胡佩瑩，李莉,羅濤,楊永寧,汪生花

(1.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，西寧 812100;2.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016;3.青海西寧湟中區(qū)西堡鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，湟中 810000)

“大通牦牛”是以青海昆侖山野牦牛為父本與家牦牛人工雜交的培育品種[1]，主要分布于海拔3000～4500m的青藏高原地區(qū)[2]，經(jīng)過長(zhǎng)期的人工選育和大量的試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)大通牦牛心肌組織在初生早期發(fā)育過程中從組織形態(tài)學(xué)、解剖生理學(xué)和分子生物學(xué)等方面都表現(xiàn)出對(duì)低氧環(huán)境適應(yīng)性能力強(qiáng)[3]。對(duì)大通犢牦牛初生早期的低氧環(huán)境下適應(yīng)性代償改變和功能性的研究為生物的高原適應(yīng)性研究奠定基礎(chǔ)。

缺氧時(shí)，HIF-1α通過結(jié)合VEGF啟動(dòng)因子上的低氧應(yīng)答原件，啟動(dòng)VEGF基因轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)VEGF的大量表達(dá)。Yanyu He[4]等研究表明，HIF-1α、VEGF是處于高海拔地帶的藏牦牛對(duì)低氧環(huán)境的生理適應(yīng)和心肌發(fā)育過程中必不可少的影響因子。因此本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量法對(duì)從妊娠4月到出生3月的大通犢牦牛心肌組織HIF-1α表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。與此同時(shí)，通過免疫組織化學(xué)法，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平觀察大通牦牛生長(zhǎng)發(fā)育初期心肌組織中的VEGF分布，并對(duì)兩者相關(guān)性進(jìn)行分析研究。為探討大通牦牛心肌組織初期發(fā)育的低氧適應(yīng)機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源與處理

本試驗(yàn)采用青海省大通種牛場(chǎng)(海拔3200m)大通牦牛，在出生1日齡、1月齡、3月齡、6月齡采集心肌組織各4頭份，臨床健康，不計(jì)性別。

供試牛棲息地現(xiàn)場(chǎng)屠宰每頭牛并在其左心室取一塊1 mm×1 mm×2mm大的組織，取材時(shí)避開血管、脂肪組織。立即取材完成后，其中兩頭份用于固定：立即放入2.5%戊二醛溶液中4℃預(yù)固定24h，1%鋨酸二次固定。另外兩頭份液氮速凍后置于-180℃凍存用于提取RNA測(cè)定HIF-1α mRNA表達(dá)量。

1.2主要儀器與試劑

REAL-TIME PCR擴(kuò)增儀、普通PCR擴(kuò)增儀(C1000 TouchTM)、紫外凝膠成像儀(Gel Doc XR+)、核酸蛋白檢測(cè)儀，以上均購(gòu)自BIO-RAD；Taq PCR MasterMix、RNAsimple Total RNA Kit、FastQuant cDNA，以上均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司； ZPJ-1A展片機(jī)、KPJ-1A 烤片機(jī)、LKB-2188(瑞典) 組織切片機(jī)、Epon812生物組織包埋冷凍臺(tái)、Epon812生物組織包埋機(jī)、JEM-2000EX透射電鏡(日本)。

1.3形態(tài)立體定量分析方法

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

參考相關(guān)文獻(xiàn)，通過NCBI查詢普通牛HIF-1α 基因的mRNA序列( DQ838046.1 )，并根據(jù)其序列利用DNAstart設(shè)計(jì)合成2對(duì)熒光定量PCR的特異性上、下游引物：HIF-1αF:5’-GATAAACTTAAGAAGGAGCCTGATGCT-3’HIF-1αR:5-TGTCATTGCTGCCAAAATCTAAAG-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段191bp。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5總RNA提取及cDNA第一鏈的合成。

利用 TaKaRa 公司 TRIZOL 提取總 RNA， 用紫外分光光度法測(cè)定其濃度及純度，并用變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。參照 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 指導(dǎo)說明，進(jìn)行 cDNA第一鏈合成。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

1.6PCR擴(kuò)增目的片段

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：PremixTaq酶12.5 μL，上、下游引物 0.5μL，cDNA模板 2.0 μL，ddH2O 9.5 L。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃續(xù)延申10 min，充分延伸 4 ℃ 終止。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/ L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7Real-time PCR反應(yīng)

Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的加樣體系如下：模板2μL，濃度為10μM的上、下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5μL。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，由單鏈變雙鏈，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5min，94℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 2 min，39個(gè)循環(huán)；78℃ 1s，72 ℃續(xù)延申10 min，65-95 每0.05s讀一次刻度。其中每三個(gè)做一次重復(fù)。

1.8數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0版 Duncan’s 進(jìn)行多重比較 (ρ=0.05)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (`X±S )表示。

2 結(jié)果與分析

2.1大通犢牦牛心肌組織早期發(fā)育過程中定量參數(shù)變化情況如圖1和表1所示大通牦牛出生后，其心肌線粒體平均截面積、平均體積和體積密度表現(xiàn)為先降低再升高的趨勢(shì)，面數(shù)密度隨年齡增長(zhǎng)逐漸升高；除面數(shù)密度外，其余各組差異不顯著。

圖1 大通牦牛心肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)分布(10000×)

表1 心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)參數(shù)表

2.2目的基因片段的獲得

如圖2所示HIF-1α基因片段擴(kuò)增結(jié)果及重組子PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度相符。

圖2 大通犢牦牛心肌組織HIF-IαPCR cDNA序列擴(kuò)增

2.3大通犢牦牛心肌組織中HIF-1α基因mRNA表達(dá)量

如表2顯示大通犢牦牛心肌組織HIF-1α mRNA表達(dá)量出生后先降低后不斷增加，六月齡又到達(dá)峰值，不同組別間差異極顯著(p<0.01)。

表2 大通犢牦牛心肌組織中HIF -1αmRNA基因拷貝數(shù)

3 討論

高海拔低氧環(huán)境下，初生動(dòng)物從全身、局部和細(xì)胞各方面均產(chǎn)生代償性的變化，以增加機(jī)體內(nèi)氧的呼吸代謝途徑便于盡快適應(yīng)出生后環(huán)境的改變[5]。因此在缺氧環(huán)境下心肌線粒體會(huì)發(fā)生一系列的應(yīng)激性變化。此前青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院李莉[6-17]等有大量研究表明：心肌線粒體對(duì)外界惡劣環(huán)境刺激以及機(jī)體自身病變應(yīng)激較敏感，是細(xì)胞器中最易發(fā)生變化的細(xì)胞器。高原低氧環(huán)境下牦牛心肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量相較于平原黃牛會(huì)發(fā)生一系列的改變，故缺氧是造成心肌線粒體發(fā)生形態(tài)學(xué)變化的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大通牦牛從出生后1日齡到6月齡早期發(fā)育過程中，心肌線粒體平均截面積、平均體積、體積密度表現(xiàn)為先降低再升高的趨勢(shì)，面數(shù)密度隨發(fā)育期的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，面數(shù)密度差異顯著。體積密度和面數(shù)密度是衡量線粒體功能的重要結(jié)構(gòu)參數(shù)，因此,從出生后一日齡犢牦牛為適應(yīng)高原低氧環(huán)境，體密度和面密度逐漸的上升到趨于穩(wěn)定的特點(diǎn)，與之前的大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明相一致，由此可見，心肌線粒體結(jié)構(gòu)功能的改變是高原動(dòng)物早期發(fā)育過程中克服低氧環(huán)境的一個(gè)重要機(jī)制。

HIF是1992年發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子[18,19]。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體處于缺氧時(shí)和其他因子共同參與調(diào)節(jié)心肌組織血液循環(huán)供氧的能力。本實(shí)驗(yàn)顯示犢牦牛心肌線粒體HIF-1α的表達(dá)量出生后三個(gè)月呈上升趨勢(shì)。這與前期研究的大通牦牛心肌線粒體特征性基因表達(dá)量變化趨勢(shì)相一致[20]。近年來研究表明[21-24]，高原動(dòng)物對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制主要為：EPO升高、心肌線粒體數(shù)量增多、組織線粒體標(biāo)志性酶表達(dá)升高、呼吸器官功能增強(qiáng)等。這些因素調(diào)節(jié)有賴于組織器官對(duì)氧分壓感受對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而激活HIF-1α的表達(dá)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果佐證了高原低氧環(huán)境下大通犢牦牛心肌線粒體通過改變HIF-1α表達(dá)量增強(qiáng)心血管功能，建立維持基本生命活動(dòng)的一種保護(hù)機(jī)制。但到底是怎樣的機(jī)制形式還需進(jìn)一步研究。

綜上所述大通犢牦牛心肌組織在初生早期發(fā)育過程中HIF-1α不斷誘導(dǎo)VEGF大量表達(dá)。由此表明大通犢牦牛心肌組織低氧耐受性與HIF-1α對(duì)VEGF的調(diào)控息息相關(guān)，但具體的調(diào)控機(jī)制還亟需進(jìn)一步研究。