畢嘉成，田志剛，2

（1 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，廣東 深圳 518055；2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)免疫學(xué)研究所，安徽 合肥 230027）

1 合成免疫學(xué)驅(qū)動的腫瘤免疫治療

1.1 腫瘤免疫治療現(xiàn)狀概述

近年來，免疫治療在腫瘤等重大疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用得到蓬勃發(fā)展，逐漸成為變革腫瘤治療的嶄新范式［1-3］。當(dāng)前免疫治療主要包括通過單克隆抗體靶向“檢查點(diǎn)分子”的“檢查點(diǎn)療法”［4-5］，以及通過轉(zhuǎn)輸免疫細(xì)胞進(jìn)行腫瘤治療的免疫細(xì)胞療法［6-7］。

其中“檢查點(diǎn)療法”主要通過單克隆抗體靶向阻斷免疫細(xì)胞表面的抑制性受體，從而解除抑制性受體介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)，釋放免疫細(xì)胞的抗腫瘤潛能。最具代表性的PD-1/PD-L1 單克隆抗體，通過阻斷PD-1 與PD-L1 之間的相互作用，激活抗腫瘤效應(yīng)T 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。隨著基于PD-1/PD-L1 抗體單藥治療腫瘤臨床試驗(yàn)的成功，PD-1/PD-L1 抗體聯(lián)合CTLA-4、TIGIT 等其他檢查點(diǎn)分子的聯(lián)合療法也相繼取得成功。作為免疫治療的重要方向之一，未來檢查點(diǎn)療法結(jié)合生物標(biāo)志物的篩查，有望使該策略的應(yīng)答水平進(jìn)一步提高。

除了檢查點(diǎn)療法之外，免疫細(xì)胞療法是免疫治療中的另一個重要方向。免疫細(xì)胞療法主要包括基于T 細(xì)胞的CAR-T 療法和TCR-T 療法，以及基于NK 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞療法。CAR-T 療法主要通過設(shè)計構(gòu)建嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），使T 細(xì)胞通過細(xì)胞外的單鏈抗體結(jié)構(gòu)域特異性地識別腫瘤抗原，并通過細(xì)胞內(nèi)的一個或多個活化性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域觸發(fā)活化性信號，二者的結(jié)合能夠使得T細(xì)胞通過非MHC 限制性的方式特異性地識別預(yù)先設(shè)定的腫瘤抗原，并啟動T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)功能［8］。除了CAR-T 外，CAR 裝載的NK 細(xì)胞也在臨床試驗(yàn)中體現(xiàn)出較好的有效性［9］，而CAR 裝載的巨噬細(xì)胞目前仍在臨床前開發(fā)階段，其臨床治療腫瘤的有效性仍有待檢驗(yàn)［10］。此外，基于T 細(xì)胞的免疫細(xì)胞療法也包括同樣在腫瘤免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出潛力的TCR-T 療法［11］。TCR-T 療法主要通過對病人來源的T 細(xì)胞進(jìn)行體外的基因修飾，以使這些T細(xì)胞表達(dá)針對特定腫瘤抗原表位的TCR 分子，從而獲得特異性識別腫瘤的能力。與CAR-T 細(xì)胞相比，TCR-T療法的優(yōu)勢是能夠使T細(xì)胞特異性地識別細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的腫瘤抗原，因而TCR-T 療法與CAR-T 療法具有一定程度的互補(bǔ)性；但TCR-T 療法具有MHC 限制性，而目前所知的能特異性識別特定抗原表位的TCR數(shù)量非常有限。

盡管腫瘤免疫治療取得了上述進(jìn)展，然而針對大多數(shù)種類的腫瘤，特別是實(shí)體瘤，當(dāng)前免疫療法的療效仍有待提高。原因主要有以下幾點(diǎn)［12］：免疫細(xì)胞對腫瘤的識別精準(zhǔn)度不足；免疫細(xì)胞對腫瘤組織的浸潤水平不足；免疫細(xì)胞受腫瘤微環(huán)境抑制；免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中會進(jìn)入耗竭狀態(tài)。為了提高免疫治療的有效性和安全性，亟需針對上述問題進(jìn)一步發(fā)展免疫治療的技術(shù)和手段。

1.2 合成免疫學(xué)概述

“合成生物學(xué)”是指設(shè)計與構(gòu)建新的生物元件、裝置或系統(tǒng)，或?qū)ΜF(xiàn)有的天然生物系統(tǒng)進(jìn)行再設(shè)計和再改造，以付諸應(yīng)用［13-16］。合成生物學(xué)以理性設(shè)計、定量化、工程化和智能化等為核心理念和特征，在多個領(lǐng)域發(fā)展出一系列技術(shù)工具，為其廣泛應(yīng)用奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。合成生物學(xué)的理念與技術(shù)，結(jié)合日漸深入的免疫學(xué)基礎(chǔ)研究及日益豐厚的免疫治療實(shí)踐積累，驅(qū)動著一個嶄新學(xué)科的誕生與發(fā)展--合成免疫學(xué)［17-18］?！昂铣擅庖邔W(xué)”是指通過結(jié)合基礎(chǔ)免疫學(xué)知識與合成生物學(xué)技術(shù)手段，工程化構(gòu)建生物元件或裝置，通過重塑、糾偏、再造機(jī)體的免疫系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對免疫應(yīng)答的理性操控、進(jìn)行重大疾病的免疫治療。合成免疫學(xué)的研究目標(biāo)一方面是“致知”，即旨在進(jìn)一步揭示免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制；另一方面目標(biāo)是“致用”，即通過理性設(shè)計、操控免疫應(yīng)答的若干環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)重大疾病的免疫治療。合成免疫學(xué)的誕生與發(fā)展，代表著未來免疫治療的發(fā)展路徑，即從傳統(tǒng)以定性為主的經(jīng)典免疫學(xué)理論上升為定量、可控、規(guī)模化的工程操控為主要特征的新時代；合成免疫學(xué)的重要價值在于，有望通過合成免疫學(xué)的賦能，使未來免疫療法克服當(dāng)前限制免疫治療療效的因素，從而實(shí)現(xiàn)更理想的治療有效性和安全性。NK 細(xì)胞是重要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，并在免疫治療領(lǐng)域相比其他免疫細(xì)胞類型具有獨(dú)特的優(yōu)勢，本文將對合成免疫學(xué)驅(qū)動的NK 細(xì)胞腫瘤免疫治療在未來的潛在發(fā)展路徑進(jìn)行展望，介紹天然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，即NK 細(xì)胞）的特性、NK 細(xì)胞在未來合成免疫細(xì)胞療法中的重要地位、合成免疫細(xì)胞及分子的設(shè)計等內(nèi)容。

2 基于NK細(xì)胞的下一代免疫治療路徑

NK 細(xì)胞是一種固有免疫細(xì)胞，主要通過細(xì)胞膜表面一系列活化性、抑制性受體識別泛特異性的分子模式，從而對惡性轉(zhuǎn)化或受感染的細(xì)胞進(jìn)行識別和清除［19-21］。與T 細(xì)胞不同，NK 細(xì)胞不需要經(jīng)過預(yù)先致敏即可殺傷靶細(xì)胞。NK 細(xì)胞不僅在腫瘤轉(zhuǎn)移以及血液系統(tǒng)腫瘤等的免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用，而且NK 細(xì)胞在實(shí)體瘤中的水平也與病人良好的預(yù)后呈正相關(guān)［22］。更重要的是，NK細(xì)胞能在T 細(xì)胞所無法識別的MHC-I 低表達(dá)腫瘤中也發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［23］。由于NK細(xì)胞具備上述特征與獨(dú)特優(yōu)勢，基于NK 細(xì)胞的免疫療法是當(dāng)前免疫治療領(lǐng)域的重要方向，其中主要包括NK 細(xì)胞療法［24-26］以及NK細(xì)胞檢查點(diǎn)療法［27-29］。

“底盤細(xì)胞”是指具備自我復(fù)制能力，能被人工修飾、改造以實(shí)現(xiàn)一定免疫學(xué)效應(yīng)的免疫細(xì)胞。對底盤細(xì)胞的選擇和研究是免疫治療及合成免疫學(xué)研究的關(guān)鍵問題。當(dāng)前的免疫治療以基于T細(xì)胞的策略占多數(shù)，但基于T細(xì)胞的免疫治療存在諸多不足［30-31］：T 細(xì)胞檢查點(diǎn)療法總體應(yīng)答率偏低，腫瘤存在多種逃逸T 細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制；CAR-T 和TCR-T 療法則在治療實(shí)體瘤方面面臨靶標(biāo)抗原的丟失、免疫微環(huán)境抑制、免疫耗竭、較高毒性（細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)毒性、移植物抗宿主反應(yīng)等）、自體T 細(xì)胞質(zhì)量低下、制備時間及成本較高等問題。相比之下，NK 細(xì)胞療法則具備一系列對比優(yōu)勢，比如毒性較低、異體來源、貨架式供應(yīng)模式等［24，32-34］，因而可能是未來免疫治療中更為理想的工程化底盤細(xì)胞。

例如，有研究發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞移植后，供者NK 細(xì)胞輸注的患者中，HLA 不完全匹配的NK細(xì)胞輸注，使患者的預(yù)后更好［35］，提示使用HLA不完全匹配的NK 細(xì)胞進(jìn)行輸注治療可能具有更好的抗腫瘤效果。因此，NK 細(xì)胞治療所用的NK 細(xì)胞來源不受限于腫瘤患者自身，而可以來自異體健康人（包括外周血、臍帶血、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞等等）；在此基礎(chǔ)上，同一位健康人來源的NK細(xì)胞還可以用于多位不同配型的腫瘤患者的治療。這被稱為NK 細(xì)胞療法的“通用”特征［36-37］?；谶@一特征，提前將NK 細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)發(fā)育、分化、大量擴(kuò)增及凍存，隨時進(jìn)行供應(yīng)，能為腫瘤患者大大縮短等待治療的時間窗口，即為NK 細(xì)胞療法的“貨架式”供應(yīng)模式。此外，由于NK 細(xì)胞療法毒性較小，NK 細(xì)胞療法可以施行多次反復(fù)的NK 細(xì)胞輸注，從而進(jìn)一步提高療效。2020 年，NK 細(xì)胞療法迎來兩項(xiàng)重大突破：其一是不同來源的NK 細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；臄U(kuò)增生產(chǎn)；其二是異體CAR-NK 療法在實(shí)現(xiàn)同等療效的情況下，避免了CAR-T 療法的毒副作用［38］。這兩項(xiàng)突破意味著NK 細(xì)胞作為一種底盤細(xì)胞，從理論上具備作為免疫細(xì)胞療法的“通用型”底盤細(xì)胞的優(yōu)勢，這種策略不僅在臨床上有效、安全，而且具備規(guī)?；a(chǎn)工藝的可行性。

為了充分發(fā)揮NK 細(xì)胞療法的上述優(yōu)勢，在下一步研究中，需結(jié)合當(dāng)前及未來合成免疫學(xué)的最新進(jìn)展，對NK 細(xì)胞進(jìn)行腫瘤感受器及基因回路等的設(shè)計與構(gòu)建，繼續(xù)發(fā)展NK 細(xì)胞的定向分化與無限量生產(chǎn)技術(shù)，并開發(fā)相應(yīng)的自動化生產(chǎn)工藝。

3 合成免疫細(xì)胞的設(shè)計與生產(chǎn)

生物大分子藥物通常被設(shè)計用于中和或觸發(fā)特定靶分子的功能；而活細(xì)胞則可以執(zhí)行復(fù)雜程度更高的應(yīng)答程序。以免疫細(xì)胞為例。免疫細(xì)胞能夠基于可精確定義的條件進(jìn)行復(fù)雜環(huán)境信息的感知，隨后觸發(fā)執(zhí)行可編程的治療性應(yīng)答。因而，免疫細(xì)胞療法在執(zhí)行智能程度較高的治療策略方面，相比生物大分子而言更具潛力，將在基于合成免疫學(xué)的未來免疫治療中扮演重要角色。下文將以NK 細(xì)胞為例，闡述其智能設(shè)計與人工合成的關(guān)鍵技術(shù)。

3.1 腫瘤感受器的合成組裝

免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)識別是免疫細(xì)胞抗腫瘤療法的關(guān)鍵。裝載合成的抗原識別受體，將在NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的固有識別方式基礎(chǔ)上，額外賦予NK 細(xì)胞以腫瘤特異性識別的能力。《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表的一項(xiàng)里程碑式的研究表明，針對11 個病人，轉(zhuǎn)載CAR 的NK 細(xì)胞療法在8 個病人中體現(xiàn)出應(yīng)答，而其中的7 個病人甚至在中位數(shù)13.8 個月的時間內(nèi)不再能檢測出疾病的指標(biāo)［38］。該研究顯示CAR-NK 療法的良好耐受性以及較好的抗腫瘤療效，從概念上證明合成的抗原識別受體與NK細(xì)胞療法之間的相容性。

考慮到NK 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)規(guī)律的獨(dú)特性［39-40］，為了充分調(diào)動NK細(xì)胞的效應(yīng)功能，CAR的設(shè)計需要適應(yīng)NK 細(xì)胞特有的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)規(guī)律［41-42］。比如，在CAR 的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊設(shè)計上使用NK 細(xì)胞活化性受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域［43］。研究表明，DAP12（活化性受體NKG2C、NKp44、KIR3DS1等的接頭蛋白）［44］、2B4.z（2B4受體的共刺激結(jié)構(gòu)域+CD3ζ 結(jié)構(gòu)域）［45］，以及DAP10.z（活化性受體NKG2D 的接頭蛋白+CD3ζ 結(jié)構(gòu)域）［46］等構(gòu)造顯示出較強(qiáng)的激活CAR-NK細(xì)胞的潛能。

3.2 NK細(xì)胞的定向分化與無限量生產(chǎn)技術(shù)

合成免疫細(xì)胞療法需要制備大量免疫細(xì)胞并進(jìn)行基因改造，然而，免疫細(xì)胞作為接近于終末分化狀態(tài)的細(xì)胞，其體外擴(kuò)增能力存在瓶頸。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展則為此提供了新的解決途徑。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有類似胚胎干細(xì)胞的性質(zhì)，具備自我更新能力，能在體外進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，能通過基因編輯技術(shù)進(jìn)行精確修飾和改造，并在特定條件下被誘導(dǎo)分化成特定類型的免疫細(xì)胞。而通過對誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及進(jìn)行NK 細(xì)胞定向分化的技術(shù)路線，有潛力形成“貨架式”供應(yīng)的“通用型”免疫細(xì)胞療法［47］。

NK 細(xì)胞的定向分化技術(shù)是其中的關(guān)鍵，該技術(shù)主要包含兩個環(huán)節(jié)。首先，人胚胎干細(xì)胞以及人多能干細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞等的輔助下產(chǎn)生CD34+CD45+造血前體細(xì)胞；隨后，將富集或流式分選所得的造血前體細(xì)胞在IL-3、IL-7、IL-15、SCF、FLT3L 等細(xì)胞因子組合的條件下誘導(dǎo)分化成NK 細(xì)胞［48-50］。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由干細(xì)胞分化所得的NK 細(xì)胞與原代分離的NK 細(xì)胞及NK92 細(xì)胞系等相比具有等同的效應(yīng)功能，表明該技術(shù)路線是可行的，能用于免疫治療用NK細(xì)胞的制備［47］。

另一方面，免疫細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增工藝也是實(shí)現(xiàn)“貨架式”供應(yīng)“通用型”免疫細(xì)胞療法的一種關(guān)鍵技術(shù)。以NK 細(xì)胞為例，其擴(kuò)增技術(shù)主要分為“使用飼養(yǎng)細(xì)胞”或“無飼養(yǎng)細(xì)胞”兩種方式。

“使用飼養(yǎng)細(xì)胞”策略通常選擇在NK 敏感靶細(xì)胞的表面過表達(dá)提供NK 細(xì)胞存活、增殖信號的細(xì)胞因子如膜型IL-15 或IL-21，以及能激活NK 細(xì)胞活化性受體的配體分子如4-1BB 等。有報道在K562-mb15-4-1BBL刺激下，NK細(xì)胞能在3周內(nèi)擴(kuò)增數(shù)萬倍，并在8 周內(nèi)擴(kuò)增至千萬倍［51］；而過表達(dá)膜型IL-21的腫瘤細(xì)胞膜提取物PM21能刺激NK細(xì)胞在14天內(nèi)擴(kuò)增825倍［52］；另外，經(jīng)過TERT轉(zhuǎn)染的NK 細(xì)胞可以在K562-mb15-4-1BBL 刺激下持續(xù)被擴(kuò)增超過1年［53］，等等。

盡管“使用飼養(yǎng)細(xì)胞”策略已被用于多項(xiàng)腫瘤治療的臨床試驗(yàn)，但“無飼養(yǎng)細(xì)胞”策略長遠(yuǎn)來說更具優(yōu)勢?！盁o飼養(yǎng)細(xì)胞”策略擴(kuò)增所得的NK 細(xì)胞避免了飼養(yǎng)細(xì)胞摻入的風(fēng)險，從而降低了質(zhì)控的難度。“無飼養(yǎng)細(xì)胞”策略擴(kuò)增NK 細(xì)胞已有多項(xiàng)研究報道。比如通過培養(yǎng)瓶包被抗CD16 抗體，將PBMC 在AIM V 培養(yǎng)基、5%自體血漿、700 IU/mL IL-2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過前24小時OK432（力爾凡，即由溶血性蓮球菌Su 株經(jīng)青霉素處理、冷凍干燥制成的菌苗）的處理，在2～3 周 之 后 能 夠 獲 得4×109、純 度95.4% 的NK 細(xì)胞［54］。還有報道使用覆蓋了抗CD2、抗NKp46 抗體的珠子（miltenyi biotec）或類似的可溶性微球（Cloudz，R&D），在10 天內(nèi)獲得超過100 倍擴(kuò)增的NK 細(xì)胞［55］。此外，使用CD34+臍帶血來源干細(xì)胞，在IL-2、IL-7、IL-15 存在的條件下也可以進(jìn)行NK細(xì)胞的定向分化及擴(kuò)增［49］。以及在細(xì)胞因子基礎(chǔ)上使用額外的輔助因子，比如曾有研究者在IL-15 和/或IL-2 基礎(chǔ)上結(jié)合煙酰胺或唑來膦酸及A類鏈球菌的使用，進(jìn)行NK細(xì)胞的擴(kuò)增［56-57］。

3.3 NK細(xì)胞的功能增效

免疫細(xì)胞療法盡管在血液腫瘤的治療中取得較大突破，但目前對實(shí)體瘤的治療仍面臨有效性不足的問題。主要原因有以下幾方面：①免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別精準(zhǔn)度不足；②免疫細(xì)胞對腫瘤組織的浸潤不足；③免疫細(xì)胞受腫瘤微環(huán)境抑制；④免疫細(xì)胞的耗竭狀態(tài)；⑤免疫細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)存活能力不足。為了進(jìn)一步提升免疫細(xì)胞療法的有效性，未來可能從上述幾個方面入手，結(jié)合當(dāng)前及未來合成免疫學(xué)的最新進(jìn)展，對免疫細(xì)胞進(jìn)行修飾或改造，從而實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的功能增效。

首先，NK 細(xì)胞可以進(jìn)行腫瘤感受器如CAR分子的裝載，從而增強(qiáng)NK 細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞的特異性（3.1 節(jié)“腫瘤感受器的合成組裝”已有討論）。

其次，實(shí)體腫瘤組織中存在大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，阻礙著免疫細(xì)胞的遷移和浸潤［58］，有報道肝素酶［59］在免疫細(xì)胞浸潤腫瘤的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，缺少肝素酶的NK 細(xì)胞對腫瘤浸潤水平降低、抗腫瘤能力大幅削弱［60］，因此，通過使NK細(xì)胞過表達(dá)肝素酶，有可能使得NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)降解能力提高，提高浸潤腫瘤的能力。

浸潤到腫瘤微環(huán)境中的NK 細(xì)胞還會受到來自微環(huán)境的免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞和因子的抑制，其中最具代表性的細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子beta（tumor growth factor beta，TGF-β）［61］。TGF-β 能通過抑制NK 細(xì)胞的mTOR 信號通路從而抑制NK 細(xì)胞的活性［62-63］。而通過在NK細(xì)胞上過表達(dá)突變型的TGFβ 顯性陰性受體（mutant TGF-β dominant-negative receptor），能使NK 細(xì)胞在TGF-β 富集的腫瘤微環(huán)境中顯示出更強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，并延長荷瘤小鼠的生存率［64］。

NK 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中往往進(jìn)入功能低下的免疫耗竭狀態(tài)，這與NK 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中異常表達(dá)的檢查點(diǎn)分子有關(guān)［22］。其中，檢查點(diǎn)分子TIGIT 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中在NK 細(xì)胞表面逐漸上調(diào)表達(dá)，并介導(dǎo)NK 細(xì)胞的腫瘤免疫耗竭，而通過單克隆抗體阻斷TIGIT 可以逆轉(zhuǎn)NK 細(xì)胞的免疫耗竭狀態(tài)，在一定程度上恢復(fù)其抗腫瘤功能［65］。根據(jù)這一原理，對NK 細(xì)胞進(jìn)行Tigit基因的敲除，有可能增強(qiáng)NK 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中抵抗免疫耗竭的能力。

在NK 細(xì)胞體內(nèi)存活能力方面，有報道對胞內(nèi)檢查點(diǎn)分子CIS［66］進(jìn)行基因敲除，獲得的臍帶血或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的NK 細(xì)胞展現(xiàn)出更強(qiáng)大的抗腫瘤效能，伴隨著更強(qiáng)的mTOR 信號通路活性、更好的代謝狀態(tài)以及更強(qiáng)的體內(nèi)存活能力［67-68］。

3.4 NK細(xì)胞的“定制式+通用型+貨架式”供應(yīng)

標(biāo)準(zhǔn)化和通用化是合成生物學(xué)的重要理念［69-72］，也是合成免疫學(xué)將賦予未來免疫治療的重要特征。標(biāo)準(zhǔn)化和通用化能解決當(dāng)下免疫細(xì)胞來源不足、價格高昂等問題，同時將利于免疫治療符合監(jiān)管的要求。在該背景下，“通用型”免疫細(xì)胞療法的概念應(yīng)運(yùn)而生。

“通用型”免疫細(xì)胞療法通過提取健康人來源的免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外基因修飾等工程化改造，然后大規(guī)模擴(kuò)增及凍存，形成可以“貨架式”供應(yīng)的工程化免疫細(xì)胞產(chǎn)品；當(dāng)有患者需要進(jìn)行治療時，根據(jù)對患者生物標(biāo)志物的篩查結(jié)果，在數(shù)據(jù)庫中匹配最有可能產(chǎn)生應(yīng)答的工程化免疫細(xì)胞產(chǎn)品，從而“定制”最合適患者的治療方案，快速地將產(chǎn)品復(fù)蘇并提供給患者進(jìn)行臨床使用。NK細(xì)胞是一種具有殺傷功能的底盤細(xì)胞，NK 細(xì)胞免疫療法的優(yōu)勢之一是天然具備在同種異體間使用的特點(diǎn)，因而更容易實(shí)現(xiàn)“貨架式”供應(yīng)［73］。NK細(xì)胞免疫療法與當(dāng)前使用較多的自體免疫細(xì)胞療法［74-75］（如CAR-T、TCR-T 等）不同，其細(xì)胞來源不受限于患者自身，因而可以從來源廣泛的健康人獲取，從而進(jìn)行大規(guī)模的提前制備。如此制備獲得的產(chǎn)品對不同的患者而言是“通用”的。“通用型”免疫細(xì)胞療法除了將大幅降低生產(chǎn)成本之外，還能夠執(zhí)行嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，有助于推動監(jiān)管法規(guī)的發(fā)展，利于免疫治療行業(yè)的推廣使用及長遠(yuǎn)發(fā)展。因此，“通用型”免疫細(xì)胞療法是未來合成免疫細(xì)胞療法的關(guān)鍵之一。

3.5 創(chuàng)建“無人值守”的細(xì)胞工廠

合成免疫學(xué)驅(qū)動的下一代免疫治療，其核心在于免疫細(xì)胞底盤。包括化學(xué)藥和蛋白藥在內(nèi)的常規(guī)藥物是相對穩(wěn)定、均一、化學(xué)成分明確；而免疫細(xì)胞則是活的、可自我復(fù)制、會發(fā)生改變、能對環(huán)節(jié)產(chǎn)生響應(yīng)的［6］。只有在生產(chǎn)工藝上盡可能地使細(xì)胞藥物具有相對穩(wěn)定的遺傳成分與細(xì)胞狀態(tài)，才能使免疫細(xì)胞治療達(dá)成目標(biāo)的有效性與安全性。因而，免疫細(xì)胞生產(chǎn)環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)化及嚴(yán)格的質(zhì)控非常重要［76-78］。為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和嚴(yán)格的質(zhì)控，需要改革當(dāng)下集成度低、人手操作為主、產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的生產(chǎn)模式。

針對上述難題，工業(yè)界嘗試開發(fā)封閉式、自動化、可編程的細(xì)胞處理系統(tǒng)，即“細(xì)胞工廠”［79-81］。細(xì)胞工廠通過對實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行軟硬件編程，實(shí)現(xiàn)全流程自動化封閉式操作，從而產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定、批次間差異小、可重復(fù)性較高的細(xì)胞產(chǎn)品。由于細(xì)胞工廠消除了人工處理的環(huán)節(jié)及在不同設(shè)備之間人工轉(zhuǎn)移中間產(chǎn)物的步驟，從而系統(tǒng)性地降低潛在的污染風(fēng)險、降低來自人工操作導(dǎo)致的批次間質(zhì)量差異。細(xì)胞工廠針對特定類型細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行調(diào)試及優(yōu)化的結(jié)果還可以應(yīng)用于后續(xù)規(guī)模放大的生產(chǎn)流程。

目前“細(xì)胞工廠”主要覆蓋三個主要的生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)：原材料加工與儲存、產(chǎn)品擴(kuò)容與增能、成品儲存與提貨。具體而言，原材料加工與儲存的環(huán)節(jié)包括有核細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇；產(chǎn)品擴(kuò)容與增能環(huán)節(jié)包括目的細(xì)胞分選、細(xì)胞擴(kuò)增與分化、細(xì)胞洗滌與分裝；而成品儲存與提貨環(huán)節(jié)，包含細(xì)胞凍存、儲存與復(fù)蘇環(huán)節(jié)。此外，細(xì)胞的基因修飾與改造則根據(jù)具體細(xì)胞制備工藝的要求，可以以病毒載體等可選功能模塊的形式按需整合進(jìn)入生產(chǎn)工藝流程中。目前每個實(shí)驗(yàn)步驟都已有成品儀器被研制成功；而用以銜接不同儀器的機(jī)械臂技術(shù)、管路銜接技術(shù)及相關(guān)的軟件設(shè)計，國內(nèi)外多個單位已有一定的技術(shù)積累。可以預(yù)見，經(jīng)過軟件和硬件的進(jìn)一步整合，“貨架式”供應(yīng)的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的全流程“細(xì)胞工廠”生產(chǎn)線將很快能實(shí)現(xiàn)。屆時，以正常人的外周血作為起始原材料，經(jīng)過細(xì)胞工廠的擴(kuò)增，在一個月內(nèi)擴(kuò)增數(shù)千倍并規(guī)模凍存，一旦有患者需要用藥，即可在短時間內(nèi)復(fù)蘇細(xì)胞、運(yùn)輸?shù)结t(yī)院住院部或門診供患者進(jìn)行使用。

4 合成免疫分子的設(shè)計

免疫細(xì)胞的細(xì)胞間通訊主要通過自分泌或旁分泌細(xì)胞因子或趨化因子來實(shí)現(xiàn)［82］。細(xì)胞間通訊調(diào)控免疫細(xì)胞的招募、增殖、分化、死亡等環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。為了實(shí)現(xiàn)對免疫應(yīng)答的人工操控，未來免疫治療將使用比天然細(xì)胞因子功能更強(qiáng)大、更安全可控的新分子。“合成免疫分子”作為合成免疫學(xué)驅(qū)動的未來免疫治療的重要組成部分，是指免疫治療中使用的經(jīng)過工程化改造的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)分子經(jīng)過理性設(shè)計（工程化）、功能模塊的組合重構(gòu)等，從而使親和力和半衰期達(dá)到目的水平（定量化）；另一方面，使合成免疫細(xì)胞能夠表達(dá)、分泌經(jīng)過上述重組/重構(gòu)的免疫分子，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。合成免疫分子由于具有復(fù)合的功能或條件響應(yīng)性（智能化），因而能夠執(zhí)行天然蛋白質(zhì)分子所不具備的生物學(xué)功能。

4.1 免疫組學(xué)指導(dǎo)合成免疫分子的設(shè)計與使用

免疫組學(xué)是指免疫相關(guān)的組學(xué)技術(shù)，主要包括轉(zhuǎn)錄組［83］及蛋白質(zhì)組［84］，蛋白質(zhì)翻譯后修飾如磷酸化、乙?；?、泛素化等的組學(xué)分析，以及表觀遺傳學(xué)方面的基因組甲基化的全局信息等。免疫組學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用對合成免疫分子的設(shè)計與開發(fā)具有重要意義。腫瘤微環(huán)境的屬性取決于腫瘤類型、進(jìn)展階段和“冷/熱”狀態(tài)等因素，其影響因素復(fù)雜多變，全面而準(zhǔn)確地對腫瘤微環(huán)境進(jìn)行描繪已成為當(dāng)今腫瘤免疫學(xué)研究的關(guān)鍵挑戰(zhàn)［12］。未來不同層次的組學(xué)技術(shù)，特別是在單細(xì)胞水平、結(jié)合組織空間定位信息的情況下，將有機(jī)構(gòu)成完善的免疫組學(xué)系統(tǒng)分析體系。通過多學(xué)科交叉的合作，借助強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，整合不同層次的海量數(shù)據(jù)，從中提取具有生物學(xué)意義的信息，將為合成免疫分子的理性設(shè)計及生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供重要的支撐。

首先，免疫組學(xué)可能提供免疫治療的新靶點(diǎn)及相關(guān)信息。比如，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可以揭示出腫瘤微環(huán)境中重要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞群體，并提示群體特異性的潛在檢查點(diǎn)分子，描繪出腫瘤微環(huán)境中檢查點(diǎn)分子及其配體分子的完整表達(dá)譜，繼而推測可能涉及的細(xì)胞間相互作用關(guān)系，為新檢查點(diǎn)療法的開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

另一方面，生物標(biāo)志物對包括免疫檢查點(diǎn)療法在內(nèi)的合成免疫分子的理性設(shè)計與臨床治療使用至關(guān)重要［85］，而免疫組學(xué)將有可能為上述免疫療法提供新的生物標(biāo)志物。比如，PD-1/PD-L1 免疫檢查點(diǎn)療法的應(yīng)答水平高度依賴于腫瘤局部高表達(dá)的PD-L1分子，因而通過PD-L1生物標(biāo)志物的篩查，能夠預(yù)判腫瘤患者是否適用于PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)療法，從而通過腫瘤標(biāo)志物的篩查提高患者應(yīng)答療法的可能性［86］。

4.2 高效減毒細(xì)胞因子的設(shè)計與合成

合成免疫分子理性設(shè)計的重要目標(biāo)是同時具備高效、減毒的特性［87-89］。比如，天然的IL-2分子在臨床使用中具有較大的毒性［90］，但研究發(fā)現(xiàn)IL-2分子的毒性在IL-2 受體的高親和力亞基CD25（IL-2Rα）的基因缺失小鼠中大為減輕［91］。因此，Garcia等［92］針對性構(gòu)建出的一種IL-2 超級細(xì)胞因子（Super-2）能夠繞過CD25來發(fā)揮功能。CD25是腫瘤微環(huán)境中富集的具有免疫負(fù)調(diào)控功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞標(biāo)志［93］。Super-2 的使用有可能在腫瘤微環(huán)境中激活T 細(xì)胞的應(yīng)答，同時避免刺激調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的擴(kuò)增。而為了在繞過CD25 的情況下同時進(jìn)一步增強(qiáng)IL-2 的活性及穩(wěn)定性，Garcia 組與Baker組［94］合作開發(fā)了一種從頭設(shè)計合成分子的計算手段，得到的Neo-2/15 具有與天然IL-2 幾乎完全不同的序列（與天然IL-2 同源性僅在20%左右），它不僅可以繞開CD25 產(chǎn)生高效低毒的免疫學(xué)效應(yīng)，而且具有更高的親和力和穩(wěn)定性。除了親和力、穩(wěn)定性外，基于氨基酸序列免疫原性的預(yù)測，人工合成免疫分子還可以通過使用較低免疫原性的序列，提高在體內(nèi)長期使用時的穩(wěn)定性及治療有效性。如此類似Super-2 和Neo-2/15 的高效減毒的合成免疫分子，或單獨(dú)用于治療，或聯(lián)合合成免疫細(xì)胞療法使用，或由合成免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在未來的免疫治療策略中，是調(diào)控免疫應(yīng)答的啟動和終止的有力工具，能夠使免疫應(yīng)答更有效、更安全地達(dá)成治療目標(biāo)。

4.3 雙/多功能抗體

合成免疫分子的一種重要類別是雙功能抗體。

單克隆抗體藥物主要通過結(jié)合一個抗原表位產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。單克隆抗體藥物在臨床治療腫瘤、自身免疫性疾病等的成功［95］，推動著抗體分子的工程化發(fā)展。與單克隆抗體相比，雙功能抗體可以同時結(jié)合兩個抗原表位，是一種代表性的合成免疫分子。雙功能抗體可以將效應(yīng)細(xì)胞直接靶向腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性；或激活/中和超過一個免疫受體分子，從而發(fā)揮特殊的生物學(xué)功能；與兩種單抗藥物聯(lián)合使用相比，雙功能抗體減少了藥物開發(fā)和臨床試驗(yàn)的成本［96］。

目前獲批上市的具有腫瘤免疫學(xué)效應(yīng)的雙功能抗體中，Catumaxomab 能夠同時靶向腫瘤表面抗原EpCAM和T細(xì)胞標(biāo)志CD3［97］，而Blinatumomab可以同時結(jié)合B 細(xì)胞瘤標(biāo)志CD19 和T 細(xì)胞標(biāo)志CD3［98］。通過這樣的方式，這些抗體激活并招募?xì)訲細(xì)胞直接對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

除此之外，雙功能抗體還可以同時靶向兩個腫瘤抗原，或兩種細(xì)胞因子，從而起到雙重的中和效應(yīng)，比 如靶 向HER2/HER3［99］、IL-17A/IL-17F［100］等的雙特異性抗體。

因而，雙/多功能抗體是一種前瞻性的合成免疫分子技術(shù)，能發(fā)揮單抗藥物所不能及的生物學(xué)效應(yīng)，但其產(chǎn)業(yè)化面臨的諸多挑戰(zhàn)，如生產(chǎn)工藝上的錯配問題、純化問題和穩(wěn)定性問題等等，仍有待進(jìn)一步的研究投入才能解決［101-102］。

4.4 腫瘤新生抗原的預(yù)測指導(dǎo)合成免疫分子的設(shè)計

嵌合抗原受體是一類與免疫細(xì)胞療法密切相關(guān)的合成免疫分子［103-105］。前述章節(jié)中提到，免疫細(xì)胞療法的關(guān)鍵技術(shù)之一是通過“腫瘤感受器”即嵌合抗原受體的設(shè)計與構(gòu)建，使免疫細(xì)胞精準(zhǔn)識別腫瘤細(xì)胞。作為一種能區(qū)分腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的合成免疫分子，嵌合抗原受體的設(shè)計難點(diǎn)在于精準(zhǔn)地獲悉腫瘤特異性的抗原信息。在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞會逐漸積累體細(xì)胞突變［106-107］，這些突變中的一部分會發(fā)生在蛋白質(zhì)的DNA 編碼區(qū)域，從而產(chǎn)生新的腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤新生抗原［108］。通過高外顯子測序進(jìn)行初步篩選，然后對HLA-1 親和富集所得的抗原表位肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，最后進(jìn)行計算分析，從而得到獲取腫瘤新生抗原表位的序列信息［109-110］。基于這些序列信息，就能夠精準(zhǔn)地設(shè)計具有腫瘤特異性的嵌合抗原受體，從而使免疫細(xì)胞能夠精準(zhǔn)識別腫瘤細(xì)胞。

4.5 人源化小鼠模型指導(dǎo)合成免疫療法

合成免疫治療策略的優(yōu)化設(shè)計，要求更完整地認(rèn)識人類疾病的發(fā)病機(jī)制。然而，目前仍缺少能夠真實(shí)反映人類疾病發(fā)病機(jī)制的動物模型。小鼠的免疫系統(tǒng)和疾病模型與人體內(nèi)發(fā)生的真實(shí)情形有一定差距，導(dǎo)致很多在小鼠模型中觀察到的現(xiàn)象及揭示的規(guī)律無法在人類疾病中重現(xiàn)。為了解決這一問題，使 用 人 源 細(xì) 胞 在NOD（non-obese diabetic）-SCID（severe combined immunodeficient）-IL2γ-/-（即NSG 小鼠）［111］等免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建人類免疫系統(tǒng)（HIS，humanized immune system）及人源組織器官［112］的方式，可以在小鼠體內(nèi)建立最大程度反映人類疾病發(fā)病機(jī)制的人源化小鼠模型，從而使免疫學(xué)基礎(chǔ)研究的結(jié)論更加準(zhǔn)確，以及免疫治療策略的研發(fā)成功率更高。另一方面，腫瘤組織相比普通組織器官而言具有更復(fù)雜的區(qū)域特性［113］。真實(shí)的腫瘤微環(huán)境的形成，是一個腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞類型相互作用下時間演進(jìn)變化的結(jié)果。腫瘤患者來源的腫瘤組織可以最大程度地反映人類腫瘤微環(huán)境的屬性，因此，在免疫系統(tǒng)人源化小鼠基礎(chǔ)上，通過人源腫瘤組織來源移植瘤（PDX，patient-derived xenograft）［114］建立腫瘤模型，能夠建立最接近人類腫瘤組織區(qū)域特性的腫瘤模型。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行多組學(xué)比對研究（Exome-Seq、Methylomics、Proteomics、Metabolomic、scRNA-Seq、CyTOF等等），可獲知接近于人類腫瘤微環(huán)境的全景信息，從而可以動態(tài)了解其抗腫瘤免疫應(yīng)答，所獲取的海量信息將有助于設(shè)計更有效的合成免疫療法。

5 結(jié)語及展望

在前文中，我們對腫瘤免疫治療的現(xiàn)狀及未來可能的發(fā)展趨勢進(jìn)行了描繪?？傮w而言，當(dāng)代免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療之后的又一重要范式，繼代表性的PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)療法和靶向CD19的CAR-T細(xì)胞療法之后，隨著越來越多適應(yīng)證的一線治療方案獲批，免疫治療將在腫瘤治療等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，并將吸引越來越多研究資源的投入。此時更需要仔細(xì)分析免疫治療手段所處的發(fā)展階段，從而前瞻性地對關(guān)鍵突破方向進(jìn)行布局。毋庸置疑，免疫治療近年來在腫瘤治療等領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)展，然而有效性和安全性仍需進(jìn)一步提高；盡管CAR-T療法等在一些血液系統(tǒng)腫瘤的治療中取得了較高的治愈率，但考慮到更多的腫瘤屬于實(shí)體瘤范疇，而CAR-T 療法及檢查點(diǎn)療法等對此的應(yīng)答率仍偏低，因而免疫治療離治愈大多數(shù)腫瘤的目標(biāo)仍有很大的距離。這種差距的內(nèi)在原因之一是我們對免疫細(xì)胞和分子的工程化改造仍處在早期階段，僅僅初步展現(xiàn)了人工操控免疫應(yīng)答的潛力。而未來只有充分掌握免疫細(xì)胞和分子工程化改造的規(guī)律，才能充分調(diào)動免疫應(yīng)答的潛力；而為了更好地揭示免疫細(xì)胞和分子工程化改造的規(guī)律，更根本的手段是進(jìn)一步認(rèn)識免疫應(yīng)答的調(diào)控原理，特別是在作為工程學(xué)基礎(chǔ)的定量研究方面。

而此時合成生物學(xué)的發(fā)展則適逢其時地助推了這一發(fā)展趨勢。合成生物學(xué)更講究理性設(shè)計、定量化、工程化，正符合免疫治療從定性研究為主過渡到定量研究、工程化改造的發(fā)展階段。基于SynNotch“與門”設(shè)計的雙抗原識別型CAR-T［115］、高效減毒“超級細(xì)胞因子”Super-2等［94］的從頭設(shè)計或理性設(shè)計等，正是合成生物學(xué)應(yīng)用到免疫細(xì)胞或分子工程化改造的典范。除此之外，工程化改造免疫細(xì)胞及分子的“合成免疫學(xué)”領(lǐng)域正在揭示免疫治療在未來更多的可能性：免疫細(xì)胞療法將逐漸走向“通用型”的“貨架式”供應(yīng)模式；NK 細(xì)胞作為免疫細(xì)胞治療行業(yè)的“后起之秀”，以其獨(dú)特的優(yōu)勢，將在“通用型”免疫細(xì)胞療法中嶄露頭角；精準(zhǔn)設(shè)計的嵌合抗原受體及基因回路將賦予免疫細(xì)胞更高的“智能”和更強(qiáng)的療效；封閉式、自動化、可編程的“細(xì)胞工廠”將顛覆細(xì)胞治療行業(yè)“小作坊”式的普遍亂象，為行業(yè)的規(guī)模化、規(guī)范化發(fā)展鋪平道路；免疫組學(xué)及人源化小鼠模型將提供更貼近人類疾病狀況的海量數(shù)據(jù)，為理性設(shè)計減毒增效的合成免疫分子奠定基礎(chǔ)，而合成免疫分子的使用，將結(jié)合合成免疫細(xì)胞療法，為人工操控免疫應(yīng)答提供了更多的可能性?？梢灶A(yù)期，合成免疫學(xué)將大大拓寬我們對免疫學(xué)基礎(chǔ)理論的認(rèn)識，在更充分揭示免疫細(xì)胞及分子的工程化改造規(guī)律基礎(chǔ)上，將驅(qū)動未來免疫治療走上更高的舞臺。