李雯謙，解盼，劉蔚，康郁，廖莉，任睿，錢(qián)論文,2,3，官春云,2,3，何昕,2,3*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)南方糧油協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙，410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，湖南 長(zhǎng)沙，410128；3.國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙，410128）

作為重要的環(huán)境因子之一，光不僅是植物光合作用能量的來(lái)源，還是調(diào)節(jié)植物光形態(tài)建成等生理過(guò)程的信號(hào)來(lái)源。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物進(jìn)化出多種感受光信號(hào)的受體[1]，從而能夠感受各種光信號(hào)的變化并及時(shí)作出響應(yīng)。目前已知的光受體主要包括光敏色素、隱花色素、向光蛋白、UV-B 受體以及ZTL（zeitlupes）家族蛋白[2]。

光敏色素在植物體內(nèi)感受紅光和遠(yuǎn)紅光[3]，是一種能夠形成同、異源二聚體的水溶性蛋白，通常由120～130 kDa左右的脫輔基蛋白和四吡咯環(huán)生色團(tuán)組成[4]。每個(gè)單體由氨基端（N-端）結(jié)構(gòu)域和羧基端（C-端）結(jié)構(gòu)域兩個(gè)結(jié)構(gòu)組成并且通過(guò)一個(gè)鉸鏈區(qū)鏈接[5,6]。位于氨基端的脫輔基蛋白不具有接收光子的作用，光敏色素蛋白靠生色團(tuán)吸收光子。四吡咯分子（phytochromobillin，PΦB）在細(xì)胞質(zhì)中和脫輔基蛋白中的半胱氨酸殘基形成硫醚鍵，讓整個(gè)光敏色素蛋白有接收光子生物功能，所以感光區(qū)域位于氨基端。羧基端結(jié)構(gòu)域主要是光調(diào)節(jié)區(qū)，是促進(jìn)光敏色素二聚體的形成以及色素蛋白的核定位必不可少的。在擬南芥中已經(jīng)確定并克隆出的光敏色素蛋白有5個(gè)，分別為光敏色素A、B、C、D和E（PHYA-E）[7]，根據(jù)其在光下的穩(wěn)定性，分為光不穩(wěn)定型PHYA 和光穩(wěn)定型的PHYB-E。在植物細(xì)胞中，光敏色素有兩種不同的形式，兩者在紅光和遠(yuǎn)紅光的照射下可以互相逆轉(zhuǎn)。在黑暗中，光敏色素主要以不具生理活性的Pr形式（紅光吸收型）位于細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過(guò)紅光照射后，非生物活性的光敏色素會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘腜fr形式（遠(yuǎn)紅光吸收型），被激活的光敏色素便會(huì)由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)于Pfr 形式的PHYA 來(lái)說(shuō)需要借助穿梭蛋白FHY1/FHL 進(jìn)入細(xì)胞核[8,9]，而其它的光敏色素成員，只需依靠光敏色素蛋白羧基端的核定位序列，即可進(jìn)入細(xì)胞核[10]，進(jìn)入核內(nèi)的光敏色素直接與光敏色素互作因子（PIF）結(jié)合，調(diào)節(jié)PIF 對(duì)下游相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，從而影響植物光形態(tài)建成和其它生理過(guò)程。有生物活性的Pfr 在遠(yuǎn)紅光照射或者是黑暗條件下會(huì)被蛋白酶降解，轉(zhuǎn)變?yōu)椴痪哂猩砘钚缘腜r。

目前對(duì)擬南芥的光敏色素研究主要集中在PHYA 和PHYB 的功能，對(duì)于PHYC/D/E 研究較少。研究表明，PHYA 在特定條件下能夠在紅光和遠(yuǎn)紅光的照射下促進(jìn)種子萌發(fā)，PHYB 則主要在紅光的調(diào)控下促進(jìn)種子萌發(fā)，而PHYE 要在持續(xù)的遠(yuǎn)紅光照射下才能促進(jìn)種子萌發(fā)[11,12]。除光照波長(zhǎng)外，溫度也會(huì)影響種子萌發(fā)。PHYB 在高于22℃的溫度條件下顯著促進(jìn)種子萌發(fā)，PHYE 是在低于16℃的溫度環(huán)境下對(duì)種子萌發(fā)有功能優(yōu)勢(shì)[13]。無(wú)光條件下PHYA 在植物體內(nèi)大量積累，導(dǎo)致幼苗黃化，出現(xiàn)下胚軸伸長(zhǎng)、子葉呈彎鉤狀、前質(zhì)體發(fā)育為黃化體的暗形態(tài)建成的情況[14]，并且研究發(fā)現(xiàn)phyA突變體在紅、白光下和野生型表現(xiàn)一致，在遠(yuǎn)紅光照射下呈暗形態(tài)建成，說(shuō)明PHYA 主要感受遠(yuǎn)紅光。phyB突變體表現(xiàn)出和暗形態(tài)建成一樣的情況，可見(jiàn)幼苗的光形態(tài)建成主要由PHYB 在紅光光照下介導(dǎo)發(fā)生，PHYC-E 以輔助形式參與其中，完成幼苗去黃化的過(guò)程，與暗形態(tài)建成表型完全相反[15]；為了避免周?chē)脖徽趽豕庹眨参飼?huì)發(fā)生主要由PHYB 介導(dǎo)、PHYD 和PHYE 輔助的避蔭反應(yīng)，表現(xiàn)為莖稈和葉柄伸長(zhǎng)，株高增加，可以獲取更多的光照，抗病蟲(chóng)害能力受影響，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[16～19]。在低的紅光∶遠(yuǎn)紅光（R∶FR）比例下，Pfr 的PHYB 的數(shù)量降低，和PIF 結(jié)合的能力下降，穩(wěn)定的PIF能夠誘導(dǎo)YUCCA基因表達(dá)量增加從而提高生長(zhǎng)素的含量并促進(jìn)植物伸長(zhǎng)反應(yīng)，PHYA 則是在強(qiáng)避蔭條件下被激活，抑制下胚軸的伸長(zhǎng)，從而抑制避蔭反應(yīng)的過(guò)度發(fā)生[20]；擬南芥的開(kāi)花同樣受光照和溫度的影響，超表達(dá)PHYA基因無(wú)論在長(zhǎng)、短日照條件下都能促進(jìn)開(kāi)花[21]。在避蔭條件下，由于處于低R∶FR 比例的弱光逆境狀態(tài)，為了存活，植物常常提前開(kāi)花，但也會(huì)因此導(dǎo)致種子質(zhì)量下降；如果提高R∶FR 的比例，PHYB、D、E能共同調(diào)節(jié)花期，則可抑制開(kāi)花。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)環(huán)境溫度為22℃時(shí)，phyB突變體的花期提前，當(dāng)溫度降低到16℃時(shí)，phyB突變體早花現(xiàn)象消失，似乎是PHYE 在低溫下發(fā)揮主導(dǎo)作用，和種子萌發(fā)有相似的結(jié)論；在耐寒方面光敏色素也發(fā)揮重要作用，在低溫條件下，光敏色素能夠調(diào)控CBF轉(zhuǎn)錄因子[22]，促進(jìn)其下游COR基因的表達(dá)，進(jìn)而提高植物的抗凍性，提高植物在低溫下的存活率。

在禾本科植物中，光敏色素只有PHYA、PHYB、PHYC 三種。研究表明，水稻（Oryza sativa）中的PHYA基因在極低輻照度反應(yīng)（very low fluence response，VLFR）下促進(jìn)種子萌發(fā)，但是高輻照度反應(yīng)（high-irradiance reaction，HIR）和VLFR 條件下，胚芽鞘的伸長(zhǎng)則被抑制[23]。過(guò)表達(dá)煙草（Nicotiana tabacum）PHYA基因會(huì)導(dǎo)致花期提前，葉面積增大；在菊花（Chrysanthemum morifolium）中過(guò)表達(dá)PHYA基因也會(huì)導(dǎo)致花期提前并且影響花色[24]；Zheng 等[25]發(fā)現(xiàn)PHYB1 基因主要影響菊花花芽發(fā)育。高粱（Sorghum bicolor）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、水稻等開(kāi)花早的作物的早開(kāi)花期是由于PHYB基因功能缺失突變引起的[26～29]。促進(jìn)玉米幼苗的去黃化反應(yīng)和抑制避蔭反應(yīng)則由PHYC基因調(diào)控[30]。

油菜是我國(guó)種植面積最大的油料作物，對(duì)我國(guó)的植物油和飼用蛋白的供給安全有重要意義[31]。由于種植模式的改變及湖南省的氣候特點(diǎn)，油菜生產(chǎn)過(guò)程中面臨很多問(wèn)題，導(dǎo)致油菜產(chǎn)量不高。湖南省光、溫資源豐富，油菜合理密植在一定程度上可以提高產(chǎn)量[32]。但是種植密度過(guò)大難以避免出現(xiàn)避蔭反應(yīng)。因此，增加油菜光能利用率，提高油菜單位面積產(chǎn)量，培育耐密植的油菜品種也迫在眉睫。

光敏色素在植物避蔭反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用，也對(duì)病菌、蟲(chóng)害、干旱、鹽脅迫等抗逆性有一定的影響[33]。因此，我們對(duì)油菜光受體中的光敏色素PHY基因家族進(jìn)行分析，探究其在甘藍(lán)型油菜中生長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)功能。根據(jù)擬南芥的5個(gè)PHY基因?qū)Ρ?，從甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥中分別鑒定其PHY成員，發(fā)現(xiàn)它們可分為4 個(gè)亞組：PHYA、PHYB、PHYC、PHYE，目前尚未找到AtPHYD直系同源基因。此外還對(duì)PHY基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析，預(yù)測(cè)其功能。另外分析了其組織表達(dá)特異性，非生物脅迫和激素處理對(duì)PHY基因表達(dá)的影響、生物脅迫如核盤(pán)菌接種的影響等，以期為甘藍(lán)型油菜PHY基因功能鑒定及其在抗逆、抗病蟲(chóng)害等方面的利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甘藍(lán)、白菜及甘藍(lán)型油菜PHY 基因家族成員的鑒定與序列分析

從Ensembl Plants 和Brassica Genomics Database中獲取擬南芥、甘藍(lán)（CC,2n=2x=18）、白菜（AA,2n=2x=20）、甘藍(lán)型油菜（AACC, 2n=4x=38）、黑芥（BB,2n=2x=16）、芥菜型油菜（AABB, 2n=4x=36）以及埃塞俄比亞芥（BBCC, 2n=4x=34）的PHY基因有關(guān)信息，如全長(zhǎng)DNA 序列、氨基酸序列等（http://plants.ensembl. org/index. html、http://brassicadb. bio2db.com）。先從網(wǎng)站中下載AtPHY基因的核酸和氨基酸的序列，閾值設(shè)置E＜10-5對(duì)甘藍(lán)、白菜、甘藍(lán)型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥基因組進(jìn)行BLASTP比對(duì)，鑒定PHY的同源基因。

1.2 生物信息學(xué)分析

對(duì)7 個(gè)物種PHY 蛋白序列比對(duì)分析（https://www. genome. jp/tools-bin/clustalw），比對(duì)圖片用網(wǎng)站輸出（http://espript. ibcp. fr/ESPript/cgi-bin/ESPript. cgi）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)用MEGA-X 中的neighbourjoining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育方法構(gòu)建，使用poisson 模式，bootstrap 參數(shù)設(shè)置為2000，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。保守結(jié)構(gòu)域用MEME 分析（http://MEME. nbcr. net/MEME/cgi-bin/MEME. cgi）。蛋白的預(yù)測(cè)分子量（molecular weight，MW）和等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）從網(wǎng)站獲?。╤ttp://web. expasy. org/ComputepI/）。ProtComp 9.0 在線分析亞細(xì)胞定位（http://linux1. softberry. com/）。對(duì)BnaPHY基因上游2000 bp 的DNA 序列通過(guò)Plant CARE 進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件分析（http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）。基因結(jié)構(gòu)、共線性分析、啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析以及甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜的PHY基因非同義替換和同義替換間的比例（Ka/Ks）分析通過(guò)TBtools軟件[34]展示。

1.3 表達(dá)分析

主要對(duì)BnaPHY基因在不同組織、激素、逆境、接種核盤(pán)菌[35]后及春化處理下的表達(dá)進(jìn)行分析。根據(jù)HE 等[36,37]以及本課題組尚未公開(kāi)的數(shù)據(jù)，分析BnaPHY基因在不同組織的表達(dá)量；在上午8：00-下午8：00 期間，對(duì)已生長(zhǎng)6 周的油菜葉片進(jìn)行不同激素（100 μmol/L 脫落酸、100 μmol/L 茉莉酸甲酯、10 μg/mL 乙烯和1mmol/L 水楊酸）和高溫（40℃）、低溫（4℃）處理，油菜根部進(jìn)行不同逆境（200 mmol/L 氯化鈉的鹽脅迫和20%聚乙二醇6000的干旱脅迫）處理，分析各BnaPHY基因在3、6 和12h 處理下的表達(dá)量以及對(duì)開(kāi)花期接種核盤(pán)菌24h 后的表達(dá)分析，利用TBtools 生成表達(dá)熱圖。在油菜發(fā)育表達(dá)資源網(wǎng)站（ORDER；http://order.jic.ac.uk）獲取甘藍(lán)型油菜BnaPHY基因經(jīng)6 周低溫春化處理下的表達(dá)量分析圖[38]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜等PHY基因鑒定

通過(guò)5 個(gè)AtPHY 蛋白序列，結(jié)合PHY基因保守結(jié)構(gòu)域分析，對(duì)甘藍(lán)、白菜、甘藍(lán)型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥的參考基因組注釋蛋白（http://plants. ensembl. org/index. html、http://brassicadb.bio2db.com）進(jìn)行BLASTP 搜索（閾值為E-value＜10-5），最終分別鑒定出6 個(gè)BoPHY（甘藍(lán)）、5 個(gè)BraPHY（白菜）、11 個(gè)BnaPHY（甘藍(lán)型油菜）、5 個(gè)BniPHY（黑芥）、10 個(gè)BjuPHY（芥菜型油菜）和9 個(gè)BcaPHY（埃塞俄比亞芥）的PHY基因。

理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1653 ～3633 bp；氨基酸數(shù)目550 ～1210；分子量61.45 ～134.11 kDa；等電點(diǎn)（pI）預(yù)測(cè)范圍5.03～6.75；亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)51個(gè)PHY蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)。與其它成員有顯著差異的，是1個(gè)PHYC成 員（BcaC08g44236） 和 3 個(gè) PHYA 成 員（Bra020013、BjuA021662和BnaA06g05470D），前者基因編碼區(qū)長(zhǎng)度和氨基酸數(shù)目較短，可能是在進(jìn)化中缺失了部分片段，后者基因編碼區(qū)和氨基酸殘基偏長(zhǎng)，其中BnaA06g05470D基因含有8 個(gè)內(nèi)含子，Bra020013和BjuA021662基因含有7 個(gè)內(nèi)含子，推測(cè)可能是在復(fù)制過(guò)程中基因發(fā)生了突變。具體信息詳見(jiàn)附表1（首頁(yè)OSID二維碼）。

2.2 光敏色素蛋白PHY的序列比對(duì)分析

用網(wǎng)站對(duì)篩選出的51 個(gè)PHY 家族蛋白進(jìn)行序列比對(duì)（https://www. genome. jp/tools-bin/clustalw），結(jié)果表明蛋白序列較保守，除BcaC08g44236基因以外，都具有PHY 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域：即氨基端的PAS、GAF 及PHY 結(jié)構(gòu)域，羧基端的2 個(gè)PAS 結(jié)構(gòu)域和HKRD 組氨酸激酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域。BcaC08g44236基因只有部分PHY 結(jié)構(gòu)域、羧基端的2 個(gè)PAS 結(jié)構(gòu)域以及部分HKRD 組氨酸激酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域（附圖1，見(jiàn)首頁(yè)OSIC碼）。

PHY 蛋白中PAS 和GAF 結(jié)構(gòu)域共同組成含有膽素裂合酶活性的光感受結(jié)構(gòu)域，主要在PAS 或者GAF 發(fā)色團(tuán)和半胱氨酸殘基的連接過(guò)程中產(chǎn)生作用。PHY 結(jié)構(gòu)域的作用是調(diào)節(jié)光敏色素的活性，以及穩(wěn)定具有生物活性形式的Pfr。對(duì)于PHYB 來(lái)說(shuō)，羧基端的2 個(gè)連續(xù)的PAS 結(jié)構(gòu)域，是使其在光照條件下從細(xì)胞質(zhì)定位到細(xì)胞核的必要結(jié)構(gòu)，而PHYA則需要借助穿梭蛋白FHY1/FHL 進(jìn)入細(xì)胞核；羧基端的另一個(gè)功能則是促進(jìn)光敏色素蛋白二聚體的形成[39]。

2.3 PHY基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

用51 個(gè)PHY 蛋白序列通過(guò)MEGA X 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，了解甘藍(lán)型油菜PHY與擬南芥、甘藍(lán)、白菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥的PHY基因之間的進(jìn)化關(guān)系。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可將PHY 蛋白分為5 個(gè)亞組（PHYA、PHYB、PHYC、PHYD 和PHYE）（圖1）。

根據(jù)甘藍(lán)、白菜、黑芥、芥菜型油菜、埃塞俄比亞芥以及甘藍(lán)型油菜An-和Cn-亞基因組之間的46個(gè)Bo/Br/Bni/Bju/Bca/BnaPHY基因的同源關(guān)系，共鑒定出5 組Bo-Br-Bni-BjuA-BjuB-BcaA-BcaC-An-Cn 同源基因?qū)?，分屬于PHYA、PHYB、PHYC、PHYE亞組，其中2 組屬于PHYA 亞組，而PHYD 未找到的同源基因。PHYA 亞組中埃塞俄比亞芥只存在1 個(gè)位于C 染色體的BcaPHYA1-C（BcaC07g41872）基因，其它物種都有兩組完整的同源基因?qū)?。? 個(gè)含有C 基因組的物種中都多出了1 個(gè)PHYB 拷貝。埃塞俄比亞芥中存有2 個(gè)PHYC 成員，其中BcaPHYC-C2（BcaC08g44236）基因編碼的蛋白長(zhǎng)度明顯短于典型完整PHYC 蛋白，極有可能是其附近的BcaPHYC-C1（BcaC08g44314）基因的不完整復(fù)制拷貝（圖1、首頁(yè)OSID二維碼中的附表1）。

圖1 擬南芥（5個(gè)）、甘藍(lán)（6個(gè)）、白菜（5個(gè)）、甘藍(lán)型油菜（11個(gè)）、黑芥（5個(gè)）、芥菜型油菜（10個(gè)）和埃塞俄比亞芥（9個(gè)）PHY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 A neighbor-joining phylogenetic tree of PHY proteins in Arabidopsis,B.oleracea,B.rapa,B.napus,B.nigra,B.juncea and B.carinata

2.4 PHY基因共線性分析

利用TBtools 分析上述物種基因組中所有PHY基因的共線性關(guān)系。結(jié)果顯示11個(gè)BnaPHY基因在甘藍(lán)型油菜An-和Cn-亞基因組中的分布分別與（5個(gè)）白菜和（6 個(gè)）甘藍(lán)的同源基因是對(duì)應(yīng)的，且染色體位置分布相似；10 個(gè)BjuPHY基因在芥菜型油菜BjuA-和BjuB-亞基因組中的分布則分別與（5個(gè)）白菜和（5 個(gè)）黑芥的同源基因相對(duì)應(yīng)，染色體分布相似；9 個(gè)BcaPHY基因在埃塞俄比亞芥BcaB-和BcaC-亞基因組中的分布分別與（5個(gè)）黑芥和（6個(gè)）甘藍(lán)部分對(duì)應(yīng)，它在進(jìn)化過(guò)程中丟失BcaB-亞基因組的PHYA1、PHYA2 成員以及BcaC-亞基因組的PHYA1成員（圖2）。

圖2 擬南芥、甘藍(lán)、白菜、甘藍(lán)型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥共線性分析Fig.2 Syntenic analysis of Arabidopsis,B.oleracea,B.rapa,B.napus,B.nigra,B.juncea and B.carinata

2.5 PHY基因結(jié)構(gòu)分析和MEME分析

進(jìn)化分析結(jié)果顯示，大多數(shù)PHY基因具有相對(duì)保守的基因結(jié)構(gòu)，即在基因的中后段含有2～3 個(gè)內(nèi)含 子 ；而B(niǎo)oPHYA2（Bo5g009990）、BrPHYA2（Bra020013）、BjuPHYA2-A（BjuA021662）、Bn-PHYA2-A（BnaA06g05470D） 以 及BnPHYA2-C（BnaCnng19880D）和其它基因結(jié)構(gòu)有明顯不同，除了在基因中后段有2～3 個(gè)內(nèi)含子，基因前端還額外多出2～4 個(gè)內(nèi)含子，暗示這些成員可能是PHYA1 成員的復(fù)制（圖3A）。

MEME 分析發(fā)現(xiàn)幾乎所有PHY 成員都包含15個(gè)相對(duì)保守的motif。其中motif9、2、7 組成PHY 蛋白的氨基端，分別是PAS、GAF、PHY 結(jié)構(gòu)域，motif6、1、13、15 組成PHY 蛋白的羧基端，分別是PAS Ⅰ、PAS Ⅱ、His Kinase A、His Kinase-like ATPase 結(jié)構(gòu)域，這兩部分由一個(gè)鉸鏈區(qū)連接（圖3B）。以上結(jié)果表明：在蕓薹屬中，盡管部分PHY 成員基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但蛋白序列高度保守，暗示PHY 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著至關(guān)重要的作用。

圖3 擬南芥、甘藍(lán)、白菜、甘藍(lán)型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥PHY的基因結(jié)構(gòu)分析（A）和MEME分析（B）Fig.3 Gene structures（A）and MEME motifs analysis（B）of Arabidopsis,B.oleracea,B.rapa,B.napus,B.nigra,B.juncea and B.carinata PHY genes

2.6 PHY基因的Ka/Ks分析

為了更好的知道PHY家族基因在擬南芥、甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)27 個(gè)PHY基因進(jìn)行了Ka/Ks分析（數(shù)據(jù)見(jiàn)首頁(yè)OSID 二維碼的附表2）。結(jié)果顯示所有的PHY基因都受到了純化選擇（Ka/Ks＜1）。

2.7 甘藍(lán)型油菜BnaPHY 基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析

PHY基因啟動(dòng)子（上游2000 bp）序列中的各類順式元件用Plant CARE（http://bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）分析，結(jié)果可分為植物激素響應(yīng)順式元件6 種（Auxin、GA、SA、ABA、MeJA 和ET）、環(huán)境脅迫響應(yīng)順式元件6 種（Low-T、Stress、Anaerobic、Wound、Light、Circadian）和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)3 種（MYB、MYC 和W box）以及一些基因特有的響應(yīng)順式元件。

如（首頁(yè)OSID 二維碼的）附表3 和圖5 所示，甘藍(lán)型油菜的BnaPHY基因中有144 個(gè)順式元件與植物激素響應(yīng)有關(guān)，211 個(gè)順式元件與環(huán)境脅迫響應(yīng)有關(guān)，145 個(gè)順式元件與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，4個(gè)順式元件和新陳代謝有關(guān)，4 個(gè)唯一功能的順式元件，還有32 個(gè)功能不清楚的順式元件，分析一共得到540 個(gè)順式元件。其中的ABA 響應(yīng)順式元件，在植物激素類響應(yīng)中最多；光響應(yīng)順式元件，在環(huán)境脅迫響應(yīng)中最多；而轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)最多的是MYC結(jié)合位點(diǎn)。

2.8 甘藍(lán)型油菜BnaPHY 基因在不同組織中的表達(dá)模式分析

根據(jù)甘藍(lán)型油菜BnaPHY基因在不同組織（根、莖、葉、芽、萼片、雄蕊、幼嫩雌蕊、開(kāi)花期雌蕊、衰老期雌蕊、胚珠、角果皮和角果）中的RNA-Seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BnaPHY 不同成員存在明顯不同的組織表達(dá)模式（圖5）。

圖4 BnaPHY基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析Fig.4 Analysis of cis elements in promoter region of BnaPHY gene

圖5 BnaPHY基因在不同組織器官中的表達(dá)熱圖Fig.5 Expression heat map of BnaPHY genes in different tissues and organs

PHYA 亞組的BnaCnng19980D和BnaA06g0547 0D基因在植物各部位都有表達(dá)，BnaC08g42660D和BnaA09g48410D基因除了根和萼片中有較高表達(dá)，其它部位表達(dá)偏低；PHYB 亞組基因中BnaC05g36390D和BnaA05g22950D基因除了在幼嫩雌蕊中表達(dá)量低，在其它組織有較高的表達(dá)量，BnaC03g39830D基因在幼嫩雌蕊、開(kāi)花期雌蕊、衰老期雌蕊幾乎不表達(dá)；PHYC 亞組基因在各組織中有輕微的表達(dá)，而PHYE 則是開(kāi)花期雌蕊中的表達(dá)量高于其它組織。

2.9 甘藍(lán)型油菜BnaPHY 基因的不同非生物逆境和不同激素處理表達(dá)模式分析

通過(guò)對(duì)葉片和根部進(jìn)行不同的處理，分析Bna-PHY在不同非生物逆境以及不同激素處理下的表達(dá)模式。葉片分別進(jìn)行低溫（Cold）、高溫（Hot）、脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（ET）和水楊酸（SA）處理，根分別進(jìn)行鹽脅迫（NaCl）和干旱脅迫（PEG）處理，測(cè)定處理后每個(gè)基因的TPM 值。如圖6所示，PHYA亞組在葉片中的表達(dá)受低溫和高溫的調(diào)控，特別是BnaCnng19880D基因在高溫條件下表達(dá)量明顯增強(qiáng)，對(duì)根部進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫處理沒(méi)有明顯變化；同樣在葉片中PHYB 基因表達(dá)受低溫和高溫誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)鹽脅迫處理后BnaA05g22950有輕微上調(diào)；在高溫處理下PHYC 亞組基因表達(dá)量有輕微變化；PHYE 亞組基因葉片在經(jīng)過(guò)低溫處理后表達(dá)量有改變，BnaA01g08940D基因在Cold_3h 中葉片表達(dá)量達(dá)到最高，BnaC01g40810D基因在Cold_6h中葉片有最高的表達(dá)量。整體來(lái)看，PHY基因家族的表達(dá)主要受溫度調(diào)控，并且在不同溫度條件下有響應(yīng)的基因不同，而其它非生物脅迫和激素處理對(duì)PHY基因表達(dá)的影響不明顯。

圖6 BnaPHY基因在不同非生物脅迫和植物激素處理下的表達(dá)Fig.6 Expression heat map of the BnaPHY genes under different abiotic stresses and plant hormone treatments

2.10 核盤(pán)菌接種后甘藍(lán)型油菜BnaPHY 基因表達(dá)模式分析

核盤(pán)菌是一種寄主范圍廣，能引起多種病害發(fā)生的植物病原菌，會(huì)對(duì)作物造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[40]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，PHY基因在植物抗病中起著重要的調(diào)控作用[41～43]。通過(guò)對(duì)BnaPHY基因在接種核盤(pán)菌后的甘藍(lán)型油菜葉片中的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，PHYA 中的BnaC08g42660D和BnaCnng19880D基因的表達(dá)明顯受核盤(pán)菌接菌處理的誘導(dǎo)，且在感病材料（Westar）中的表達(dá)量高于在抗病材料（ZY821）中的表達(dá)量；其它成員的表達(dá)則明顯受核盤(pán)菌接菌處理的抑制，但同樣在感病材料中的表達(dá)量高于在抗病材料中的表達(dá)量（圖7）。

圖7 抗感油菜品種接種核盤(pán)菌后BnaPHY基因的表達(dá)分析Fig.7 Expression of BnaPHY gene after infection with Sclerotinia sclerotiorum

2.11 甘藍(lán)型油菜BnaPHY 基因在春化處理中表達(dá)模式分析

為了分析BnaPHY在春化處理下的表達(dá)模式，我們利用油菜發(fā)育表達(dá)資源網(wǎng)站（ORDER；http://order.jic.ac.uk）對(duì)甘藍(lán)型油菜BnaPHY基因在春化處理（播種后22～64 d）和不同發(fā)育階段（苗期：春油菜0～72 d，冬油菜0～83 d；蕾薹期：春油菜72 d以后，冬油菜83 d 以后）中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，得到春油菜（Westar）和冬油菜（Tapidor）在春化和不同發(fā)育階段莖尖和葉片中BnaPHY的表達(dá)值。如圖8 所示，春、冬油菜莖尖和葉品中PYHB 亞組成員的表達(dá)量在春化處理過(guò)程中均明顯地下降，春化處理結(jié)束后則急劇上升然后回落；PHYC 和PHYE 亞組成員則相反，其表達(dá)量在春化處理過(guò)程中顯著上升，春化處理結(jié)束后則有小幅回落，然后大幅升高再逐漸回落。春化處理過(guò)程中，PHYA 中的BnaCnng19880D和BnaA06g05470D的表達(dá)量在春、冬油菜莖尖和葉片中均明顯地上升，而B(niǎo)naC08g42660D的表達(dá)量在葉片中明顯地下降，在莖尖中無(wú)明顯變化；春化處理結(jié)束后，BnaA06g05470D和BnaC08g42660D的表達(dá)量在春、冬油菜莖尖中有小幅度的上下波動(dòng)，但在葉片中則快速上升，然后回落；而B(niǎo)naCnng19880 D的表達(dá)量在冬油菜莖尖中則明顯回落，然后急劇升高，在春油菜的莖尖中卻無(wú)回落，蕾薹期急劇升高然后回落。春化處理結(jié)束后，BnaCnng19880D的表達(dá)量在春、冬油菜的葉片中變化趨勢(shì)大體一致，均是先小幅度上升，然后回落。

圖8 春油菜（Westar）、冬油菜（Tapidor）春化過(guò)程中BnaPHY基因的表達(dá)Fig.8 Expression profiles of BnaPHY genes during vernalization in the spring-type（Westar）and winter-type（Tapidor）rapeseed cultivar

3 討論與結(jié)論

PHY 蛋白參與植物感溫。PHYB 不僅作為光受體感受光信號(hào)，還作為傳感器感知外界溫度的變化[44,45]。高溫下PHYB 促進(jìn)PIF4 蛋白的積累，從而調(diào)控與熱響應(yīng)有關(guān)基因的表達(dá)[46]；低溫下PHYB 間接參與CBF 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，提高植物的抗凍能力[47]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜在短期內(nèi)的高、低溫處理下PHYA 和PHYB均被誘導(dǎo)表達(dá)；PHYC和PHYE 則主要受低溫誘導(dǎo)。而春化處理期間PHYB的表達(dá)量明顯被抑制，其它亞組的表達(dá)量則基本呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明甘藍(lán)型油菜PHY基因在高、低溫環(huán)境以及不同時(shí)間長(zhǎng)短的低溫環(huán)境下的應(yīng)答調(diào)控功能存在一定的分化，具體基因的功能可以根據(jù)需要，改變基因的表達(dá)，進(jìn)行驗(yàn)證。

在生物脅迫中，PHY 蛋白可以直接調(diào)控抗病、抗蟲(chóng)的基因表達(dá)。PHY基因通過(guò)影響水稻體內(nèi)（水楊酸和茉莉酸兩種激素抗病途徑）有關(guān)基因的表達(dá)量，來(lái)調(diào)控對(duì)稻瘟菌的抗性。此外光敏色素還可通過(guò)調(diào)控茉莉酸的信號(hào)途徑和合成代謝，來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)蟲(chóng)害的抗性[33]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)甘藍(lán)型油菜PHY基因的表達(dá)均受核盤(pán)菌的顯著抑制，兩個(gè)PHYA 成員BnaC08g42660D和BnaCnng19880 D的表達(dá)則受核盤(pán)菌的顯著誘導(dǎo)。不同于以往報(bào)道，甘藍(lán)型油菜PHY基因?qū)岳蛩岷退畻钏釤o(wú)明顯響應(yīng)，說(shuō)明甘藍(lán)型油菜PHY可能是通過(guò)其它信號(hào)路徑來(lái)響應(yīng)和調(diào)控核盤(pán)菌抗性的，具體調(diào)控方式還有待研究。

其它植物中對(duì)PHY基因的研究報(bào)道已有很多，比如在擬南芥和水稻中就分別發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)AtPHY基因和3 個(gè)OsPHY基因，玉米有6 個(gè)，小麥（Triticum aestivum）有9 個(gè)[48]，馬鈴薯有5 個(gè)[49]。本研究在甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥中分別鑒定了11 個(gè)、6 個(gè)、5 個(gè)、5 個(gè)、10 個(gè)和9個(gè)PHY家族基因。生物信息學(xué)分析表明，PHY基因結(jié)構(gòu)在蕓薹屬植物進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。在基因表達(dá)譜分析中甘藍(lán)型油菜PHYA 的BnaCnng19880D和BnaA06g05470D基因受高溫和低溫調(diào)控，BnaCnng19880D接種后又受核盤(pán)菌的顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明甘藍(lán)型油菜PHY基因在功能上存在一定的功能冗余，同時(shí)也發(fā)生了功能分化。本研究為進(jìn)一步了解甘藍(lán)型油菜PHY家族基因在響應(yīng)光、逆境脅迫的生物學(xué)功能提供了參考。