隋 鑫 解 朋 黃建敏 高建青 景建敏 魏玲格▲ 吳煒杰 于宏偉

1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，河北石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北石家莊 050051

促甲狀腺激素受體抗體（thyrotropin receptor an-tibody，TRAb）陽性率高達(dá)80%～100%，不僅對(duì)于毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves ?。┑妮o助診斷具有重要的價(jià)值，而且對(duì)于判斷Graves 病的活動(dòng)期及制訂停藥計(jì)劃等均具有一定意義[1-3]。TRAb 是一組多克隆抗體，主要包括甲狀腺刺激性抗體和甲狀腺刺激阻斷性抗體，其中甲狀腺刺激性抗體是誘發(fā)Graves 病的主要致病抗體，通過激活促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）受體引起甲狀腺功能亢進(jìn)癥，而甲狀腺刺激阻斷性抗體可阻斷TSH 與受體結(jié)合，與甲狀腺功能減退癥發(fā)生有關(guān)[4]。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，TRAb 檢測(cè)方法逐漸增多，如放射免疫分析法、電化學(xué)發(fā)光法（electrochemical luminescence assay，ECLIA）等。由于放射免疫分析法耗時(shí)、具有放射性等缺點(diǎn)，目前已經(jīng)較少使用[5-7]。電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定TRAb 已經(jīng)在科研中廣泛應(yīng)用，但該方法在臨床上存在成本較高的缺點(diǎn)，一定程度上限制了其應(yīng)用。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法（chemical luminescence assay，CLIA）具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在中國廣泛使用，但其在測(cè)定TRAb 的準(zhǔn)確性上，目前缺少相關(guān)的研究[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室將磁微粒化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)發(fā)光測(cè)定TRAb進(jìn)行對(duì)比分析，探討磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測(cè)定血清TRAb的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年11 月至12 月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）內(nèi)分泌科門診及住院部送檢患者血清樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①樣本容量＞3 ml；②最終診斷明確；③年齡＞18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①樣本存在溶血、脂血、乳糜血等情況；②高于或低于任意一種方法的檢測(cè)范圍；③補(bǔ)充生物素的患者除外。共納入118 例，其中女82 例，男36 例；年齡18～80 歲，平均（42.3±17.6）歲。臨床診斷原發(fā)性甲狀腺功能亢進(jìn)癥43 例，其中36 例經(jīng)甲狀腺血清學(xué)指標(biāo)、超聲及體征確診為Graves 病患者，原發(fā)性甲狀腺功能減退癥8 例，橋本氏甲狀腺炎9 例，亞急性甲狀腺炎4 例，甲狀腺結(jié)節(jié)5 例，甲狀腺癌1 例，健康查體20 例及臨床診斷非甲狀腺疾病者28 例。

1.2 儀器和試劑

將血清樣本同時(shí)分別采用直接CLIA 和ECLIA兩種方法檢測(cè)TRAb。CLIA：使用深圳新產(chǎn)業(yè)Snibe MAGLUMI 4000Plus 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品。ECLIA：使用德國Roche Cobas e602 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品。實(shí)驗(yàn)所需樣本容量為50 μl，總體實(shí)驗(yàn)時(shí)間30 min，CLIA 和ECLIA 定量檢測(cè)TRAb 的線性范圍分別為0.25～40.00 IU/L 和0.3～40.0 IU/L，參考區(qū)間分別為＜1.5 IU/L 和＜1.75 IU/L。

1.3 研究方法

1.3.1 一致性評(píng)價(jià) 依據(jù)CLSI EP09-A3[10]文件，對(duì)118 例血清樣本進(jìn)行兩種方法學(xué)一致性評(píng)價(jià)。

1.3.2 精密度驗(yàn)證 參考CLSI-A3 文件，取低濃度和高濃度血清樣本，以CLIA 法，每個(gè)水平每天重復(fù)測(cè)定4 次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算各自測(cè)量的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：以室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限作為允許總誤差（TEa），批內(nèi)變異系數(shù)（CV）＜1/4 TEa，批間CV＜1/3 TEa。

1.3.3 線性范圍驗(yàn)證 參考EP6-A 文件，選擇一份濃度值在線性范圍上限的高值血清樣本（H）和一份濃度接近于零值的血清樣本（L），將2 份樣本按比例5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L 混合，以CLIA法檢測(cè)其濃度，每個(gè)樣本測(cè)定3 次，計(jì)算平均值，按照平均斜率法得出回歸方程Y=aX+b（Y 為均值，X 為理論值）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：斜率a 為0.97～1.03 且R2≥0.95 則通過驗(yàn)證。

1.3.4 參考區(qū)間驗(yàn)證 參考CLSI C28-A3c 文件，選取健康查體人群20 名，入選標(biāo)準(zhǔn)為促甲狀腺激素、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素、游離三碘甲狀腺原氨酸、游離甲狀腺素、抗甲狀腺過氧化物酶抗體、甲狀腺球蛋白抗體均正常，以CLIA 法檢測(cè)TRAb，驗(yàn)證試劑盒給定參考區(qū)間的適用性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：若檢測(cè)結(jié)果≤2 例在參考區(qū)間之外，則該參考區(qū)間適用；若＞2 例則需要自行建立參考區(qū)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用散點(diǎn)圖及相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)二者之間的相關(guān)性，差異性比較采用McNemar 檢驗(yàn)。采用MedCalc 15.2 軟件進(jìn)行Bland-Altman 偏差分析。

2 結(jié)果

2.1 ECLIA 和CLIA 檢測(cè)TRAb 的一致性評(píng)價(jià)

2.1.1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性 采用CLIA 和ECLIA兩種檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)分別測(cè)定118 例血清樣本的TRAb濃度，ECLIA 為參比方法（X），CLIA 為待評(píng)價(jià)方法（Y），將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)分析，散點(diǎn)圖顯示兩種方法檢測(cè)的TRAb 數(shù)值間存在直線相關(guān)性（圖1），決定系數(shù)R2=0.939，相關(guān)系數(shù)r=0.969，提示兩種檢測(cè)方法之間呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。

圖1 ECLIA 法與CLIA 法檢測(cè)TRAb 的散點(diǎn)圖

2.1.2 Bland-Altman 偏差分析 ECLIA 與CLIA 檢測(cè)TRAb 結(jié)果在低值區(qū)域（0～5 IU/L）一致性良好，95%界值范圍為-2.846～3.334 IU/L。隨著TRAb 濃度升高，偏差逐漸增大，其中有5.9%（7/118）的點(diǎn)在95%界限范圍之外，差值絕對(duì)值最高可達(dá)11.24 IU/L，即使在一致性界限范圍內(nèi)，差值絕對(duì)值最高達(dá)3.5 IU/L。見圖2。

圖2 ECLIA 法和CLIA 法檢測(cè)TRAb 的Bland-Altman 偏差分析

2.1.3 診斷符合率 本實(shí)驗(yàn)室共檢測(cè)我院門診及住院送檢患者血清樣本118 例。兩種方法檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率為86.84%，陰性符合率為100%，總符合率為95.76%；一致性檢驗(yàn)Kappa 值為0.8995（P ＜0.01），陰陽性符合率良好。見表1。

表1 兩種方法檢測(cè)TRAb 陰陽性差異性分析（例）

2.2 CLIA 法性能驗(yàn)證

2.2.1 精密度 隨機(jī)選取低值和高值血清樣本采用CLIA 方法檢測(cè)其批內(nèi)和批間精密度CV。見表2。兩個(gè)水平TRAb 的批內(nèi)精密度CV 分別為2.68%和0.92%，批間精密度CV 分別為5.70%和1.48%。

表2 CLIA 法檢測(cè)TRAb 精密度結(jié)果（±s）

表2 CLIA 法檢測(cè)TRAb 精密度結(jié)果（±s）

注 CLIA：光化學(xué)發(fā)光法；TRAb：促甲狀腺激素受體抗體

2.2.2 線性范圍 選取的低濃度（L）血清樣本，濃度值為0.25 IU/L，高濃度（H）血清樣本，濃度值為40.0 IU/L。兩份血清樣本以不同比例混合后用CLIA 法檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果與理論結(jié)果進(jìn)行線性分析，擬合后線性方程為Y=1.0134X+0.0439，決定系數(shù)R2=0.9987，提示CLIA 檢測(cè)TRAb 值在0.25～40.00 IU/L 范圍內(nèi)線性良好。

2.3 CLIA 法參考區(qū)間驗(yàn)證

20 名健康體檢人群樣本，TRAb 檢測(cè)結(jié)果均在試劑盒給定的參考區(qū)間內(nèi)，參考區(qū)間通過驗(yàn)證。

3 討論

Graves 病是一種甲狀腺激素分泌增多的自身免疫性疾病[11-13]?，F(xiàn)已證實(shí)TRAb 與Graves 病的病情發(fā)生和演變密切相關(guān)[14-15]，TRAb 陽性的Graves 病患者停用抗甲狀腺藥物后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著高于TRAb 陰性患者，而且TRAb 陽性率與甲狀腺激素水平呈正相關(guān)[16]。

ECLIA 是臨床及科研上目前測(cè)定TRAb 的常用方法[17-19]，是基于“生物素-鏈霉親和素”系統(tǒng)的方法學(xué)可特異并高效地放大檢測(cè)信號(hào)，提高免疫檢測(cè)的靈敏度。但隨著越來越多人群補(bǔ)充生物素而造成外周循環(huán)中濃度的上升，一旦使用“生物素-鏈霉親和素”系統(tǒng)的免疫檢測(cè)試劑對(duì)這些人群的外周血樣本進(jìn)行檢測(cè)，樣本中高濃度的游離生物素就會(huì)干擾鏈霉親和素捕獲目標(biāo)分析物的能力，從而造成檢測(cè)結(jié)果的假性升高或者降低[20-22]。而且，ECLIA 的成本偏高，不利于在臨床上廣泛應(yīng)用[8-9]。

CLIA 是基于人工合成的有機(jī)化合物異魯米諾為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，異魯米諾在人血清中不存在，因此不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。其在測(cè)定TRAb 的準(zhǔn)確性方面，目前沒有相關(guān)的研究[23-25]。

本研究共收集血清標(biāo)本118 例，通過兩種方法檢測(cè)TRAb，相關(guān)系數(shù)r=0.969，兩種方法具有良好的一致性和相關(guān)性；而Bland-Altman 偏差分析顯示兩種方法在低值濃度部分（0～5 IU/L）一致性良好，但隨著TRAb 濃度的升高，偏差也逐漸增大；在陰陽性差異性分析中，陽性符合率為86.84%，陰性符合率為100%，總符合率為95.76%，提示兩種檢測(cè)方法總體檢驗(yàn)一致性較好。此外，本研究中對(duì)CLIA 檢測(cè)TRAb 的批間、批內(nèi)精密度、線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證，其均符合檢測(cè)要求。

因此，本研究認(rèn)為CLIA 和ECLIA 相關(guān)性良好，CLIA 可以作為臨床上檢測(cè)血清TRAb 含量的可靠方法。