段麗杰，王立新

（天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

我國是“乙肝大國”，實(shí)施乙型肝炎免疫預(yù)防策略近30 年，一般人群乙肝病毒表面抗原攜帶率仍高達(dá)7.18%［1-2］。慢性乙型肝炎人群由于反復(fù)的炎癥損傷及修復(fù)，極易出現(xiàn)肝臟纖維化，逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，甚至危及生命。肝纖維化作為慢性乙肝病毒感染疾病進(jìn)程的中間環(huán)節(jié)，是臨床有效改善防控疾病進(jìn)展、延長壽命、降低經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CCl4所致肝纖維化模型作為研究對象，采用甘草酸二銨作為受試藥物，求證該藥在調(diào)控氧化應(yīng)激損傷、延緩肝纖維化疾病發(fā)展進(jìn)程中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性C57BL/6 小鼠50 只，體重（20±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供［SYXK（京）2019-0022］，小鼠飼養(yǎng)于SPF 級清潔環(huán)境中，自由進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 甘草酸二銨膠囊（正大天晴集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司，批號210317110）；水飛薊賓（上海源葉生物科技有限公司，批號R10F11Y108464）；CCl4（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號20190828）；橄欖油（山東魯花集團(tuán)有限公司，批號20190507）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號20191031）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號20191028）、白蛋白（ALB，批號 20191020）、總蛋白（TP，批號20190803）均來源于南京建成生物工程研究所有限公司；α 平滑肌動蛋白［α-SMA，abcam（上海）貿(mào)易有限公司，批號ab7817］；總RNA提取試劑盒（#DP419，批號 #DP419）、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（#KR116-02，批號 #R6906）、SYBR 擴(kuò)增試劑盒 （#P205-02，批號#S7516），均來源于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 高性能通用臺式冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific，型號：Thermo Sorvall ST16R）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，型號：Multiskan FC）；光學(xué)顯微鏡（Nikon，型號：ECLIPSE TS100）；熒光定量PCR 儀（Bio-RAD，型號：iQTM5）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肝纖維化小鼠模型的建立 通過腹腔注射CCl4建立肝纖維化小鼠模型。選取雄性C57BL/6 小鼠，體重（20±2）g，將CCl4溶于橄欖油中制備20%的CCl4橄欖油溶液，每只小鼠腹腔注射20%的CCl4橄欖油溶液2 ml/kg，2 次/周，連續(xù)注射 6 周（每周一、周四注射）。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案 選取雄性C57BL/6 小鼠50 只，體重（20±2）g，隨機(jī)分成 5 組，每組 10 只，具體分組方案如下：正常組：腹腔注射橄欖油0.2 ml，2 次/周，連續(xù)注射6 周；模型組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃生理鹽水0.2 ml/d，連續(xù)灌胃4 周；陽性藥組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃100 mg（/kg·d）水飛薊賓，連續(xù)灌胃4周；甘草酸二銨低劑量組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃甘草酸二銨68 mg（/kg·d），連續(xù)灌胃4周；甘草酸二銨高劑量組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃甘草酸二銨136 mg（/kg·d），連續(xù)灌胃4 周。

2.3 指標(biāo)觀察 造模及給藥結(jié)束后檢測各組小鼠體重，稱取肝臟重量，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)公式為：肝指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/體重（g）×100%。

2.4 血清肝功能指標(biāo)檢測 造模給藥后，小鼠目內(nèi)眥取血，常溫靜置 30 min，于 4 ℃、3 500 r/min 離心，取上清液，-80 ℃保存待測。使用生化試劑盒測定各組小鼠血清中血清ALT、AST、ALB 及 TP 的含量。

2.5 病理學(xué)觀察 造模給藥后收集各組小鼠肝臟組織，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成3 μm 切片，常規(guī)HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理學(xué)改變，同時對肝臟進(jìn)行masson 及天狼星紅染色，觀察各組小鼠肝臟纖維化程度，masson 染色結(jié)果：膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色；天狼星紅染色結(jié)果：膠原纖維呈紅色，細(xì)胞核呈綠色。在200×視野下隨機(jī)選取3 個視野，運(yùn)用Image Pro Plus 6.0 對纖維染色陽性區(qū)域進(jìn)行量化，檢測積分光密度（IOD），計(jì)算陽性表達(dá)區(qū)域。

2.6 免疫組化檢測 將肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，封閉，α-SMA（0.034 μg/ml）4 ℃ 孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下拍照，運(yùn)用Image Pro Plus 6.0 對纖維染色陽性區(qū)域進(jìn)行量化，檢測積分光密度（IOD），計(jì)算陽性表達(dá)區(qū)域。

2.7 肝組織勻漿抗氧化指標(biāo)檢測 稱取0.1 g 凍存的肝組織，置于900 μl 生理鹽水中，渦旋30 s，之后3 000 r/min 離心15 min 制備10%的肝組織勻漿。按試劑盒說明書分別測定SOD、MDA 和GSH-Px 抗氧化指標(biāo)水平。

2.8 熒光定量PCR 檢測 造模給藥結(jié)束后，提取各組小鼠肝組織中總RNA，利用轉(zhuǎn)錄酶將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測各組小鼠肝組織中抗氧化相關(guān)基因SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)以β-actin 為內(nèi)參，運(yùn)用2-△△CT方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，采用t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體重和肝指數(shù)水平比較 造模給藥后，與正常組比較，模型組小鼠體重顯著降低（P＜0.01），肝指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組（P＜0.05）、甘草酸二銨低劑量組（P＜0.05）和甘草酸二銨高劑量組（P＜0.01）小鼠體重顯著上升，肝指數(shù)顯著下降（P＜0.01）。見表 2。

表2 造模給藥后各組小鼠體重及肝指數(shù)水平比較

3.2 血清肝功能指標(biāo)比較 造模給藥后，與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT 和AST 水平顯著升高（P＜0.01），ALB 和 TP 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量組和甘草酸二銨高劑量組血清ALT 及AST 水平顯著降低（P＜0.01），ALB 及 TP 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表 3。

表3 造模給藥后各組小鼠血清ALT、AST、ALB 及TP 水平比較

3.3 HE 染色結(jié)果 肝組織HE 染色結(jié)果表明，模型組小鼠肝細(xì)胞排列散亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞氣球樣變，同時可觀察到明顯的炎細(xì)胞浸潤，甘草酸二銨組小鼠肝細(xì)胞排列較模型組更為整齊，肝細(xì)胞氣球樣變及肝組織中炎細(xì)胞浸潤均有所緩解。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織HE 染色（200×）

3.4 Masson 和天狼星紅染色結(jié)果 masson 及天狼星紅染色結(jié)果表明，模型組小鼠肝組織纖維含量顯著增加（P＜0.01），甘草酸二銨干預(yù)可顯著減少肝纖維化模型小鼠肝組織中纖維沉積（P＜0.01）。見圖2-5。

圖2 各組小鼠肝組織massson 染色（200×）

圖3 各組小鼠肝組織天狼星紅染色（200×）

圖4 各組小鼠肝組織massson 染色陽性表達(dá)區(qū)域（n=10）

3.5 免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色表明，正常組小鼠肝組織中僅見少量α-SMA 表達(dá)。與正常組比較，模型組肝組織中可見大量α-SMA 陽性區(qū)域（P＜0.01），呈棕褐色，主要集中在匯管區(qū)、中央靜脈、假小葉纖維膈及臨近的肝竇區(qū)周圍；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量組和甘草酸二銨高劑量組陽性表達(dá)呈不同程度的降低（P＜0.01）。見圖6和圖7。

圖5 各組小鼠肝組織天狼星紅染色陽性表達(dá)區(qū)域（n=10）

圖6 各組小鼠肝組織α-SMA 染色（200×）

圖7 各組小鼠肝組織α-SMA 染色陽性表達(dá)區(qū)域（n=10）

3.6 肝組織勻漿抗氧化指標(biāo)水平比較 與正常組比較，模型組 SOD 和 GSH-P 活性明顯降低（P＜0.01），MDA 水平明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量和甘草酸二銨高劑量組SOD和 GSH-P 活性顯著升高（P＜0.01），MDA 水平明顯降低（P＜0.01）。見表 4。

表4 造模給藥后各組小鼠肝組織勻漿SOD、MDA 及GSH-Px 水平比較

3.7 甘草酸二銨對肝纖維化模型小鼠肝組織抗氧化水平的影響 qPCR 結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠肝組織中 Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 mRNA 表達(dá)顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量和甘草酸二銨高劑量組Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 mRNA 明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 8。

圖8 各組小鼠肝組織Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 mRNA 表達(dá)水平（n=6）

4 討論

肝纖維化是一種慢性疾病，可由肝毒性、生物因素（肝炎病毒、細(xì)菌、寄生蟲等）、化學(xué)因素（藥物、工業(yè)毒物、酒精等）和環(huán)境因素［3］引起。長期的肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌和肝衰竭［4］。因此，改善慢性肝纖維化對于預(yù)防肝硬化和肝功能衰竭的發(fā)生至關(guān)重要。甘草酸二銨是中藥甘草有效成分的第三代提取物，具有較強(qiáng)的抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞膜及改善肝功能的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討甘草酸二銨對肝纖維化治療的作用機(jī)制，判斷其是否與調(diào)控氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，并為其臨床用藥提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

研究表明，多種因素可以導(dǎo)致肝臟發(fā)生纖維化,其中肝內(nèi)氧化應(yīng)激損傷是重要的機(jī)制之一［5］, 參與到了肝臟內(nèi)膠原成分的沉積, 因此，研究降低氧化應(yīng)激水平的治療方案, 是治療肝纖維化的研究熱點(diǎn)之一。Nrf2 通路是氧化應(yīng)激的重要通路，有文獻(xiàn)報(bào)道，Nrf2的異常表達(dá)可能與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。Nrf2 入核后可誘導(dǎo)下游 HO-1、NQO1、GCLC 等基因表達(dá)［6-7］，提高組織抗氧化能力進(jìn)而起到保護(hù)的作用［8-10］，因此提高 Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC 等基因的表達(dá)是緩解氧化應(yīng)激損傷的重要方案之一。本研究采用甘草酸二銨對CCl4所致肝纖維化模型進(jìn)行了降低氧化應(yīng)激水平作用機(jī)制的探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥明顯改善模型動物肝臟纖維化水平和肝臟組織中氧化應(yīng)激相關(guān)因子 Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 的表達(dá)，進(jìn)一步詮釋甘草酸二銨在治療肝纖維化的作用機(jī)制，為甘草酸二銨通過緩解氧化應(yīng)激損傷作用的治療機(jī)制提供了基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)。