陳樹吾，姚一凡，張 蘭，劉翊中，鐘 文，喬自林，楊 琨*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

缺氧是誘發(fā)低氧性肺動脈高壓（HPH）最重要的病理因素，HPH主要發(fā)病環(huán)節(jié)為低氧性肺血管收縮反應(yīng)（HPV）和低氧性肺血管重塑（HPVR）[1-2]。肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）的遷移和增殖可能會導(dǎo)致肺動脈血管重塑[3]。

牦牛一般生活在海拔3 000～5 000 m的區(qū)域。作為高原地區(qū)特有的牛種，牦牛肺臟微動脈中膜肌層厚度與血管直徑比例較小，肺動脈的構(gòu)造不僅能促進氣體交換，還能預(yù)防肺動脈高壓[4]。

成纖維細(xì)胞生長因子受體2（Fibroblast growth factor receptors 2,FGFR2）是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的重要分子和受體[5]。研究表明，在缺氧條件下，F(xiàn)GFR2會促進細(xì)胞的遷移和侵襲[6]，但截至目前，低氧引起FGFR2表達升高的信號通路還不是很清楚。本研究探討低氧條件PAMSCs對FGFR2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM/F12、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、0.25%胰蛋白酶溶液（蘭州百靈生物技術(shù)有限公司）、胎牛血清（gibco）、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning）、EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）、TRIzolTMReagent（Thermo），2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本試驗所選取的牦牛PASMCs是本課題組前期所分離并培養(yǎng)。將PASMCs從液氮中取出，放置于37 ℃溫水中快速搖晃直至完全融化，牦牛PASMCs在含有15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，完全貼壁后，轉(zhuǎn)移到37 ℃、1%O2、5%CO2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并開始計時。

1.2.2 細(xì)胞總RNA的提取 在低氧條件下培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、60 h后，迅速棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，吸去參與PBS。加入2 ml TRIzol試劑，反復(fù)在細(xì)胞瓶中吹打，室溫放置5 min以徹底解離蛋白復(fù)合體。將混合物裝入2個無菌無RNA酶的1.5 ml PE管中，加入200 μl氯仿使其與TRIzol混勻，用力搖晃20 s，室溫靜置5 min，12 000×g，4 ℃ 離心，10 min，吸取上層水相到新的無菌無RNA酶PE管中，加入500 μl 100%異丙醇到水相中，室溫放置10 min用來沉淀RNA。12 000×g，4℃離心，5 min，棄沉淀，用DEPC水配制的1 ml 75%乙醇沖洗RNA沉淀。將乙醇中的RNA 7 500×g，4℃離心，5 min，然后吸去乙醇，室溫干燥RNA沉淀5～8 min。加入30～40 μl DEPC水溶解徹底RNA沉淀。用2 μl RNA測量所提RNA樣品A260/A280的OD值。

1.2.3 RNA樣品反轉(zhuǎn)錄 去除gDNA反應(yīng)體系如表1所示。將樣品振蕩混勻后離心，再放入PCR儀中42 ℃ 2 min進行基因組DNA去除反應(yīng)，然后低溫放置加入反轉(zhuǎn)錄試劑。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程如表2所示，混勻離心后將樣品在PCR儀中37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s進行變性、退火反應(yīng)，程序結(jié)束后將樣品存放于-20 ℃保存。

表1 去除gDNA反應(yīng)體系

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程

1.2.4 Real Time PCR 利用Primer-BLAST根據(jù)目的基因FGFR2 Gene ID：102270743和ACTB Gene ID：102286048 設(shè)計所需要的引物（表3），并在湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

表3 引物序列信息

利用ABclonal的2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix實時熒光定量對目的基因進行檢測。反應(yīng)體系見表4，反應(yīng)條件見表5。在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀中進行RT-qPCR反應(yīng)，數(shù)值均用內(nèi)參ACTB進行標(biāo)準(zhǔn)化。RT-qPCR結(jié)果采用2-ΔΔCt運算方法進行分析。利用GraphPad Prism 8分析目的基因的差異性。

表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系

表5 熒光定量PCR反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肺動脈平滑肌細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后置于顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)清晰，生長狀態(tài)良好，可用于后續(xù)試驗（圖1）。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

2.2 提取總RNA的純度分析

將提取的RNA進行純度分析，所有樣品OD值均在1.8～2.0之間，可用于后續(xù)試驗（表6）。

表6 樣品純度檢測

2.3 不同低氧時間PASMCs中FGFR2基因表達量分析

由圖2和圖3可知，擴增反應(yīng)結(jié)束后，ACTB和FGFR2基因的擴增曲線在不同低氧時間PASMCs中均呈現(xiàn)完好的“S”形，斜率較高，拐點清晰，未出現(xiàn)雜亂條帶；溶解曲線均呈單峰，且Tm值附近無明顯雜峰，各樣本峰值接近，無雜亂帶，無引物二聚體，符合試驗要求。

圖2 ACTB基因的擴增曲線與溶解曲線

圖3 FGFR2基因的擴增曲線與溶解曲線

圖3 （續(xù)）

在不同低氧時間PASMCs中FGFR2的mRNA相對表達量在不同時間段有顯著變化（P＜0.01）。由圖4可知，F(xiàn)GFR2在常氧、低氧不同時間點6 h、12 h、24 h、48 h、60 h均有表達，在低氧6 h、12 h與常氧無明顯差別，24 h后FGFR2表達量開始增長，到48 h達到最高，60 h開始有所下降。

圖4 不同低氧時間PASMCs中FGFR2基因的表達情況

3 分析討論

肺動脈高壓（PAH）最重要的病理因素是缺氧，它能引起許多內(nèi)源性細(xì)胞因子和活性物質(zhì)的異常釋放，導(dǎo)致血管收縮和平滑肌細(xì)胞增殖[7]。缺氧明顯促進PASMCs增殖，慢性缺氧通過增強PASMC的增殖和收縮能力以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+（[Ca2+]i）水平來提高pH值[8]。

牦牛的肺在構(gòu)造上和低海拔動物的肺不同。牦牛肺的血-空氣屏障比低海拔動物要薄，可促進氣體交換中氧的擴散[9]。以牦牛為突破口來研究低氧條件對肺動脈平滑肌的影響具有重要意義。本試驗通過對牦牛肺動脈平滑肌細(xì)胞進行不同時間低氧培養(yǎng)，觀察FGFR2基因表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低氧條件下，隨著時間的增長，F(xiàn)GFR2 mRNA表達量逐漸增加。這說明PAMSC在低氧情況下是FGFR2產(chǎn)生的一個重要來源。同時，低氧刺激FGFR2表達增加可能是通過FGFR2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控達到的。成纖維細(xì)胞生長因子一族具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化功能的活性多肽，它們在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合等病理情況下具有重要意義。有研究表明，慢性低氧時，F(xiàn)GFR2參與了肺血管收縮及血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)[10]。

4 結(jié)論

試驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2基因在牦牛肺動脈平滑肌細(xì)胞低氧培養(yǎng)中隨著時間的增長，其表達量呈遞增趨勢。與相關(guān)文獻結(jié)合進行分析，F(xiàn)GFR2基因在牦牛肺動脈平滑肌細(xì)胞低氧適應(yīng)過程中起著重要作用，未來有望成為抗低氧環(huán)境的相關(guān)基因，但其作用的具體分子機制尚不明，有待進一步研究。