryotop 法冷凍保存牛胚胎可以使囊胚孵化率達到90%，Cryotop 法簡單便捷，是一種實用的玻璃化冷凍技術[16]。

2 冷凍保護劑

冷凍保護劑是為了減少或防止細胞在冷凍過程中受到損傷的試劑，目前常分為細胞內(nèi)液冷凍保護劑、細胞外液冷凍保護劑和抗凍蛋白等。在慢速冷凍法中，只有一種物質(zhì)被用作冷凍保護劑，如甘油、乙二醇、DMSO，而在快速冷凍法和玻璃化冷凍法中，通常是幾種冷凍保護劑同時使用。

2.1 細胞內(nèi)液冷凍保護劑

細胞內(nèi)液冷凍保護劑通常是分子量小且具有穿透細胞膜能力的物質(zhì)，如乙二醇，甲醇（MT），丙二醇、甘油、二甲基亞砜等。Rall 和Fahy 用20.5%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙二醇、6%聚乙二醇作為玻璃化冷凍液，冷凍小鼠胚胎，獲得了87.7%的冷凍成活率[17]。許文兵的研究指出，以EG 為冷凍保護劑，固體表面載桿為冷凍載體，冷凍轉基因牛的早期囊胚可以獲得最佳效果[18]。

2.2 細胞外液冷凍保護劑

細胞外液冷凍保護劑常為大分子、非滲透性細胞膜物質(zhì)，例如蔗糖、海藻糖（trehalose）、半乳糖（galactose）、聚蔗糖、海藻糖（trehalose）等。蔗糖因其在低溫下對細胞沒有毒害作用，而被作為玻璃化冷凍保護液的主要成分廣泛應用[19]。2004 年，Gong 等采用OPS 法玻璃化，以40%乙二醇+30%聚蔗糖+0.5mol/L 蔗糖為冷凍保護劑，冷凍牛的SCNT 囊胚，第60d 妊娠率和產(chǎn)犢率均為33.3%[20]。Zhao 等用15%乙二醇+15%DMSO+0.3mol/L 蔗糖為冷凍保護劑，使用OPS 冷凍法玻璃化冷凍牛ICSI 胚胎，解凍后存活率為82.4%[21]。近年來的研究表明，乙二醇、蔗糖、聚蔗糖作為冷凍保護劑配置成的EFS40 是比較理想的冷凍保護液。

2.3 抗凍蛋白

抗凍蛋白（AFPs）是一類能附著在冰晶表面，與冰晶結合后可以遏制其生長的蛋白質(zhì)，由Devriesde等在海冰地區(qū)魚類血液中鑒定出來[22]。后來科研人員不但在多種魚類中鑒定出該物質(zhì)，在植物和昆蟲體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)。AFPs 具有穩(wěn)定細胞膜的作用，與冰晶結合后可以阻止冰晶生長，在冷凍液中再結晶，減少細胞損傷。該物質(zhì)應用于牛胚胎冷凍可以減少冰晶對胚胎的傷害，對保持胚胎完整性具有重要意義。

3 展望

胚胎冷凍技術對我國保護地方肉牛種質(zhì)資源發(fā)揮著重要作用。隨著該技術的不斷成熟，牛胚胎冷凍效率會進一步提高，特別是玻璃化冷凍法，其操作方便，對胚胎損傷較小，一定會有巨大的應用前景。