任師超，孫秋艷，馮旭東，李春，2，3

（1 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院化學(xué)工程系，生物化工研究所，醫(yī)藥分子科學(xué)與制劑工程工業(yè)和信息化部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2 清華大學(xué)化學(xué)工程系，工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；3 清華大學(xué)，合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100084）

三萜類化合物是一類由六個(gè)異戊二烯單元構(gòu)成的含有30 個(gè)碳原子的烴類含氧衍生物［1］，其中五環(huán)三萜是指具有五環(huán)結(jié)構(gòu)骨架的三萜類化合物。代表化合物包括甘草中的主要活性物質(zhì)甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）、白樺樹皮中的樺木酸（betulinic acid，BA），以及存在于多種植物中的山楂酸（maslinic acid，MA）、熊果酸（ursolic acid，UA）、齊墩果酸（oleanolic acid，OA）等。三萜皂苷是由疏水性三萜苷元和一個(gè)或多個(gè)親水性糖基組成的糖苷化合物［2］，根據(jù)其皂苷元結(jié)構(gòu)的不同，分為齊墩果烷型（oleanane type）、烏索烷型（ursane type）、羽扇烷型（lupane type）、木栓烷型（friedelane type）等。從天然合成途徑來看，五環(huán)三萜皂苷類化合物，先是由氧化鯊烯經(jīng)過氧化鯊烯環(huán)化酶（squalene oxide cyclase，OSC）催化形成不同的五環(huán)三萜化合物骨架（包括β-香樹脂醇、α-香樹脂醇、羽扇醇、日耳曼醇等），這些五環(huán)三萜化合物骨架經(jīng)過P450 氧化酶及其還原酶在不同的位點(diǎn)進(jìn)行多種形式的氧化，再經(jīng)過糖基轉(zhuǎn)移酶的修飾，最終可得到結(jié)構(gòu)及功能各異的五環(huán)三萜皂苷類化合物。由于大多五環(huán)三萜骨架具有較強(qiáng)疏水性，不利于其在植物當(dāng)中儲(chǔ)存、運(yùn)輸，所以植物中五環(huán)三萜化合物多以皂苷的形式存在。多樣化的糖基化修飾對五環(huán)三萜類化合物的理化性質(zhì)具有較大的影響。例如，糖基化會(huì)提高化合物的水溶性，有利于五環(huán)三萜類化合物在植物當(dāng)中的合成、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)?，同時(shí)，糖基化可以調(diào)整化合物的脂水分配系數(shù)，進(jìn)而提高生物利用度；另外，多種糖基化修飾配合體內(nèi)不同的糖苷水解酶也使得五環(huán)三萜類化合物的生理、藥理活性更加豐富。

五環(huán)三萜皂苷類化合物因其結(jié)構(gòu)多樣且具有多種藥理、生理活性而被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域。例如，甘草酸因其在保肝護(hù)肝方面的顯著作用，用于多種肝病藥物的研發(fā)；大豆皂苷具有抗腫瘤、降低膽固醇等保健作用，應(yīng)用也很廣泛［3-4］。一些三萜皂苷還是重要的天然甜味劑和乳化劑，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，如單葡萄糖醛酸基甘草次酸（glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG），其甜度是蔗糖的941 倍［5］，在食品添加劑行業(yè)的應(yīng)用前景廣闊。目前五環(huán)三萜皂苷類化合物的主要獲取方式為植物提取。該方法具有很多局限性，包括：①化合物在植物當(dāng)中的含量非常低，而野生資源有限，盲目對野生資源進(jìn)行采挖會(huì)造成生態(tài)環(huán)境的破壞，不符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求；②所以對相應(yīng)植物進(jìn)行人工種植成為化合物提取來源的重要補(bǔ)充，而許多植物具有很強(qiáng)的道地性，且需要多年的生長，不適合人工種植，且人工種植會(huì)大量占用耕地，同時(shí)并不能保證化合物的含量達(dá)到相關(guān)要求；③植物提取過程中需要復(fù)雜的分離純化工藝，要用到大量的酸堿試劑或者有機(jī)試劑以保證提取率和純度，而隨著我國環(huán)保政策的推行，這些工業(yè)廢液的排放難以符合環(huán)境友好可持續(xù)發(fā)展的要求，成了目前工業(yè)生產(chǎn)的一大難題；④很多糖基化修飾豐富的化合物穩(wěn)定性較差，提取過程中pH 的大范圍改變、性質(zhì)活潑的有機(jī)試劑的使用可能會(huì)造成糖基的破壞，很難提取到目標(biāo)化合物。對于有些植物含量低的化合物還可能通過化學(xué)全合成或者半合成的方式來獲取，但由于五環(huán)三萜皂苷類化合物的修飾類型較為復(fù)雜，包括羥基、羧基、羰基以及糖基化修飾等，很難從頭合成，存在難度大、收率低、環(huán)境不友好等問題，目前只有半合成的報(bào)道，且都停留在實(shí)驗(yàn)室水平，不具備產(chǎn)業(yè)化的能力。相比于植物提取和化學(xué)合成，生物合成可以在一定程度上減少有機(jī)試劑、酸堿試劑的使用量，且發(fā)酵周期短，無需考慮季節(jié)、環(huán)境氣候等因素，能夠?qū)崿F(xiàn)可持續(xù)性生產(chǎn)，更有利于推動(dòng)綠色生物制造，達(dá)到國家環(huán)保要求，在推動(dòng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)，對于我國的環(huán)境、資源保護(hù)都具有重要意義。而通過微生物異源合成天然產(chǎn)物具有周期短、環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢。近幾年隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，天然產(chǎn)物的微生物合成取得了重大突破。2013 年，Keasling 課題組［6］利用工程化釀酒酵母成功合成了倍半萜化合物青蒿素的前體青蒿酸，并結(jié)合化學(xué)法實(shí)現(xiàn)了抗瘧疾有效成分青蒿素的半合成。Smolke 課題組［7-8］于2019 年、2020 年分別報(bào)道了在釀酒酵母中從頭合成生物堿類化合物托品堿和莨菪堿、東莨菪堿，此工作的亮點(diǎn)為在工程化酵母中整合了來源于酵母、細(xì)菌、植物、動(dòng)物的26個(gè)基因，橫跨6個(gè)亞細(xì)胞定位，最終成功從頭合成了廣泛應(yīng)用于神經(jīng)肌肉疾病治療的生物堿類化合物，該工作具有里程碑式意義。五環(huán)三萜皂苷類化合物的微生物合成近幾年也取得了重大的突破，本綜述主要總結(jié)了重要五環(huán)三萜皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在微生物中的合成進(jìn)展，對部分合成途徑未知的化合物，結(jié)合已報(bào)道的P450氧化酶、尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-糖基轉(zhuǎn)移酶，以及微生物底盤宿主的代謝通路，對其合成途徑進(jìn)行了推測。

1 齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物

齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物，從結(jié)構(gòu)上來看，是以齊墩果烷（oleanane）［又稱β-香樹脂烷（βamyrane）］為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，進(jìn)行多種類型結(jié)構(gòu)衍生之后的一類化合物。從天然代謝途徑來看，大多數(shù)齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物，是通過2，3-氧化鯊烯經(jīng)氧化鯊烯環(huán)化酶催化生成β-香樹脂醇后，再進(jìn)行后續(xù)修飾而生成，其中具有代表性的化合物有齊墩果酸、山楂酸、甘草次酸及其糖苷類衍生物等。

1.1 齊墩果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

以β-香樹脂醇為底物，經(jīng)過CYP716A 家族P450酶的氧化，可在其28位C原子上進(jìn)行連續(xù)氧化修飾，依次生成高根二醇、齊墩果醛、齊墩果酸等化合物［9］。以齊墩果酸為基礎(chǔ)繼續(xù)催化，可得到山楂酸、櫟焦油酸（queretaroic acid）、金盞花苷E（calenduloside E）、常春藤皂苷元（hederagenin）等多種齊墩果烷型三萜化合物（圖1）。其中，山楂酸具有抗癌、抗氧化、抗艾滋病、抗菌、抗糖尿病等多種生物活性，其存在于山楂、紅棗、枇杷葉和油橄欖等多種植物中；櫟焦油酸存在于三臺(tái)紅花等植物中，具有一定的抗癌活性；常春藤皂苷元主要提取于五加科常春藤屬植物中華常春藤，主要具有抗癌和抗抑郁功效，而在常春藤皂苷元基礎(chǔ)上可進(jìn)行多種糖基化修飾，生成生理活性豐富多樣的多種常春藤皂苷；金盞花苷E具有抗心律失常、降血壓、降血糖等功效，對治療糖尿病和病態(tài)肥胖有潛在的作用。近年來，利用微生物細(xì)胞工廠從頭合成齊墩果酸及其糖苷衍生物取得了較大進(jìn)展。2013 年，張學(xué)禮課題組［10］通過在釀酒酵母中過表達(dá)甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑中的鯊烯氧化酶ERG1、角鯊烯合成酶ERG9、甲羥戊酸激酶ERG8，抑制競爭途徑的羊毛甾醇合酶ERG7，同時(shí)整合來源于苜蓿的P450酶，來自擬南芥的P450酶還原伴侶（cytochrome P450 reductase，CPR），以及來自于光果甘草的β-香樹脂醇合酶，發(fā)酵7 天最終得到的齊墩果酸產(chǎn)量達(dá)到71.0 mg/L。2018 年，盧文玉課題組［11］在釀酒酵母中過表達(dá)限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A tHMG1、法尼基焦磷酸合酶ERG20、外源的白念珠菌的鯊烯環(huán)氧酶ERG1，以增強(qiáng)前體鯊烯的供應(yīng)，整合來自長春花的香樹脂醇合酶，并進(jìn)行不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的篩選優(yōu)化，將來自于苜蓿和長春花的P450 酶與來自擬南芥和百脈根的CPR 進(jìn)行組合搭配篩選，確定苜蓿的P450 酶和擬南芥的CPR 為最優(yōu)搭配，分批補(bǔ)料發(fā)酵所得齊墩果酸的產(chǎn)量為155.58 mg/L，此外該課題組［12］還利用解脂耶氏酵母為宿主，結(jié)合P450酶與CPR融合表達(dá)的策略，將齊墩果酸的產(chǎn)量提高到540.7 mg/L。2018年，李春課題組［9］在釀酒酵母中過表達(dá)MVA 途徑限速酶tHMG1、鯊烯氧化酶ERG1、角鯊烯合成酶ERG9等，偶聯(lián)半乳糖代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使齊墩果酸的產(chǎn)量達(dá)到186.1 mg/L，經(jīng)過發(fā)酵調(diào)控優(yōu)化，產(chǎn)量達(dá)到了606.9 mg/L，是目前已報(bào)道的最高水平。

圖1 齊墩果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標(biāo)注為推測途徑）Glc-葡萄糖基；GlcA-葡萄糖醛酸基；Csl-類纖維素合酶Fig.1 Pentacyclic triterpenoid saponins with oleanolic acid(the predicted pathways are highlighted in green)Glc-glucosyl;GlcA-glucuronyl;Csl-cellulose synthase-like enzyme

在齊墩果酸的基礎(chǔ)上，可繼續(xù)經(jīng)過多種P450酶的修飾生成多種五環(huán)三萜類化合物，其中包括但不限于：

（1）通過CYP716C 家族的P450 酶在其2 號(hào)位上進(jìn)行氧化，實(shí)現(xiàn)羥基化修飾，可以得到山楂酸。2018 年，張學(xué)禮課題組［13］在山楂中挖掘到一個(gè)新的P450 酶CYP716C49，在齊墩果酸的釀酒酵母生產(chǎn)菌株中異源表達(dá)該酶，實(shí)現(xiàn)了從頭合成山楂酸，最終產(chǎn)量為384 mg/L。

（2）通過CYP72A68 及CYP93E 家族的P450酶可分別對齊墩果酸的23 號(hào)位和24 號(hào)位進(jìn)行羧基化和羥基化修飾，生成絲石竹酸及4-epi-常春藤皂苷元。2018 年，張學(xué)禮課題組［14］在薔薇科植物蘋果中挖掘到P450 酶MdMA02，在齊墩果酸的釀酒酵母生產(chǎn)菌株中對其進(jìn)行異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了常春藤皂苷元的從頭合成，產(chǎn)量達(dá)到了101 mg/L。

（3）通過CYP72A63對齊墩果酸的30號(hào)位進(jìn)行羥基化修飾，得到化合物櫟焦油酸。早在2006年，日本的莫西亞（Mercian）公司的生物資源實(shí)驗(yàn)室就利用來源于直腸小四孢菌的P450 酶P450moxA及其還原酶，通過體外無細(xì)胞催化系統(tǒng)，催化齊墩果酸得到了櫟焦油酸，轉(zhuǎn)化率為17%［15］。

關(guān)于齊墩果酸的糖基化修飾方面，通過歐洲山芥的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C11 可對其3 號(hào)位的羥基以及28 號(hào)位的羧基進(jìn)行葡萄糖基化修飾，可以分別生成3-O-葡萄糖-齊墩果酸和28-O-葡萄糖-齊墩果酸，該類化合物具有抗蟲抗菌的生理活性［16］。2018 年，楊生超課題組［17］利用姜狀三七轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，成功鑒定催化齊墩果酸C-3位羥基的葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶OAGT，利用大腸桿菌對其進(jìn)行重組表達(dá)，可以催化齊墩果酸得到金盞花苷E。

1.2 甘草次酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是甘草酸的苷元化合物，具有突出的抗肝炎病毒B及保肝護(hù)肝等活性，是目前市場上肝病治療藥物的主要功能成分。甘草酸是甘草中最主要的活性成分，對肉瘤、癌細(xì)胞生長有抑制作用，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等藥理活性，與此同時(shí)，其甜度是蔗糖的170 倍且具有特殊的回甘口感，也是重要的食品添加劑和香料基料。近年來，在醫(yī)藥、化工、食品、日用化工等行業(yè)也得到了廣泛的應(yīng)用。單葡萄糖醛酸基甘草次酸由于少一個(gè)葡萄糖醛酸基，使其極性適中，在保留其生理、藥理活性的同時(shí)增加了生物利用度，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有更大的競爭優(yōu)勢，且其甜度達(dá)到了蔗糖的941倍，具有巨大的開發(fā)應(yīng)用前景［18］。

以β-香樹脂醇為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過P450 酶CYP88D6 及其還原酶的催化，可對β-香樹脂醇的11位進(jìn)行氧化修飾，生成化合物11-O-β-香樹脂醇，具有抗增殖和抗炎活性，可作為合成多種三萜類化合物 的 骨架。 再由P450 酶CYP72A63 或CYP72A154 及還原酶催化，可對其30 位的甲基繼續(xù)進(jìn)行多步氧化修飾，最終生成甘草次酸（圖2）。近年，日本研究人員通過對烏拉爾甘草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘，結(jié)合EST 序列與RNA-Seq 技術(shù)解析了甘草次酸的生物合成途徑，并在釀酒酵母體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了甘草次酸的從頭合成，但是其生產(chǎn)水平停留在概念驗(yàn)證階段，產(chǎn)量僅為20 μg/L，并伴隨有多種副產(chǎn)物的生成［19］。2018 年，李春課題組［20］從苜蓿和甘草中成功獲得特異性更強(qiáng)、活性更高的P450 酶（Uni25647）及其還原酶，并優(yōu)化了甘草次酸的合成途徑，在5 L 發(fā)酵罐中的產(chǎn)量達(dá)到18.9 mg/L。在此基礎(chǔ)上，該課題組［21］對P450 酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，對關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行突變，最終實(shí)現(xiàn)甘草次酸及其中間體化合物甘草次醇、甘草次醛的選擇性合成，甘草次酸及甘草次醛的產(chǎn)量分別達(dá)到了36.4 mg/L 和31.4 mg/L，并成功合成了稀有萜類化合物29-羥基-11-O-β-香樹脂醇，產(chǎn)量為10.2 mg/L，均是目前已報(bào)道的最高水平。

圖2 甘草次酸類五環(huán)三萜皂苷類化合物Glc-葡萄糖基；GlcA-葡萄糖醛酸基Fig.2 Pentacyclic triterpenoid saponins with glycyrrhetinic acidGlc-glucosyl;GlcA-glucuronyl

以甘草次酸為底物，通過一系列的糖基轉(zhuǎn)移酶可對其3 位羥基或/及30 位羧基進(jìn)行葡萄糖基化修飾，生成3-O-葡萄糖-甘草次酸、30-O-葡萄糖-甘草次酸及雙葡萄糖基化修飾的甘草次酸。2017年，李春課題組［22］通過大腸桿菌異源表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C11，并在體外對甘草次酸進(jìn)行催化，成功得到3-O-葡萄糖-甘草次酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%。在此基礎(chǔ)上，該課題組［23］從甘草數(shù)據(jù)庫中鑒定到兩個(gè)新的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C33 和UGT73F24，成功在體外合成多種甘草次酸糖苷衍生物，包括3-O-葡萄糖-甘草次酸、30-O-葡萄糖-甘草次酸、3，30-O-雙葡萄糖-甘草次酸，并在工程化釀酒酵母中首次合成了3-O-葡萄糖-甘草次酸，產(chǎn)量達(dá)到26.31 mg/L。甘草次酸經(jīng)過糖基轉(zhuǎn)移酶GuGT14 及UGT73P12 的催化，可先后生成化合物單葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）以及甘草酸（GL）。2019 年，葉敏課題組［24］從甘草中鑒定到糖基轉(zhuǎn)移酶GuGT14，并對其進(jìn)行體外驗(yàn)證，成功得到了化合物GAMG。同年，Muranaka 課題組［25］從甘草中鑒定到糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73P12，該酶可催化GAMG 生成GL，并推測其可能是甘草中甘草酸天然合成途徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶。2020 年，有研究者從紫花苜蓿、烏拉爾甘草、百脈根、大豆等植物中發(fā)現(xiàn)了一種類纖維素合酶（cellulose synthase-like enzymes，Csls）具有葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性，并利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的煙草和工程化釀酒酵母合成了3-O-葡萄糖醛酸-苜蓿酸、GAMG 和金盞花苷E 等化合物［26-27］，并在此基礎(chǔ)上利用釀酒酵母從頭合成GL，產(chǎn)量達(dá)到了791 μg/L［27］。

1.3 大豆皂苷類五環(huán)三萜皂苷化合物

大豆皂苷（soybean saponins）也是一類重要的五環(huán)三萜皂苷類化合物，主要存在于豆科植物當(dāng)中。近年來，國內(nèi)外大量研究表明：大豆皂苷不僅毒副作用很小，而且還具有許多對人體健康有益的生理功能，例如在保健作用方面，具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能、保護(hù)記憶力、作為免疫原性物質(zhì)、預(yù)防骨質(zhì)疏松、改善肥胖、改善膽固醇和脂肪代謝、改善心肌供氧、提高機(jī)體的耐缺氧功能、加強(qiáng)中樞交感神經(jīng)的活動(dòng)、抗衰老、防止動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)等作用；在藥理活性方面，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗石棉塵毒性、抗自由基、抗凝血、抗血栓、抗糖尿病等功能［28-33］。

依據(jù)皂苷元可將大豆皂苷分為大豆皂苷A 類、B 類、E 類、DDMP（2，3-二氫-2，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮）等四類（圖3）。以β-香樹脂醇為底物，對其22 位進(jìn)行羥基化修飾，可生成槐花二醇，此為大豆皂苷的合成前體化合物，且具備一定生理及藥理活性。2010 年有研究報(bào)道了齊墩果烯三萜化合物的22 位羥化酶，也是目前報(bào)道的唯一具有該功能的酶［34］。而通過另外一個(gè)途徑，以β-香樹脂醇為底物，經(jīng)過CYP93E 家族的P450酶催化，可對β-香樹脂醇的24位進(jìn)行羥基化修飾，生成化合物24-羥基-β-香樹脂醇，在此基礎(chǔ)上通過P450 酶CYP72A61 的催化，可繼續(xù)在其C-22 上進(jìn)行羥基化修飾，生成大豆皂醇B，后經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶催化可在C-3羥基上加糖，形成大豆皂苷B 類化合物［35］。2010年，Ebizuka課題組［36］將從大豆轉(zhuǎn)錄組克隆得到的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74M1與UGT71G1基因在大腸桿菌中重組表達(dá)，與大豆皂苷B單葡萄糖醛酸反應(yīng)，得到大豆皂苷Ⅲ與Ⅰ。大豆皂醇B可在糖基轉(zhuǎn)移酶Sg-9（UGT73B4）的催化下在C-22上連接一個(gè)DDMP基團(tuán)，C-3羥基經(jīng)葡萄糖醛酸基修飾，形成大豆皂苷DDMP類［37］。P450酶Sg-5（CYP72A69）可將大豆皂醇B的C-21氧化形成羥基，生成大豆皂醇A，經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶催化可在C-3羥基、C-22加不同的糖基，生成大豆皂苷A類化合物［38］。DDMP類皂苷不穩(wěn)定，容易脫去DDMP基團(tuán)在C-22位形成羰基，生成大豆皂苷E類化合物［35，38-39］。

圖3 大豆皂苷類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標(biāo)注為推測途徑）GlcA-葡萄糖醛酸基；Rx-糖基化修飾；Csl-類纖維素合酶Fig.3 Pentacyclic triterpenoid saponins with soybean saponin(the Predicted pathways are highlighted in green)GlcA-glucuronyl;Rx-glycosylation;Csl-Cellulose synthase-like enzyme

大豆皂苷糖基化的主要基因是Sg-1，Chigen Tsukamoto課題組［40］對中國8株野生大豆進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)不同Sg-1 突變體可對C-22 羥基添加不同的糖基，如Sg-1b（UGT73F2）可在大豆皂苷A類化合物的C-22位乙酰葡萄糖上加葡萄糖生成A0-αg 皂苷，Sg-1a（UGT73F4）可在C-22 位乙酰葡萄糖上加木糖生成Ab類皂苷。Sg-10-b可阻止C-22結(jié)合阿拉伯糖，生成大豆皂苷A0 類［40-43］。Sg-4（UGT73P10）可在大豆皂苷B類的C-3位糖基上加一個(gè)阿拉伯糖，生成大豆皂苷Bc′，Sg-4（UGT73P10）同源酶GMSG 2（UGT73P2）可催化大豆皂苷B類的C-3 羥基結(jié)合一個(gè)半乳糖，生成大豆皂苷Bb′［44］。UGT73P2 和UGT73P10 可催化大豆皂苷C-3 位糖基上分別修飾半乳糖和阿拉伯糖，生成大豆皂苷B類和DDMP類［42］。UGT73P2和UGT73P10與UGT73F2來 源 于 同 一 祖 先［43］。 Sg-3 （UGT91H9） 和UGT91H4 可分別在大豆皂苷C-3 位的糖鏈上添加第3個(gè)葡萄糖和鼠李糖生成大豆皂苷Ab等［42，44］。

1.4 多位點(diǎn)修飾的齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類化合物

1.4.1 柴胡皂苷類

柴胡皂苷（saikosaponin）是一類廣泛存在于柴胡根中的五環(huán)三萜皂苷類化合物，在治療感冒、癌癥等方面有重要作用。目前柴胡皂苷的生物合成途徑尚不清晰，有研究者推測柴胡皂苷以β-香樹脂醇為前體，經(jīng)過細(xì)胞色素P450 酶與糖基轉(zhuǎn)移酶修飾形成柴胡皂苷類化合物［45-46］。

以3，16-二羥基-齊墩果烷為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使其C-11 與C-12 之間呈雙鍵，C-13 與C-28 之間呈環(huán)氧鍵，就形成了柴胡皂苷的基本結(jié)構(gòu)單元柴胡皂苷元E，繼續(xù)對其C-23 位進(jìn)行羥基化修飾，可得到柴胡皂苷元G、F。對各個(gè)柴胡皂苷元C-3 位的羥基進(jìn)行巖藻糖、葡萄糖、鼠李糖等糖基化修飾，可得到柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c等多種柴胡皂苷。在C-3、C-16、C-23、C-28 位點(diǎn)多羥基修飾的齊墩果烷基礎(chǔ)上，其母核上C-9 與C-11 之間、C-11與C-12之間、C-12與C-13之間、C-13與C-18 之間，形成一個(gè)或兩個(gè)雙鍵，結(jié)合C-13 位與C-28位的環(huán)氧鍵，再對其C-3位的羥基進(jìn)行糖基化修飾，可形成柴胡皂苷元A、B、C、D，柴胡皂苷b1、b2、b3、b4，柴胡皂苷f等多種柴胡皂苷。

1.4.2 商陸酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

商陸酸（esculentic acid）類化合物是一類廣泛存在于商陸根中的五環(huán)三萜類化合物，在治療各種炎癥中具有重要作用，目前主要從商陸根中提取［47-48］。商陸酸是在齊墩果酸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對C-23、C-16 分別進(jìn)行羥基化修飾，對C-30 位進(jìn)行羧基化修飾而成的五環(huán)三萜化合物。對商陸酸的C-2、C-3 羥基、C-30 羧基分別選擇性羥基化、糖基化、甲基化修飾，可得到多種商陸皂苷元及商陸皂苷類化合物。

遠(yuǎn)志皂苷是遠(yuǎn)志的主要活性成分，其功效主要是有益智力、安定神志、縮短酒精體內(nèi)代謝時(shí)間、化痰止咳、延緩衰老及抑菌等［49］。近年來，有學(xué)者對遠(yuǎn)志皂苷類化合物的天然合成途徑進(jìn)行了研究，推測了其理論合成路線，為遠(yuǎn)志皂苷類五環(huán)三萜化合物的微生物合成奠定了基礎(chǔ)［50］。以2，27-二羥基-3-O-葡萄糖-商陸酸為基礎(chǔ)，對其C-23 進(jìn)行羧基化衍生之后，繼續(xù)對其C-28 進(jìn)行多種類型的糖基化修飾，結(jié)合母核上的多種羥基、雙鍵等修飾，可形成結(jié)構(gòu)各異的遠(yuǎn)志皂苷，包括遠(yuǎn)志皂苷A、B、C、D、E、F。由于修飾較為復(fù)雜且氧化程度較高，多數(shù)遠(yuǎn)志皂苷的穩(wěn)定性較差，經(jīng)常以遠(yuǎn)志皂苷元的形式存在。

目前利用微生物細(xì)胞工廠合成齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物的報(bào)道大多集中于苷元的合成，如齊墩果酸、甘草次酸、山楂酸等。雖然催化相關(guān)母核的C-2、C-23、C-24、C-28、C-30 等位點(diǎn)形成相應(yīng)苷元的P450 酶已經(jīng)報(bào)道，但大多存在活性低、特異性差等問題，導(dǎo)致副產(chǎn)物多、產(chǎn)量低，在相關(guān)糖苷化合物生物合成方面的報(bào)道相對較少，且產(chǎn)量普遍較低，目前只有齊墩果酸、甘草次酸等少數(shù)幾個(gè)化合物糖苷衍生物的生物合成報(bào)道。柴胡皂苷、商陸皂苷、遠(yuǎn)志皂苷等化合物的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜、多樣，而催化C-16、C-27 等位點(diǎn)的P450 酶尚未報(bào)道，且部分反應(yīng)過程未知，導(dǎo)致異源合成困難。在糖基轉(zhuǎn)移酶方面，除了異源表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶活性低、特異性差的問題外，還涉及糖基供體選擇性問題，底盤宿主一般很難提供充足且多樣化的糖基供體，需要對底盤宿主進(jìn)行優(yōu)化改造，且在合成途徑當(dāng)中很多P450酶未解析，這也為途徑當(dāng)中糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定增加了難度。

2 烏索烷型五環(huán)三萜皂苷化合物

烏索烷型又稱α-香樹脂烷型，在天然代謝途徑中，2，3-氧化鯊烯經(jīng)氧化鯊烯環(huán)化酶催化生成α-香樹脂醇（α-amyrin），以α-香樹脂醇為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)修飾形成的一類五環(huán)三萜化合物，代表化合物有熊果酸、地榆皂苷等（圖4）。

圖4 熊果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標(biāo)注為推測途徑）Glc-葡萄糖基；Ara-阿拉伯糖基；Rha-鼠李糖基Fig.4 Pentacyclic triterpenoid saponins with ursolic acid (the predicted pathways were marked in green)Glc-glucosyl;Ara-arabinosyl;Rha-rhamnosyl

2.1 熊果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

熊果酸廣泛存在于多種植物當(dāng)中，包括木犀科植物女貞、薔薇科植物枇杷、唇形科植物夏枯草等。熊果酸具有鎮(zhèn)靜、保肝抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖共《?、抗氧化、抗?dòng)脈粥樣硬化、降低血糖等多種功能，被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料。

α-齊香樹脂醇在CYP716A 家族的P450 酶及其還原酶催化下，可氧化其C-28生成熊果酸，再經(jīng)過CYP716C49對其C-2進(jìn)行羥基化修飾，可生成科羅索酸（corosolic acid）。2019 年，張學(xué)禮課題組［13］從植物山楂中鑒定到P450 酶CYP716C49，利用工程化釀酒酵母對其異源表達(dá)，合成了熊果酸和科羅索酸，科羅索酸的產(chǎn)量達(dá)到了141 mg/L。許輝課題組［51］將具有催化28-O-葡萄糖基化功能的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74AG5，連同來自冬青的α-香樹脂醇合酶在釀酒酵母中共表達(dá)，產(chǎn)生了一種罕見的熊果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.2 地榆皂苷

地榆為我國常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有涼血止血、解毒斂瘡之功效，在臨床上經(jīng)常應(yīng)用于止血、燒燙傷、直腸炎、結(jié)腸炎、腎炎的治療［52］。地榆皂苷類化合物是地榆中的主要活性物質(zhì)，具有抗腫瘤以及美容護(hù)膚的作用，其中地榆皂苷Ⅰ不僅可以有效防止膠原纖維降解，也可以有效促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)生，可用于美容護(hù)膚產(chǎn)品的開發(fā)［53-54］。對熊果酸C-3 位羥基進(jìn)行阿拉伯糖修飾（UGT73C家族）可得到地榆皂苷B，繼續(xù)對地榆皂苷B的C-19位進(jìn)行α-羥基化衍生可生成地榆皂苷Ⅱ（ziyuglycoside Ⅱ），繼續(xù)催化地榆皂苷Ⅱ的C-28 位羧基加上葡萄糖得到地榆皂苷Ⅰ（ziyuglycoside Ⅰ）。

2.3 積雪草酸

《神農(nóng)本草經(jīng)》同樣記載了積雪草的相關(guān)信息。積雪草為我國常用中藥，在印度等一些亞洲國家和地區(qū)也應(yīng)用廣泛，在臨床上可用于跌打損傷、傳染性肝炎、流行性腦炎等疾病的治療。積雪草苷（asiaticoside）等五環(huán)三萜皂苷化合物是積雪草中的主要活性物質(zhì)，可用于皮膚病、部分腎功能疾病的治療。積雪草的有效成分提取物可以有效抑制癌細(xì)胞的增殖、抗抑郁、加速傷口愈合，而且具有改善肝、腎功能的作用。南非、印度、東南亞等許多國家和地區(qū)也將其作為傳統(tǒng)藥物加以應(yīng)用［55］。

理論上CYP72A68 對科羅索酸23 號(hào)位進(jìn)行羥基化衍生可生成積雪草酸。通過多種糖基轉(zhuǎn)移酶在積雪草酸的C-28 羧基上進(jìn)行一系列的糖基化修飾，加上葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖，可得到積雪草苷。對積雪草酸和積雪草苷的C-6 進(jìn)行羥基化衍生，可分別得到羥基積雪草酸和羥基積雪草苷［55］。2017 年，Kim 等［56］發(fā)掘UGT73AH1 可以在積雪草酸C-28 的羧基上添加一個(gè)葡萄糖，形成單葡萄糖-積雪草酸，再由其他糖基轉(zhuǎn)移酶在C-28 位的葡萄糖上添加葡萄糖-鼠李糖，形成積雪草苷。積雪草酸的生物利用度低，作為幾種疾病的潛在治療劑，需要對積雪草酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。研究表明，多種內(nèi)生真菌以積雪草酸作為底物生成生物活性更高的積雪草酸衍生物［57-59］。例如，內(nèi)生真菌深黃傘形霉可將積雪草酸轉(zhuǎn)化生成2α，3β，7β，23-四羥基-12-烯-28-酸和2α，3β，7β，23-四羥基-11-烯-28，13-內(nèi)酯［58］。高兆輝等［59］利用小孢擬盤多毛孢可將積雪草酸轉(zhuǎn)化生成多種不同的衍生物。

與地榆皂苷、積雪草苷等化合物C-6、C-19 位氧化相關(guān)的P450 酶尚未解析，且多種糖基的修飾過程也尚未完全清晰，導(dǎo)致利用微生物細(xì)胞工廠合成烏索烷型五環(huán)三萜皂苷具有一定難度，除了熊果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的生物合成之外，關(guān)于烏索烷型三萜皂苷生物合成的報(bào)道相對較少。由于烏索烷型與齊墩果烷型三萜皂苷結(jié)構(gòu)類似，合成途徑的部分酶可以通用，在多種化合物的天然合成途徑方面可以相互參考，所以利用微生物細(xì)胞工廠合成烏索烷型五環(huán)三萜皂苷化合物具有很大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 羽扇烷型五環(huán)三萜皂苷化合物

羽扇烷型五環(huán)三萜化合物是由羽扇豆醇合酶（lupeol synthase，LUS）催化2，3-氧化鯊烯合成羽扇醇，以羽扇醇為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)修飾形成的一類五環(huán)三萜化合物。代表化合物有樺木酸、麥珠子酸等（圖5）。

圖5 樺木酸類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標(biāo)注為推測途徑）Glc-葡萄糖基；Ara-阿拉伯糖基；Rha-鼠李糖基Fig.5 Pentacyclic triterpenoid saponins with betulinic acid(the predicted pathways are highlighted in green)Glc-glucosyl;Ara-arabinosyl;Rha-rhamnosyl

3.1 樺木酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

樺木酸具有抗腫瘤、抗艾滋病毒、抗炎和體外抗瘧等多種生物活性，尤其對于惡性皮膚黑色素瘤有很好的效果，而且毒性很小，是最有前途的抗癌藥物前體［60］。樺木酸天然存在于植物白樺樹的樹皮當(dāng)中，在很大程度上限制了樺木酸的植物提取，因此，利用微生物細(xì)胞工廠對樺木酸進(jìn)行生物合成具有巨大的應(yīng)用前景。

CYP716A 家族的P450 酶同樣可以催化羽扇醇的C-28位生成樺木酸，再經(jīng)CYP716C49催化其C-2位加羥基生成麥珠子酸。目前已成功利用釀酒酵母微生物細(xì)胞工廠從頭合成了樺木酸和麥珠子酸（alphitolic acid），麥珠子酸的產(chǎn)量達(dá)到23 mg/L［13］。李靜、張彥生［61］通過調(diào)節(jié)釀酒酵母中樺木酸和脂肪酸途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，表達(dá)擬南芥羽扇豆醇合酶LUS1、長春花P450 單加氧酶CrAO，使樺木酸產(chǎn)量達(dá)到1.92 mg/L（以O(shè)D 計(jì)）。盧文玉課題組［62］在解脂酵母中共表達(dá)來自擬南芥的羽扇豆醇合酶（AtLUP1）、P450 酶（CYP716A12）及其還原酶（AtCPR1），合成樺木酸的產(chǎn)量為0.32 mg/L，在P450 酶與其截短的還原酶融合表達(dá)、上游甲羥戊酸（MVA）徑的關(guān)鍵基因過表達(dá)后，產(chǎn)量增加到9.41 mg/L，最后通過甘油發(fā)酵，使樺木酸的產(chǎn)量達(dá)到16.98 mg/L。曹英秀等［63］將來自蓖麻的羽扇醇合酶（RcLUS），來自白樺的P450酶（CYP716A180）來自日本蓮花的還原酶（LiCPR）整合到解脂酵母中，合成樺木酸的產(chǎn)量達(dá)到25.62 mg/L，再通過將LiCPR 更換為來源于苜蓿的還原酶（MtCPR），樺木酸的產(chǎn)量達(dá)到32.33 mg/L。

3.2 白頭翁皂苷

白頭翁是一味用于治療熱毒血痢、溫瘧寒熱、鼻衄、血痔的中藥。白頭翁皂苷（pulchinenoside）是白頭翁中的主要成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗血吸蟲、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性［64-67］。

對樺木酸的C-23 位進(jìn)行羥基化衍生可得到化合物23-羥基樺木酸，以其為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在C-3 位的羥基依次進(jìn)行阿拉伯糖基和鼠李糖基化修飾可得到化合物白頭翁皂苷A，繼續(xù)在其C-28 位的羧基上進(jìn)行葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖的糖基鏈修飾，可得到白頭翁皂苷C［67］。

目前利用微生物細(xì)胞工廠合成羽扇烷型五環(huán)三萜化合物的報(bào)道很少，基于齊墩果烷型和烏索烷型五環(huán)三萜皂苷化合物合成途徑的分析和推測，為利用微生物合成羽扇烷型五環(huán)皂苷類化合物提供了參考和理論依據(jù)。

4 木栓烷型五環(huán)三萜化合物

木栓烷型五環(huán)三萜是木栓烷經(jīng)過多種修飾、結(jié)構(gòu)衍生形成的一類五環(huán)三萜化合物，其中包括雷公藤酮（tripterygone）等，其合成途徑尚不完全清晰。雷公藤酮主要存在于雷公藤中，在治療癌癥方面具有廣闊前景，目前主要通過化學(xué)合成法合成［68-70］。木栓烷是經(jīng)過齊墩果烷C-4、C-10、C-14的甲基位移到C-5、C-9、C-13 上演變而來的。雷公藤酮是木栓烷C-3與C-4、C-1與C-10均呈雙鍵，C-2 呈酮，C-3 位羥基化、C-30 位經(jīng)羧基化修飾后所形成。推測該類化合物可能是由2，3-氧化鯊烯經(jīng)一種未知的氧化鯊烯環(huán)化酶，催化生成了木栓二烯醇，并在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行C-2位、C-30位的氧化等多種修飾的一類化合物（圖6）。

圖6 木栓烷類五環(huán)三萜化合物（綠色標(biāo)注為推測途徑）Fig.6 Pentacyclic triterpenoid saponins with friedelanes(The predicted pathways are highlighted in green)

5 結(jié)論與展望

長久以來，對于具有豐富生理、藥理活性的五環(huán)三萜皂苷類化合物的研究從未間斷，從活性物質(zhì)的提取到單一化合物的分離、純化，越來越多的五環(huán)三萜皂苷類化合物被分離鑒定出來，而隨著研究的深入，這些化合物的應(yīng)用價(jià)值逐漸被開發(fā)，市場需求量也在不斷加大。為了滿足市場需要，工業(yè)上大量獲取相關(guān)化合物最直接的方法就是植物提取，根據(jù)化合物的不同性質(zhì)、相應(yīng)植物的不同特性，在工業(yè)發(fā)展過程中逐漸形成了特定的生產(chǎn)工藝。利用微生物細(xì)胞工廠高效合成五環(huán)三萜皂苷類天然產(chǎn)物，可以在一定程度上精簡工藝步驟。近年來，利用微生物合成五環(huán)三萜皂苷類化合物的研究取得了很大進(jìn)展，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了部分化合物的從頭合成，例如GAMG、GL、3-O-葡萄糖-甘草次酸、熊果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等（表1），但策略大多集中在轉(zhuǎn)錄組、基因組數(shù)據(jù)分析且產(chǎn)量普遍較低。對于現(xiàn)階段應(yīng)用廣泛的五環(huán)三萜皂苷類化合物，實(shí)現(xiàn)其微生物合成的工業(yè)化是一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)，主要有以下幾方面的困難和挑戰(zhàn)：①實(shí)驗(yàn)室菌株通常具有遺傳不穩(wěn)定性，且實(shí)際生產(chǎn)過程中的培養(yǎng)條件限制勢必也會(huì)帶來新的挑戰(zhàn)，從實(shí)驗(yàn)室菌株到穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)菌株，需要大量的嘗試和驗(yàn)證；②需要有較高的產(chǎn)量，其生產(chǎn)成本才能和現(xiàn)有的植物提取法相當(dāng)；③需要對現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝進(jìn)行較大改進(jìn)，在生產(chǎn)成本有優(yōu)勢的情況下，還需要考慮新工藝開發(fā)以及盈利周期，同時(shí)需要一定的科技人才儲(chǔ)備及科研和實(shí)際生產(chǎn)相結(jié)合，對于一般中小企業(yè)難以實(shí)現(xiàn)；④基于現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝，衍生出了多種產(chǎn)品，在現(xiàn)有產(chǎn)品工藝基礎(chǔ)上，需要考慮利用微生物生產(chǎn)單一的化合物是否滿足整體經(jīng)濟(jì)性，且現(xiàn)有產(chǎn)品已經(jīng)形成了較為成熟的產(chǎn)業(yè)鏈，生產(chǎn)單一的化合物，在一定程度上會(huì)影響現(xiàn)有產(chǎn)業(yè)鏈。解決上述問題的核心基礎(chǔ)則是微生物細(xì)胞工廠的實(shí)際產(chǎn)量，只有產(chǎn)量達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求才有可能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

表1 五環(huán)三萜皂苷類化合物的微生物合成

五環(huán)三萜皂苷類化合物的微生物合成主要瓶頸在于：①合成途徑未解析，部分P450 氧化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶未知，對未知途徑關(guān)鍵酶的挖掘是建立微生物細(xì)胞工廠首要解決的問題，部分關(guān)鍵酶在微生物中異源表達(dá)能力差、活力低，且天然合成途徑當(dāng)中有許多功能類似的同工酶，如何篩選到特異性強(qiáng)、催化活性高的關(guān)鍵酶也是現(xiàn)階段的關(guān)鍵問題；②微生物細(xì)胞內(nèi)UDP 糖基供體的種類較單一、供應(yīng)量不足也限制了五環(huán)三萜皂苷類化合物的產(chǎn)量；③大部分五環(huán)三萜皂苷類化合物對微生物宿主具有一定的毒性，要實(shí)現(xiàn)微生物生長和產(chǎn)物生產(chǎn)的平衡具有一定難度。

針對上述問題，可以考慮從以下幾個(gè)方面進(jìn)行解決：①對相應(yīng)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、基因組、代謝組等組學(xué)分析，結(jié)合生物信息學(xué)分析，挖掘新的關(guān)鍵酶。對挖掘到的關(guān)鍵酶進(jìn)行體外酶活驗(yàn)證，對不同性質(zhì)的蛋白建立高效的體外可溶表達(dá)體系（包括通過不同的標(biāo)簽、不同表達(dá)宿主增加目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)，通過微粒體對膜蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證等），結(jié)合晶體學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)模擬等手段，對關(guān)鍵酶的催化機(jī)理、關(guān)鍵催化位點(diǎn)進(jìn)行研究；②通過①中的手段，挖掘不同植物、微生物中的脫氫酶、脫羧酶、差向異構(gòu)酶等，結(jié)合不同微生物的代謝特點(diǎn)，選用適合的微生物作為底盤宿主對上述酶進(jìn)行異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)多種類型糖基供體的供應(yīng)，同時(shí)采用誘導(dǎo)表達(dá)、混菌培養(yǎng)等手段實(shí)現(xiàn)五環(huán)三萜化合物的時(shí)序性糖基化；③結(jié)合現(xiàn)有的五環(huán)三萜皂苷類化合物的藥理活性數(shù)據(jù)，通過分子對接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等手段，進(jìn)行對宿主的理性改造。通過適應(yīng)性馴化、常溫常壓等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變等技術(shù)，對宿主進(jìn)行非理性改造，再結(jié)合高通量篩選平臺(tái)，篩選對目標(biāo)化合物具有高耐受性的菌株作為底盤宿主進(jìn)行目標(biāo)化合物的生產(chǎn)。解決以上問題則有望大幅度提高微生物合成五環(huán)三萜皂苷類化合物的水平，為推進(jìn)工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。