郭姝媛，吳良煥，劉香健，王博，于濤

（1 中國科學院深圳先進技術(shù)研究院，深圳合成生物學創(chuàng)新研究院，合成生物化學研究中心，廣東 深圳 518055； 2 中國科學院深圳先進技術(shù)研究院，深圳合成生物學創(chuàng)新研究院，中國科學院定量工程生物學重點實驗室，廣東 深圳 518055）

當前，隨著工業(yè)制造技術(shù)的進步，全球的精細化工產(chǎn)品已達7萬多種［1］，不僅能夠滿足人們的日常所需，同時也推動了經(jīng)濟的飛速發(fā)展。但是，大規(guī)模的化工生產(chǎn)導致化石資源（如煤炭、石油等）短缺，環(huán)境污染（如溫室效應、空氣污染等）加重，極大限制了未來經(jīng)濟的快速、綠色、可持續(xù)發(fā)展，打破了地球原有的生態(tài)平衡，威脅到人類的正常生活。因此，迫切需要發(fā)展綠色制造手段，彌補化工生產(chǎn)的不足，輔助推動傳統(tǒng)工業(yè)制造大變革［2］。20 世紀伊始，生物制造被廣泛應用于化工、醫(yī)藥領(lǐng)域，已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)乙醇、丙酮等常見化工產(chǎn)品或抗生素等藥品的生物轉(zhuǎn)化。隨著分子生物學技術(shù)和發(fā)酵工程領(lǐng)域的發(fā)展，利用常規(guī)生物系統(tǒng)，結(jié)合基因工程化改造和多樣化的發(fā)酵手段，高效利用一碳化合物（甲烷、甲酸、甲醇與二氧化碳等）生物合成高附加值化學品，逐漸成為生物制造領(lǐng)域的研究熱點。

一碳底物（one-carbon，C1）是一類具有單個碳原子的化合物，可分為：氣態(tài)C1化合物，包括甲 烷（methane， CH4）、 二 氧 化 碳（carbon dioxide， CO2）、 一 氧 化 碳（carbon monoxide，CO）；液態(tài)C1化合物，包括甲醇（methanol，CH3OH）、 甲 醛（formaldehyde，HCOH）、甲 酸（formate，HCOOH）［3］。上述一碳底物都具有來源廣泛、制備容易、價格低廉的特點，各自的特點決定了其在生物制造領(lǐng)域的應用前景。首先，基于CO 的研究，大多聚焦以合成氣作為底物（CO 為主，含有H2、CO2等的混合氣體），利用氣態(tài)有氧或無氧發(fā)酵，實現(xiàn)化合物的生產(chǎn)［4］。但是，目前該方式存在的問題有產(chǎn)品種類較少（如乙醇、乙酸、2，3-丁二醇），產(chǎn)量較低，所用菌株多為楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii），不利于工程化改造［5］，因此本文不做重點討論。CH4和CO2作為溫室效應的主要氣體，高效利用二者不僅可以緩解能源問題，還可以緩解溫室效應，是當前研究的熱點。但是，由于CO2本身較弱的親電性而不易被激活，非自養(yǎng)生物在以CO2作為C1底物進行生物轉(zhuǎn)化時，面臨著能量供應缺乏、代謝供應不足、轉(zhuǎn)化效率低、高能耗等多種問題［3］，因此，當前的研究大多聚焦于提高固碳效率［6-7］，CO2的催還還原［8］，CO2和甲酸的共應用［7-8］等方面，力求實現(xiàn)非自養(yǎng)微生物能夠高效利用CO2生長，而僅以CO2作為碳源和能源進行化學品的高效生產(chǎn)鮮有報道。與CO2相比，甲烷作為天然氣的主要成分，其本身富含能量、具有更強的還原性，在生物轉(zhuǎn)化過程中能夠獲得更高的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，美中不足，氣態(tài)的甲烷不易存儲和運輸，且生物發(fā)酵過程中，氣液界面物質(zhì)交換的低速傳遞限制了其高效的生物利用。甲酸和甲醇均可來源于甲烷的氧化、劣質(zhì)煤炭和生物廢料的轉(zhuǎn)化、CO2的還原等方式，二者來源豐富且富含高能，是生物轉(zhuǎn)化的理想原材料［8-9］。相比于價格較為昂貴的甲酸，甲醇作為全球五大商品之一，其制備方式容易且多樣化［10］，使得其成本日漸低廉，逐漸成為上述C1化合物中最具工業(yè)化應用潛力的底物原材料，因而大量研究聚焦于甲醇的生物轉(zhuǎn)化。因此，針對豐富的C1底物，挖掘并構(gòu)建高效的微生物細胞工廠，是推進C1化合物生物利用的關(guān)鍵。

甲基營養(yǎng)型微生物（methylotrophs）是一類能夠利用C1化合物（甲醇、甲烷、甲酸和其他甲基化物質(zhì)）作為唯一碳源和能源進行生長的微生物［11］，大致可分為兩類：天然甲基營養(yǎng)型微生物和合成甲基營養(yǎng)型微生物。天然甲基營養(yǎng)型微生物可以通過自身的代謝途徑實現(xiàn)對C1化合物的利用，而合成甲基營養(yǎng)型微生物是結(jié)合豐富的基因編輯手段，改造模式微生物，使其利用C1化合物高效生產(chǎn)目標產(chǎn)物。因此，探尋并發(fā)掘天然的甲基營養(yǎng)型微生物，解析其C1化合物的代謝途徑，不僅有利于化合物的生產(chǎn)，也為后續(xù)打造合成甲基營養(yǎng)型微生物奠定基礎(chǔ)；打造合成甲基營養(yǎng)型微生物，不僅有利于拓寬C1底物的利用范圍，增強C1底物的利用率，而且有利于增加C1底物生物制造可行性，二者相輔相成。

因此，本文結(jié)合現(xiàn)有的研究成果，介紹了天然甲基營養(yǎng)型微生物利用甲醇、甲烷、甲酸和二氧化碳作為底物進行生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶和代謝途徑，并概括了據(jù)此形成的多種化學品。其次，介紹了基于大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）3 種常見的微生物構(gòu)建合成甲基營養(yǎng)型微生物的多種形式及相應產(chǎn)物；最后，探討了當前重點研究的CO2、CH3OH、HCOOH 3 種C1底物進行生物轉(zhuǎn)化所面臨的瓶頸與挑戰(zhàn)，以期為后續(xù)的研究提供方向。

1 天然甲基營養(yǎng)型微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)

目前，研究發(fā)現(xiàn)多種天然甲基營養(yǎng)型微生物，通過自身的代謝途徑實現(xiàn)對一碳化合物的利用。整體代謝網(wǎng)絡(luò)大致上可分為3個模塊：一碳底物的氧化模塊（即甲烷、甲醇、甲醛的氧化）、同化模塊（即C1化合物進入中心代謝的途徑）、異化模塊（即甲烷等一碳物質(zhì)最終轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2）［12］。甲烷、甲醇、甲酸和CO24 種一碳底物的代謝網(wǎng)絡(luò)一脈相承，甲烷和甲醇經(jīng)相應的氧化酶（如甲烷氧化酶、甲醇氧化酶等）轉(zhuǎn)變后，均會形成甲醛，甲醛作為大多數(shù)甲基營養(yǎng)型微生物一碳代謝網(wǎng)絡(luò)的中心代謝物，既可介導同化途徑實現(xiàn)C1底物的生物利用，也可氧化形成甲酸，并經(jīng)過甲酸脫氫酶生成CO2，有助于微生物脫毒（圖1）。其中，同化途徑作為主要的C1代謝模式，有氧條件下，主要包括

圖1 天然C1利用途徑Fig.1 C1 metabolic networks of native methylotrophs

續(xù)表

續(xù)表

1.1 一碳化合物的氧化模塊

1.1.1 甲烷的氧化

甲烷氧化菌中存在的甲烷氧化酶（methane monooxygenase，MMO）可以轉(zhuǎn)變甲烷為甲醇，主要有兩種形式：微粒型MMO（particulate MMO，pMMO）和可溶型MMO（soluble MMO，sMMO）［54］。前者廣泛存在于甲烷營養(yǎng)菌中，是一種膜結(jié)合蛋白，但是該酶反應所需的輔因子尚未清晰；后者僅存在于特定類型的甲烷氧化菌中，需要NADH作為輔因子提供還原力；同時具有兩種MMO 的甲烷氧化菌，其MMO 的表達受到胞內(nèi)銅離子濃度的影響，銅離子濃度高，主要表達pMMO，銅離子濃度低，主要表達sMMO［55］。研究表明在細胞中表達pMMO 和sMMO 后，pMMO 對甲烷的氧化效率更高，細胞生長率強于sMMO［54］。

1.1.2 甲醇的氧化

甲醇氧化為甲醛是甲醇生物利用的限速步驟。前期研究表明，天然的甲基營養(yǎng)型微生物將甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹?，主要? 種甲醇利用酶：NAD 依賴的甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，MDH）、吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）依賴的MDH、N，N-二甲基-4-亞硝基苯胺-氧化還原酶（N，N-dimethyl-4-nitrosoaniline oxidoreductase，MNO）及醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）［11］。前3 種存在于細菌中，AOX 主要存在于甲醇酵母當中。PQQ 依賴的MDH 主要存在于革蘭氏陰性菌中（如Methylophilus methylotrophus），還原型PQQ（PQQH2）首先轉(zhuǎn)移2 個電子至呼吸鏈上的細胞色素CL，然后經(jīng)由細胞色素CL 傳遞2 個電子至最終電子受體，即氧化酶［56］，此時該酶轉(zhuǎn)化O2為水。天然甲醇酵母利用AOX 將甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛，在此過程中，O2轉(zhuǎn)變?yōu)楦碑a(chǎn)物過氧化氫，有毒的過氧化氫被催化酶（catalase，CTA）分解成水和O2；值得注意的是AOX 和CTA 均定位在過氧化物酶體中，甲醇氧化過程也發(fā)生在過氧化物酶體中［57］。甲醇氧化酶-MNO 存在于部分革蘭氏陽性甲基營養(yǎng)菌（如Amycolatopsis、Mycobacterium）中［58］，與NADPH 結(jié)合緊密［59］，結(jié)構(gòu)與Ⅲ型乙醇脫氫酶類似［60］。NAD 依賴的MDH 主要來自于革蘭氏陽性甲基營養(yǎng)菌（如Bacillus），轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生NADH，可存儲于細胞中用于其他的代謝活動［56］。此外，當細胞內(nèi)甲醛被快速消耗并維持在較低水平時，NAD-MDH 活性更佳，對甲醇的氧化能力更 強［56］。因 此，相 比 于PQQ-MDH 和AOX，NAD-MDH 在有氧和無氧條件下均具有氧化活性且反應機制容易，具有更加高效的能量轉(zhuǎn)化能力［61］，已被廣泛應用于合成甲基營養(yǎng)型微生物代謝底盤的構(gòu)建。

當前，來自于B.methanolicus的NAD-MDH［62］已被成功用于E.coli甲醇代謝底盤的構(gòu)建［63-64］。該酶活性依賴于內(nèi)源的激活蛋白（anendogenousactivator，ACT），它可促進MDH 對甲醇的利用，但酶本身對于甲醇的親和力較低，而對乙醇的親和力更高［56］，因而所構(gòu)建的工程菌甲醇轉(zhuǎn)化率較低。為了進一步提高甲醇轉(zhuǎn)化率，眾多研究聚焦于該酶的篩選、挖掘、工程化改造，以期得到高效的NAD-MDH。James C.Liao 實 驗 室［65］2016 年 報 道 了 來 源 于Cupriavidus necatorN-1 的NAD 依賴的甲醇脫氫酶（Mdh2），該酶來源于革蘭氏陰性菌，可產(chǎn)生NADH，對甲醇的親和力明顯高于B.methanolicus，且不依賴于內(nèi)源激活蛋白，特異性較強；隨后，作者通過多輪易錯PCR 構(gòu)建Mdh2突變體文庫，結(jié)合高通量篩選的方式，得到的Mdh2 CT4-1 對甲醇的親和力比原先提高6 倍，Kcat/Km［L/（mol·s）］達到9.3（野生型為1.6），具有更好的催化活性和轉(zhuǎn)化效率。Whitaker 等［66］2017 年在E.coli中分別引入來自革蘭氏陽性菌B.stearothermophilus的BsMdh和B.methanolicus的BmMdh2，發(fā)現(xiàn)BsMdh具有更強的甲醇轉(zhuǎn)化能力，通過體內(nèi)實驗表明BsMdh 的活性大約為16 mU/mg，而BmMdh2 的活性僅為8 mU/mg。此外，David R.Liu 實驗室［67］利用噬菌體輔助的非連續(xù)進化的方式篩選BmMdh2 突變體，最終得到的BmMdh2 Q5L-A164P-A363L 突變體活性提高了3.5 倍，Kcat/Km［L/（mol·s）］達到1.08（野生型為0.23），但是低于CnMdh2 CT4（4.77）；隨后，作者進一步通過體內(nèi)同位素標記實驗證明，在該酶的作用下，經(jīng)過13C 標記的甲醇進入中心碳代謝的比例高于對照菌株（BmMdh wt、CnMdh2 CT4-1）2 倍多，說明雖然突變體活性低于Mdh2CT4-1，但是體內(nèi)的甲醇利用率明顯提高。

1.1.3 甲醛的氧化

甲醛是甲醇和甲烷作為C1底物進入中心代謝進行生物合成的中間代謝物，高濃度甲醛會抑制細胞生長，因此高效的甲醛代謝系統(tǒng)可以促進細胞對甲醇和甲烷的利用。大多細胞具有自身的甲醛氧化酶（formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)ADH），可氧化甲醛形成甲酸，再經(jīng)由甲酸脫氫酶形成CO2，完成甲醛代謝，促進微生物有效脫毒［61］。根據(jù)所需的輔助因子，F(xiàn)ADH 可分為4 類：①需要NAD 作為輔助因子，包括僅以NAD 作為輔因子的FADH［68］、NAD-GSH 雙 輔 因 子FADH［57，69］、NAD-硫醇依賴性FADH［70］；②不需要輔因子，可直接氧化甲醛；③細胞色素輔助的FADH（如PQQ-FADH），該類FADH 通常不是甲醛特異性酶，源自甲基營養(yǎng)菌，活性較低［70］；④四氫葉酸（tetetrahydrofolate，THF）、四氫甲氨蝶呤（tetrahydromethanopterin，H4MPT）作為輔助因子，該途徑是最常見的甲醛氧化途徑，廣泛存在于多種甲基營養(yǎng)菌中。此過程中，以THF 或H4MPT 作為輔因子的微生物，甲醛經(jīng)過亞甲基-THF（H4MPT）-脫 氫 酶［methylene-THF（H4MPT）dehydrogenase，Mtd］、亞甲基-THF（H4MPT）-環(huán)化酶［methenyl-H4MPT cyclohydrolase，Mch］，分別形成帶有THF和H4MPT 的甲?；衔?；前者經(jīng)過甲酰-THF合成酶（formyl-THF synthase，F(xiàn)hs）形成甲酸；后者經(jīng)過甲酰-H4MPT 轉(zhuǎn)移/水解復合體［formyl-THF（H4MPT）transferase/hydrolase-complex， Fhc］形成甲酸［70］?？傊?，由于甲醛毒性對微生物正常生長的影響，其體內(nèi)均形成多種代謝甲醛的形式，為C1底物的生物利用提供了更多有效的研究策略。

1.1.4 甲酸的氧化

甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）廣泛存在于多種微生物中，可氧化甲酸為CO2，是細胞脫毒的最后一步，也是C1底物異化途徑的最后一步。目前發(fā)現(xiàn)的甲酸脫氫酶可利用THF、NAD、NADP［71］、細胞色素等作為輔助因子，所生成的NADH或NADPH 可用于細胞其他的生命活動；以THF 作為輔因子的甲酸營養(yǎng)菌，通過rACoA途徑即可實現(xiàn)微生物利用甲酸進行生長。

1.2 天然甲基營養(yǎng)型微生物的代謝途徑

1.2.1 RuMP和XuMP途徑

RuMP、XuMP 雖然存在于不同類型的甲基營養(yǎng)型微生物中，但本質(zhì)上十分相似，都是甲醛結(jié)合五碳糖進行碳原子重排，一碳分子經(jīng)由糖酵解途徑完成碳流向下傳遞的過程，而五碳糖再生保證循環(huán)持續(xù)運轉(zhuǎn)［61］。前者利用5-磷酸核酮糖（ribulose 5-phosphate，Ru5P）作為底物，甲醛經(jīng)由己糖磷酸合成酶（hexulose phosphate synthase，HPS）轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸己酮糖（hexulose 6-phosphate，H6P）后，再通過磷酸己糖異構(gòu)酶（phosphohexulose isomerase，PHI）轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖（fructose-6-phosphate，F(xiàn)6P）進入中樞碳代謝。后者利用5-磷酸木酮糖（xylulose 5-phophate，Xu5P）作為底物，二羥丙酮合成酶（dihydroxyacetone synthase，DAS）可將甲醛和Xu5P 轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）和二羥丙酮（dihydroxyacetone，DHA），DHA 可利用二羥丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase，DHAK）進一步轉(zhuǎn)化成DHAP，從而進入中心代謝。

RuMP途徑中，3 mol甲醛形成1 mol丙酮酸時，伴隨G3P、Xu5P 和4-磷酸赤蘚糖（erythrose-4-phosphate，E4P）的形成；此外，已有研究報道，B.methanolicus［72］和P.pastoris［73］中均 存 在兩 種酶，1，7-雙磷酸景天庚糖酶（sedoheptulose 1，7-bisphosphatase，SBP） 和 轉(zhuǎn) 醛 酶（transaldolase，TAL），前者可將1，7-雙磷酸景天庚糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸景天庚糖（sedoheptulose-7-phosphate，S7P），后者將F6P 和E4P 轉(zhuǎn)變?yōu)镾7P 和G3P；S7P 和G3P 經(jīng)由轉(zhuǎn)酮酶（transketolase，TKL）重新轉(zhuǎn)變?yōu)閄u5P 和5-磷酸核糖（ribose 5-phosphate，R5P），從而完成五碳糖的再生循環(huán)。因此，將磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway， PPP） 與RuMP 或XuMP相結(jié)合，加速五碳糖的再生，是提高C1底物利用率的常用策略，如Bennett等［74］通過表達多個PPP途徑的酶提高內(nèi)源Ru5P的含量，詳見表2。

表2 合成甲基營養(yǎng)型細胞工廠及其產(chǎn)物Tab.2 Chemicals produced by synthetic methylotrophs

續(xù)表

XuMP 途徑是甲醇酵母的主要甲醇代謝途徑，其中涉及的AOX、CTA 及DAS 均定位在過氧化酶體中，DAS 活性可被葡萄糖抑制，被甲醇所誘導［57］。由于甲醇酵母中，甲醇代謝主要發(fā)生在過氧化物酶體中，區(qū)室化作用有利于降低甲醛毒性，可顯著提高化合物產(chǎn)量，如番茄紅素［84］。當前，P.pastoris已被用于多種化合物和蛋白質(zhì)的生物合成（表1），如洛伐他?。?0］、透明質(zhì)酸［17］等；關(guān)于漢遜酵母的研究較少，如利用漢遜酵母生產(chǎn)青霉素［22］。最近，大連化物所的周雍進研究組［85］開發(fā)了高效的漢遜酵母基因編輯工具，能夠有效提高其同源重組效率，并利用其進行脂肪醇的生物合成研究。

表1 天然甲基營養(yǎng)型細胞工廠及其產(chǎn)物Tab.1 Chemicals produced by native methylotrophs

1.2.2 Serine途徑和GLRP途徑

廣義的絲氨酸途徑主要包括3 個部分：第1 部分是以C1化合物（甲烷、甲醇或甲醛）起始，經(jīng)過多級氧化反應，形成亞甲基-THF（CH2-THF）的中間產(chǎn)物。第2 部分是以甘氨酸（C2）起始，結(jié)合1 分子CH2-THF，形成絲氨酸（C3），C3化合物經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化后，形成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），隨后羧化引入1 分子CO2，形成C4化合物草酰乙酸（oxaloacetate，OAA），OAA 經(jīng)過蘋果酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)樘O果酸（C4）（malate，MAL）。經(jīng)過上述兩部分后，完成兩種C1化合物的利用。第3部分主要是乙醛酸的再生過程。MAL在蘋果酸硫激酶（malate thiokinase，MTK）的作用下，形成蘋果酸單酰-CoA。隨后蘋果酸單酰-CoA 被分解為C2化合物乙醛酸和乙酰CoA，乙醛酸經(jīng)過絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（serine glyoxylate aminotransferase，SGA）形成甘氨酸，從而構(gòu)成完整的絲氨酸循環(huán)［11］。

細胞中，乙酰CoA 參與多種生命活動，而經(jīng)典的乙醛酸循環(huán)［86］可以利用乙酰CoA 和OAA 作為底物，經(jīng)過檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）、順烏頭酸酶（aconitase，AT）和異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL），再生成琥珀酸和乙醛酸。但是，部分甲基營養(yǎng)菌（如M.extorquens）中缺乏異檸檬酸裂解酶，乙醛酸的再生是通過乙基丙二酰CoA 途徑（ethylmalonyl-CoA，EMC）完成的，該途徑也被稱為GLRP［11，86］。EMC 途徑不僅存在于天然甲基營養(yǎng)菌中，部分非甲基營養(yǎng)菌也擁有該途徑，如紅桿菌（Rhodobacter）和鏈霉菌（Streptomyces）。該途徑大約有10 步反應，中間產(chǎn)物涉及C2、C3、C4化合物，包括多種獨特的輔酶A中間體，可用于多種工業(yè)化合物的生產(chǎn)［87］，如聚羥基烷酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）、3-羥基丁酸（3-hydroxybutyrate，3-HB）［30］、3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）［36］等，見表1。

1.2.3 rACoAP途徑

許多天然的甲酸和甲烷營養(yǎng)菌中均存在還原型乙酰CoA 途徑，即Wood-Ljungdahl pathway，該類菌株可以利用甲酸作為唯一碳源和能源進行生長。該途徑中，以THF 作為輔助因子，甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)镃H2-THF 后，可以進一步轉(zhuǎn)化為5-甲基-THF。隨后，結(jié)合CO 和CoA 直接形成乙酰CoA，乙酰CoA 在丙酮酸合酶（pyruvate synthase，PC）的作用下，羧化結(jié)合1 分子CO2，最終形成丙酮酸［88］。在此過程中，不僅可以利用甲酸，同時可以結(jié)合2分子CO2（CO 可來源于CO2），具有充分的一碳利用能力。能量方面，雖然該過程第1步（甲酸轉(zhuǎn)化為甲酰-THF）需要消耗1分子ATP，但是隨后可產(chǎn)生NADPH 用于后續(xù)能量供應。目前，已有研究報道利用該途徑進行香葉醇的生物合成［53］。

1.2.4 CBB途徑和rPPC途徑

存在另一種廣義的CBB循環(huán)，又稱為還原型磷酸戊糖循環(huán)（reductive pentose phosphate cycle，rPPC），是甲酸營養(yǎng)菌（Cupriavidus necator）［8］和少數(shù)甲烷營養(yǎng)菌［89］的另一種固碳形式。甲酸氧化形成CO2后，結(jié)合1，5-二磷酸核酮糖（ribulose-1，5-bisphosphate，RuBP）在1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCo）的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)镚3P進入中心碳代謝途徑。但是，該途徑需要消耗過多的還原力和ATP，既不經(jīng)濟，也不利于微生物生長［88］。最近有研究報道，在P.pastoris中引入RuBisCO 和磷酸核酮糖激酶（phosphoribulokinase，PRK），首次實現(xiàn)天然甲醇酵母利用CO2作為唯一碳源即可生長［90］。

2 合成甲基營養(yǎng)型微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)

天然的甲基營養(yǎng)型微生物具有豐富的C1代謝酶和代謝途徑，理論上，據(jù)此構(gòu)建下游的生物合成途徑，即可實現(xiàn)微生物利用C1底物作為唯一的碳源和能源支撐生長并高產(chǎn)目標化合物。但是，由于天然的甲基營養(yǎng)型微生物存在數(shù)據(jù)庫資源和遺傳信息不完善、基因編輯工具缺乏與產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低下等問題，使C1底物大規(guī)模應用于工業(yè)生產(chǎn)這一目標至今沒有實現(xiàn)。因此，結(jié)合天然甲基營養(yǎng)型微生物中發(fā)現(xiàn)的C1代謝途徑，如RuMP、絲氨酸途徑，賦予模式微生物對C1化合物的高效利用能力，從頭構(gòu)建合成型甲基營養(yǎng)微生物，并實現(xiàn)目標化合物的高產(chǎn)，逐漸成為研究熱點。此外，近幾年的研究中，通過計算機設(shè)計全新的酶蛋白，打造人造C1代謝途徑，亦成為高效利用C1底物的又一有效策略。當前，大多數(shù)研究均在E.coli當中開展，僅有少量研究以C.glutamicum和S.cerevisiae作為研究對象，研究的主要內(nèi)容包括兩個：①以C1底物作為唯一碳源和能源支撐微生物快速生長，涉及的C1底物為甲醇、甲酸和CO2；②高效利用甲醇和CO2（甲酸輔助）進行生物合成。因此，本部分概括了上述3種模式生物作為研究對象，針對兩個主要研究內(nèi)容，所進行的代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生物合成探究。

2.1 大腸桿菌

目前，E.coli是研究最深入的原核模式生物，多種C1底物（甲醇、甲酸、CO2）的生物利用已經(jīng)在E.coli中陸續(xù)開展。其中，關(guān)于甲醇的研究成果最為豐富，涉及代謝途徑的挖掘、代謝底盤的改造與優(yōu)化、共培養(yǎng)底物的優(yōu)化、生物合成化合物等多個方面，并且已有研究報道E.coli可以利用甲醇作為唯一碳源和能源正常生長［91］。關(guān)于甲酸和CO2的研究成果相對較少，研究側(cè)重于甲酸或CO2的充分利用、已知代謝途徑的改造及新途徑的挖掘［92］，當前已經(jīng)實現(xiàn)E.coli可以利用甲酸［93］或CO2［94-95］作為唯一碳源生長，但是生長情況較弱，有待進一步提高。

2.1.1 甲醇

工程化改造E.coli，形成合成型甲醇營養(yǎng)菌的研究策略可以分為兩種：引入天然甲醇利用通路和打造全新的甲醇代謝途徑。前一種主要是通過引入或塑造天然存在的甲醇利用途徑（如RuMP、XuMP），結(jié)合代謝底盤的輔助改造，代謝流微調(diào)，底物和發(fā)酵條件優(yōu)化，目標產(chǎn)物合成途徑的構(gòu)建等，最終實現(xiàn)E.coli能夠在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長并合成目標產(chǎn)物；后一種主要是結(jié)合計算機輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)工程，發(fā)現(xiàn)能夠提升甲醇代謝能力或縮短已知代謝途徑的酶，從而打造全新的甲醇代謝途徑，彌補天然途徑中的不足，以期實現(xiàn)更高的甲醇利用效率，包括甲醇縮合循環(huán)（methanol condensation cycle， MCC）、 甲 醛 酶途徑（formolase，F(xiàn)LS）、合成型乙酰CoA 途徑（synthetic acetyl-CoA，SACA）、羥酰輔酶A裂解酶途徑（2-hydroxyacyl-CoA lyase，HACL）、修飾絲氨酸循環(huán)（modified serine cycle，MSC）（圖2）。

圖2 合成C1利用途徑Fig.2 C1 metabolic networks of synthetic methylotrophs

天然甲醇利用途徑在前面已經(jīng)有詳細的介紹，不再贅述。當前，大量研究聚焦于整合RuMP 于E.coli中，以期實現(xiàn)E.coli利用甲醇作為唯一碳源和能源支撐微生物生長；2015 年的研究通過在E.coli中整合多種不同來源的RuMP 中的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)來源于B.methanolicus菌株的MDH2、HPS、PHI能夠更好地利用甲醇［63］；2018 年的研究表明，通過增強甲醛的消耗，降低TCA 代謝，減少NADH 的產(chǎn)生可以促進甲醇利用［96］；隨后，通過在E.coli中加入甲醛感應元件，降低NADH 的產(chǎn)生，并加強Ru5P 的再生，進一步提高甲醇的利用［97］；2020 年8 月，Liao 團隊［91］發(fā)表在Cell上的文章，首次實現(xiàn)了甲醇作為唯一碳源支持E.coli生長，并且在8.5 h 中OD 值可達到2。上述研究從“零”到有實現(xiàn)了E.coli利用甲醇作為唯一碳源支撐微生物生長的能力。此外，已有眾多研究報道E.coli利用甲醇（葡萄糖或酵母提取物作為輔助碳源）進行生物合成，對底盤的改造均以RuMP途徑為基礎(chǔ)，包括柚皮素、乙醇、丙酮、琥珀酸、賴氨酸等，見表2，但是均未實現(xiàn)甲醇作為唯一碳源。值得關(guān)注的是，2018年Nature Communications首次報道了基于MSC 構(gòu)建合成型甲醇營養(yǎng)菌生成乙醇，此前大多改造均利用RuMP途徑，因而該文章是天然甲醇利用途徑的應用突破［79］。

最早的合成途徑來自Liao 實驗室的MCC 途徑，其將非氧化糖酵解（nonoxidative glycolysis，NOG）途徑和RuMP 途徑結(jié)合，利用體外無細胞體系實現(xiàn)甲醇的利用。該途徑中，F(xiàn)6P或X5P可通過一步反應直接生成乙酰磷酸，隨后轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，不僅避免丙酮酸脫羧所造成的碳損失，同時減少ATP 的消耗；但是至今沒有研究報道該途徑在體內(nèi)的應用情況。隨后，美國David Baker 實驗室設(shè)計并人工合成了以甲醛酶為核心的FLS 途徑，僅通過2 步即可實現(xiàn)甲醛到二羥丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）的轉(zhuǎn)化（消耗1 分子ATP），而RuMP 途徑中從甲醛到DHAP需要4步反應，因而該反應極大縮短了C1底物進入中樞代謝的步驟；同時，此途徑可以甲酸作為底物，經(jīng)過乙酰CoA 合成酶（acetyl-CoA synthase，ACS）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ACDH）轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹?，過程中需要消耗1 分子NADH［98］。2019 年報道了兩條合成途徑，一條來自天津工業(yè)生物技術(shù)研究所江會峰團隊［99］報道的SACA 途徑，通過計算設(shè)計合成的乙醇醛合成酶（glycolaldehyde synthase，GALS）、乙酰磷酸合成酶（acetyl-phosphate synthase，ACPS）可以通過三步反應快速轉(zhuǎn)化甲醛為乙酰CoA，不需要消耗ATP、無碳損失，可惜的是文章中僅在體外實驗中驗證了該途徑的作用，而在E.coli中沒有明顯的甲醇利用效果；另一條途徑來自美國Ramon 實驗室所設(shè)計的HACL 途徑，該實驗室篩選兩種酶，RuHACL和酰基輔酶A還原酶（acyl-CoA reductase，ACR），首次實現(xiàn)C1化合物甲醛至C2化合物乙醇酸（glycolate）的轉(zhuǎn)變，該途徑同樣可用甲酸為底物，經(jīng)由甲酰CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹?1］。

2.1.2 甲酸和二氧化碳

目前，E.coli主要是通過還原型甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，rGlyP）利用甲酸和CO2，僅有少量研究借助CBB循環(huán)實現(xiàn)一碳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。首先，rGlyP 可以利用甲酸和CO2兩種C1化

合物，代謝途徑整體結(jié)構(gòu)與rACoAP 類似，同樣是借助THF 作為輔助因子，通過引入THF 循環(huán)，從而實現(xiàn)甲酸和CO2的利用［8］。該途徑有3 個優(yōu)點：①僅通過一個酶，甘氨酸裂解酶復合體（glycine cleavage system，GCS）即可完成中間產(chǎn)物CH2-THF向C2甘氨酸的轉(zhuǎn)化，而rACoAP涉及眾多輔助酶且許多至今未知。②與絲氨酸途徑和CBB 途徑相比，該途徑更加經(jīng)濟節(jié)能，具有高效的甲酸利用能力；該途徑產(chǎn)生1 分子乙酰CoA 需要消耗6 分子甲酸，而前兩者分別需要11 分子甲酸和7 分子甲酸［8］。③該途徑的中間產(chǎn)物（甘氨酸、絲氨酸）與中心代謝關(guān)聯(lián)較少，不像rACoAP（乙酰CoA）和絲氨酸途徑（蘋果酸、乙醛酸等）的中間產(chǎn)物與多種代謝有密切聯(lián)系，因而可以避免考慮復雜的代謝流。2018年，Arren Bar-Even實驗室［100-101］通過在E.coli中構(gòu)建rGlyP，在體內(nèi)證明了該途徑可以利用C1底物支撐微生物生長。同年，Lee Sang Yup實驗室［102］在E.coli中引入rGlyP 和FDH（Candida boidinii），首次實現(xiàn)了E.coli僅利用甲酸和CO2即可輕微生長（不需要添加葡萄糖）。2020 年先后發(fā)表了兩篇文章，通過引入不同來源的酶構(gòu)建rGlyP，引入不同來源的FDH 達到提供能量和還原力的作用，均實現(xiàn)了E.coli利用甲酸作為唯一碳源支撐微生物生長；2020年初的文章中，利用ALE實現(xiàn)改造菌株在甲酸和CO2中生長的倍增時間不到8 h，生物量達到2.3 g CDW/mol 甲 酸［93］；Lee Sang Yup 實 驗室［103］2020 年中所發(fā)表的文章是2018 年工作的延續(xù)，作者進一步對底盤進行改造，引入多種來源的FDH 并調(diào)整胞內(nèi)細胞色素泛素氧化酶（bo3、bd-I）的表達水平，最終菌株僅以甲酸和CO2作為碳源，OD 能夠在450 h 達到7.38（1.3 L 發(fā)酵罐）。關(guān)于利用CO2作為主要碳源的研究較少，現(xiàn)有的兩篇通過在E.coli中引入CBB 循環(huán)固定CO2；2016 年Ron Milo實驗室首次實現(xiàn)E.coli利用CO2（丙酮酸作為輔助底物）合成中樞代謝的各種糖類物質(zhì)，此時能量部分由丙酮酸所介導的TCA循環(huán)所提供［94］；2019年，該實驗室利用CO2和甲酸一起作為底物，結(jié)合ALE，最終實現(xiàn)E.coli利用CO2作為唯一碳源支撐生長的目的，此時由甲酸氧化提供能量［95］。

此外，研究發(fā)現(xiàn)了幾種人工改造的合成型甲酸和CO2利用途徑，目前關(guān)于這些途徑的研究多聚焦于體外研究，沒有被大量應用于生物合成。大致可分為3類：

（1）甲酸和CO2作為共同底物 包括絲氨酸-蘇氨酸循環(huán)（serine-threonine cycle，STC）、丙酮酸-甲酸裂解酶（pyruvate formate-lyase，PFL）-蘇氨酸循環(huán)（PFL-threonine cycle，PTC）、酮丁酸-甲酸裂解酶（ketobutyrate formate-lyase，KBFL）循環(huán)（KBFL cycle，KBFLC）。其中，STC 類似與絲氨酸循環(huán)，THF 作為輔助因子，利用甲酸和固定CO2的方式與之相同，不同點在于OAA 裂解形成天冬氨酸而不是MAL；PTC 循環(huán)中甲酸的利用方式不同于STC 循環(huán)，不需要THF 作為輔助因子，甲酸和乙酰CoA 在PFL 的作用下直接形成丙酮酸；KBFLC 不同于上述途徑，丙酰-CoA 和甲酸在KBFL 的作用下2-酮丁酸，隨后固定無機碳源，終產(chǎn)物為乙醛酸（圖3）。

圖3 合成甲酸利用途徑Fig.3 Synthetic metabolic networks for formate utilization

（2）僅利用甲酸作為底物 如PFL-磷酸轉(zhuǎn)酮酶（phosphoketolase，PKT）循 環(huán)（PFL-PKT cycle，PPC），該途徑中，PKT 轉(zhuǎn)化Xu5P 為?；姿岷虶3P，酰基磷酸可以轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，從而和甲酸在PFL 的作用下形成丙酮酸；此外，甲酸可還原為甲醛，從而通過RuMP、FLS途徑代謝。

（3）僅以CO2作為底物 巴豆?；鵆oA-乙基丙二酰CoA-羥基丁酸酰基CoA（crotonyl-CoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH） 循環(huán)［104］。由于甲酸和CO2之間的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，賦予了上述途徑更加豐富的利用空間。

2.2 谷氨酸棒狀桿菌

目前，關(guān)于C.glutamicum的C1利用研究主要聚焦于甲醇的代謝。2013年Bott實驗室［105］研究發(fā)現(xiàn)，C.glutamicum內(nèi)源存在甲醇轉(zhuǎn)化為CO2的一系列酶，乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADHA）可以催化甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹兹┛捎梢胰┟摎涿福╝cetaldehyde dehydrogenase，ALD）或以硫醇作為輔因子的FADH（adhE）轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿幔S后甲酸經(jīng)內(nèi)源FDH（fdhF）轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2；該文章首次完整展示了C.glutamicum中甲醛脫毒的所有基因，為后續(xù)的改造研究奠定了基礎(chǔ)。隨后的研究中，通過敲除adhE和ALD，阻斷C.glutamicum中甲醇至CO2的轉(zhuǎn)化途徑，并引入RuMP，以葡萄糖或核糖輔助甲醇利用，利用甲醇合成尸胺［75］；以木糖和甲醇作為主要碳源，生物合成谷氨酸［76-77］；2020年孫際賓團隊［76］通過適應性進化，將菌株所耐受的甲醇濃度提高到15 g/L，且甲醇與木糖利用率為7.04∶1；大大提高了甲醇的利用效率。但是，截至目前，并沒有研究實現(xiàn)C.glutamicum以甲醇作為唯一碳源和能源支撐其生長。

2.3 釀酒酵母

作為真核模式生物，S.cerevisiae具有詳細的基因信息，完善的數(shù)據(jù)庫和多樣的基因編輯工具，被廣泛應用于細胞工廠的構(gòu)建。由于S.cerevisiae本身對甲醇和甲醛具有更高的耐受性［106］，因此S.cerevisiae在C1的生物轉(zhuǎn)化中具有廣闊的應用前景。當前，僅有少量文獻報道了關(guān)于合成型“甲醇酵母”的研究，研究內(nèi)容停留在S.cerevisiae的菌株選擇和生長兩個方面，沒有實現(xiàn)任何一種C1化合物作為唯一底物原材料即可支撐微生物正常生長目的。南京工業(yè)大學姜岷實驗室［107］首次在S.cerevisiae中引入RuMP 和XuMP，賦予其對甲醇的利用能力，但是其在甲醇當中的生長能力有待提高。澳大利亞的Paulsen 實驗室［108］結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，對比了兩類常見的酵母品系（CEN.PK 和S288C）在甲醇當中的生長情況，發(fā)現(xiàn)CEN.PK 更適合用于構(gòu)建合成型“甲醇酵母”。隨后，Paulsen實驗室［109］發(fā)表在Nature Communications 的研究，通過對S.cerevisiaeCEN.PK113-5D 進行適應性進化，發(fā)現(xiàn)其具有天然的甲醇利用能力，進化后可在含有甲醇和酵母提取物的培養(yǎng)基中生長。此外，Arren Bar-Even 實 驗室［110］研究 表明，rGlyP 在S.cerevisiae中具有很強的甲酸代謝能力，該研究首次報道了S.cerevisiae通過rGlyP 利用甲酸和CO2。因此，根據(jù)已有的C1 代謝途徑重構(gòu)S.cerevisiae代謝底盤，并結(jié)合ALE，能夠進一步發(fā)掘其對C1底物的利用潛力［111］。

3 結(jié)語

本綜述總結(jié)了基于天然和合成型甲基營養(yǎng)型微生物利用C1底物進行生物合成的主要代謝網(wǎng)絡(luò)及現(xiàn)有產(chǎn)品。已發(fā)掘的天然甲基營養(yǎng)菌大多直接利用甲醇或CO2作為C1底物，通過自身所具有的一磷酸核酮糖途徑、絲氨酸途徑和還原型乙酰CoA途徑，完成C1底物向中樞代謝的轉(zhuǎn)運，產(chǎn)物主要為氨基酸類（如絲氨酸、賴氨酸、谷氨酸等）、PHA 或PHB；天然甲醇酵母主要利用一磷酸木酮糖途徑，產(chǎn)物除了氨基酸和小分子有機酸，還有他汀類藥物。雖然天然甲基營養(yǎng)型微生物能夠高效利用C1底物，但是缺乏完善的基因組信息和基因編輯工具，因而在進一步提升底物利用率、目標物產(chǎn)量及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率方面，都具有較大的困難。當前，隨著高通量測序和多組學技術(shù)的發(fā)展，針對已被廣泛應用的天然甲基營養(yǎng)型微生物建立數(shù)據(jù)庫，提供更加全面和豐富的基因信息，可以有效提高其生物合成的應用范圍；此外，基于天然甲基營養(yǎng)型微生物開發(fā)高效的基因編輯工具，提高菌株自身的同源重組效率，可以有效增加其用于生物合成的操作可行性。近年來，關(guān)于畢赤酵母的基因信息和數(shù)據(jù)庫資源日漸豐富，已有多項研究聚焦于優(yōu)化畢赤酵母的基因編輯方法，如開發(fā)高效的CRISPRi（clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference）系 統(tǒng)［112-113］；敲除Ku70（ATP 依賴的DNA 解旋酶）［114］、引入Rad52（DNA修復蛋白）提高非同源重組效率［115］；此外，針對天然甲基營養(yǎng)菌的基因編輯手段也逐漸增多，如優(yōu)化CRISPRi系統(tǒng)中dCas9 啟動子［116］、開發(fā)sRNA（small regulatory RNA）系統(tǒng)用于抑制基因表達［117-118］。合成甲基營養(yǎng)型微生物能夠彌補其在基因編輯上的不足，但是卻存在C1底物利用效率低的問題，導致微生物不能以甲醇或CO2作為唯一碳源和能源快速生長。當前，雖有少量研究實現(xiàn)E.coli利用甲醇或CO2進行生長，但是距離產(chǎn)物合成及工業(yè)化應用還有較遠的距離。目前，合成型甲基營養(yǎng)微生物的研究策略主要依賴于代謝底盤的改造（如天然甲醇利用途徑的引入）、打造全新的代謝途徑（如還原型甘氨酸途徑，甲醛酶途徑）、關(guān)鍵酶的挖掘（如高效MDH 的篩選）、適應性進化（如葡萄糖、木糖等多底物偶聯(lián)進化）等；最近的文章將納米材料應用于CO2的固定，結(jié)合多條已有的C1利用途徑，有效提高了CO2的轉(zhuǎn)化效率，展示了納米材料在生物轉(zhuǎn)化研究中的應用前景［119］，為未來的C1化合物的高效利用提供更有效的思路。

值得注意的是，兩種類型的甲基營養(yǎng)型微生物都面臨同樣的問題，即底物毒性耐受性問題。多種C1底物，如甲烷、甲醇的代謝網(wǎng)絡(luò)一脈相承，高度的相似性伴隨而來的是甲醛毒性的問題，甲醛積累而引起的細胞毒性，是導致微生物不能正常生長的根本原因，也限制了甲基營養(yǎng)微生物底物利用率的提高［120］。因此加強細胞對毒性物質(zhì)的代謝能力，或者提高細胞對毒性物質(zhì)的耐受性，是實現(xiàn)C1底物高效利用的重中之重［121］。針對這一問題，目前的主要手段均為適應性進化，雖然能夠在一定程度上提高微生物的甲醛耐受能力，但是所需時間較長，且現(xiàn)有研究均沒有突破甲醛毒性所帶來的生長限制；未來，利用多種誘變手段加快進化速度，加強對甲醛致毒機制的剖析，同時結(jié)合不同微生物自身的特點（如酵母的區(qū)室化效應）［122］，是微生物突破生長瓶頸的有效途徑?？傊?，充分提升C1底物利用率和目標產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，以生物制造推動新型工業(yè)化改革，對世界經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。