李慧 任思齊 周燕楠 胡夢婷 卜妮妮 趙鑫原 段慧琴/北京農(nóng)學院動物科學技術學院 102206

脂多糖（LPS）是以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌的主要致病物質，其具有廣泛的生物活性，能引起嚴重的炎癥級聯(lián)反應，進而損傷多個臟器。

小檗堿（Berberine，BBR）是存在于毛茛科及小檗科等植物根莖中的一種異喹啉類生物堿，具有清熱解毒的功效，毒副作用小。小檗堿多被使用在清熱解毒方和抗菌消炎的方劑中，在治療與預防家畜腸炎、胃潰瘍、胃炎、菌痢消化道疾病方面有很突出的作用，具體作用機制雖有研究但還不夠明確。本研究用小檗堿預作用于小鼠，再用LPS 誘導小鼠小腸急性炎癥，研究小檗堿對小腸的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鹽酸小檗堿標準品（HPLC≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，將小檗堿溶于生理鹽水，配制成2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL 藥液；LPS（大腸桿菌血清型為 O55：B5）購自美國 Sigma-Aldrich 公司，以生理鹽水溶解LPS 配成1mg/mL。

1.2 試驗動物SPF 級昆明小鼠，50 只，體重20±2g，購自北京市海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖場。試驗前適應性飼養(yǎng)一周，自由采食與飲水。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組與處理將小鼠隨機分為小檗堿低劑量（25mg/kg）+LPS 組、小檗堿中劑量（50mg/kg）+LPS 組、小檗堿高劑量（100mg/kg）+LPS 組、陰性對照組、LPS 模型對照組。小檗堿低中高劑量組連續(xù)給藥灌胃3d，空白組和模型組灌胃生理鹽水10mL/kg。末次給藥后1 小時小檗堿組和LPS 模型對照組腹腔注射10mg/kg LPS，以建立小鼠小腸炎癥模型，陰性對照組腹腔注射10mL/kg 生理鹽水，并禁食、自由飲水，觀察小鼠精神狀態(tài)、運動狀態(tài)。12h 后處死。

1.3.2 測定指標及方法

1.3.2.1 一般行為指標 對小鼠精神狀態(tài)、運動狀態(tài)和飲水情況等一般行為指標進行觀察并記錄。

1.3.2.2 小腸組織形態(tài)學觀察 打開腹腔后觀察小腸大體形態(tài)變化，取十二指腸、空腸和回腸樣品常規(guī)脫水透明，包埋于石蠟，切片（5μm），進行 HE 染色，染色切片光鏡下觀察。

1.3.2.3 ELISA 法測定小鼠腸組織中IL-6、IL-1β 水平 病變腸組織切割標本后，稱取重量，用液氮迅速冷凍，加入一定量的PBS（pH7.4），用手工玻璃勻漿其將標本勻漿充分，3000r/min 離心20 分鐘，仔細收集上清。按照ELISA 試劑盒說明書檢測腸組織中IL-6、IL-1β 水平。

1.3.2.4 免疫印跡法測定小鼠十二指腸中 MD-2、TLR4 蛋白的表達 病變腸組織切割標本后，稱取重量，用液氮迅速冷凍，加入一定量的RIPA（含PMSF）裂解提取蛋白。所得蛋白樣本以12% SDS-PAGE 進行電泳并將目的蛋白轉移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉2h 后，分別加入MD-2、TLR4、NF-κB、β-actin 抗體，4℃孵育過夜。之后加入HRP 標記二抗室溫孵育2h。加入ECL 顯色液并曝光條帶。

1.4 統(tǒng)計分析用Graph Pad Prism 8 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均值±標準差（Mean±SD）表示，用單因素方差分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 一般行為指標觀察腹腔注射LPS 3h 后LPS 模型對照組開始出現(xiàn)排泄球狀便、軟便，扎堆，精神萎靡；7h 后排稀便，飲水減少，行動緩慢，眼角出現(xiàn)明顯白色粘稠分泌物；10h 后小鼠體態(tài)呈佝僂狀，眼睛分泌物粘稠凝結于眼表，睜眼障礙，不見飲水行為，反應遲鈍，黃色稀便黏著于肛門口。BBR 各組較LPS 組晚出現(xiàn)上述異常行為。12h 期間陰性對照組未表現(xiàn)出異常行為。

2.2 小腸組織形態(tài)學觀察打開腹腔后陰性對照組小腸顏色正常，形態(tài)完整、整齊，未見水腫與出血。LPS 模型組十二指腸及空腸前段有明顯水腫，腸腔擴張，顏色變深，脹氣，空腸及回腸腸道內(nèi)糞便硬結。BBR 各組十二指腸均可見輕微水腫脹氣，顏色稍變深。肉眼可見各組十二指腸均有病變。

小腸切片HE 染色顯示陰性對照組小腸絨毛結構完整，排列緊密，無明顯病變；LPS 模型組腸絨毛部分破壞斷裂，腸道細胞排列紊亂，細胞腫脹明顯，固有層乃至隱窩出血，炎癥細胞浸潤；用藥組較模型組固有層紅細胞減少，絨毛破壞明顯減輕（圖1）。

圖1 各組小鼠小腸切片HE 染色（200×）

2.3 小鼠十二指腸中IL-1β、IL-6 含量測定LPS 模型組與陰性對照組相比，十二指腸中IL-1β、IL-6 含量明顯升高，差異極顯著（**P ＜0.01）；小檗堿組與LPS 模型組相比，十二指腸中IL-1β、IL-6 含量均極顯著低于LPS 模型組（**P＜0.01），其中100mg/kg·d 小檗堿組效果最好（圖2）。

圖2 各組小鼠十二指腸中IL-1β 及IL-6 含量

2.4 小鼠十二指腸MD-2、TLR4、NF-κB 蛋白含量測定對不同處理組小鼠十二指腸中MD-2、TLR4 及NF-κB 蛋白的含量通過免疫印跡法檢測，以β-actin 為內(nèi)參，用Image J 進行灰度分析。統(tǒng)計結果顯示LPS 模型組與陰性對照組相比，十二指腸中MD-2、TLR4、NF-κB 相對表達量明顯升高，差異極顯著（**P ＜0.01）；小檗堿組與LPS 模型組相比，十二指腸中MD-2、TLR4 相對表達量均極顯著降低（**P＜0.01)，50mg/kg·d 和100mg/kg·d 小檗堿組極顯著降低NF-κB 表達量（**P＜0.01),其中100mg/kg·d 小檗堿組效果最好（圖3）。

圖3 各組小鼠十二指腸MD-2、TLR4、NF-κB 相對表達量

3 討論

LPS 在體內(nèi)首先被LPS 結合蛋白(LBP)識別形成復合物，繼而在輔助蛋白CDl4 的幫助下轉運至細胞表面由髓樣分化因子2(MD-2)和Toll 樣受體4(TLR4)組成的復合受體，并激活TLR4 依賴的炎癥信號通路，激活下游MyD88 依賴和TRIF 依賴的信號通路，最終導致核因子-KB（NF-KB）和活化蛋白-1（AP-1）等轉錄因子活化從而開啟下游的炎癥因子、粘附分子和趨化因子等基因的轉錄和表達，造成大量的炎癥介質IL-1β、IL-6 等的釋放，迸而損傷多個臟器，引發(fā)動物細菌性疾病。前期課題組研究表明小檗堿在細胞層面有很好的抗炎活性，表現(xiàn)在對LPS 誘導的急性炎性反應及其傳導信號通路的抑制。本次研究在動物層面通過檢測TLR4、MD-2、NF-κB 蛋白及下游炎癥因子IL-1β、IL-6 驗證小檗堿對LPS誘導的小鼠炎癥反應的緩解作用，初步探究小檗堿抗內(nèi)毒素的作用機制可能是通過TLR4/MD-2/NF-κB 信號通路上的蛋白表達，從而減少炎癥因子的分泌，保護腸道。