劉 韻 葉 鈞

1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400038；2.陸軍第九五八醫(yī)院消化科，重慶 400020

黏蛋白O-型糖鏈根據(jù)在絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）分子上不同連接，可分為Core 1～8八種不同O-型糖鏈[1]。不同類(lèi)型的O-型糖鏈由不同的糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成，Core 3 O-型糖鏈由β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶6（β3gnT6）催化合成。腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC O157∶H7）可引起患者從輕度腹瀉到嚴(yán)重疾病的發(fā)生，如出血性腸炎[2]；O-型糖鏈可能與腸道共生菌群的選擇相關(guān)，同時(shí)可以作為不同細(xì)菌的黏附位點(diǎn)[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺（benzyl-α-GalNAc）抑制腸上皮細(xì)胞O-型糖鏈的合成，將導(dǎo)致細(xì)菌黏附于腸上皮細(xì)胞細(xì)菌數(shù)減少，同時(shí)侵襲入細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)增加。因benzyl-α-GalNA抑制的是腸上皮細(xì)胞所有O-型糖鏈的合成，不能鑒別出是哪種O-型糖鏈在細(xì)菌的黏附和侵襲過(guò)程中發(fā)揮作用，本研究通過(guò)構(gòu)建Core 3 O-型糖鏈過(guò)表達(dá)結(jié)腸上皮細(xì)胞株來(lái)探討Core 3 O-型糖鏈對(duì)細(xì)菌黏附和侵襲腸上皮細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29（T25-flask，貨號(hào)CBP60011）和LS174T（T25-flask，貨號(hào)CBP60033）購(gòu)買(mǎi)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。EPEC、EHEC O157∶H7、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）來(lái)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室。β3gnT6過(guò)表達(dá)慢病毒（1 ml，滴度為108，貨號(hào)L2016-745SH）由上海吉瑪公司合成，慶大霉素注射液購(gòu)買(mǎi)于西南藥業(yè)有限公司（2 ml∶80 000單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H50021451），TEER測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)板（12孔，貨號(hào)3422）購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Costar公司，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色液（1 ml，貨號(hào)S7109）購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司，McCoy’s 5A培養(yǎng)基（500 ml，貨號(hào)M9309）購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司，Triton X-100（100 ml，貨號(hào)T8200）購(gòu)買(mǎi)于北京索萊寶公司。

1.2 β3gnT6過(guò)表達(dá)細(xì)胞系建立和鑒定

Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T、β3gnT6/LS174T細(xì)胞株的建立和鑒定具體方法參照本課題組前期文獻(xiàn)[4]。

1.3 細(xì)菌黏附試驗(yàn)（克隆計(jì)數(shù)法）

當(dāng)Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T細(xì)胞株生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，制備成細(xì)胞懸液，并接種于24孔板。待其生長(zhǎng)融合至單層細(xì)胞時(shí)，加入PBS清洗3次，再加入無(wú)血清McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，使細(xì)胞株適應(yīng)無(wú)血清狀態(tài)，再向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入相同濃度的EPEC或EHEC O157∶H7，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中共孵育2 h。將培養(yǎng)板取出，倒掉培養(yǎng)基，用冷PBS清洗3次，抑制細(xì)菌進(jìn)一步生長(zhǎng)和去除未黏附的細(xì)菌，再通過(guò)細(xì)胞刮將黏附于細(xì)胞株表面的細(xì)菌刮下，再按照梯度稀釋的方法將其均勻涂布在MacConkey瓊脂板上，37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中過(guò)夜，最后用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)黏附于細(xì)胞表面的細(xì)菌數(shù)。

1.4 細(xì)菌黏附試驗(yàn)（直接觀察法）

細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)方法同上，去除未黏附細(xì)菌后，向培養(yǎng)孔中加入碘化丙啶（PI）室溫染色細(xì)菌30 min，再用PBS清洗3次，最后用熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)黏附于細(xì)胞表面的細(xì)菌數(shù)。

1.5 細(xì)菌侵襲試驗(yàn)

當(dāng)Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T細(xì)胞株生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，制備成細(xì)胞懸液，并接種于24孔板中。待其生長(zhǎng)融合至單層細(xì)胞時(shí)，加入PBS清洗3次，再加入無(wú)血清McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，使細(xì)胞株適應(yīng)無(wú)血清狀態(tài)，再向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入相同濃度的EIEC，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中共孵育2 h，將培養(yǎng)板取出，倒掉培養(yǎng)基，用冷PBS清洗3次，再向培養(yǎng)孔中加入100 μg/ml慶大霉素，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中共孵育2 h，以殺滅黏附于細(xì)胞表面的細(xì)菌，再用PBS清洗3次。然后向每孔中加入200 μl 0.25%的胰蛋白酶和0.025% Triton X-100，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育10 min，以破裂細(xì)胞和使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌釋放出來(lái)，再將裂解液均勻涂布在MacConkey瓊脂板上，37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中過(guò)夜，最后用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)侵襲入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)。

1.6 TEER測(cè)定

當(dāng)Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T細(xì)胞株生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，制備成細(xì)胞懸液，并將其接種于TEER測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞株生長(zhǎng)融合至單層細(xì)胞時(shí)，加入PBS清洗3次，再加入無(wú)血清McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，再向培養(yǎng)孔中加入相同濃度的EPEC或EHEC O157∶H7，在不同時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、12、24 h）測(cè)定其TEER值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，采用樣本t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)（克隆計(jì)數(shù)法）結(jié)果

黏附于β3gnT6/HT-29細(xì)胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細(xì)菌數(shù)明顯少于Ctr/HT-29細(xì)胞株（P＜ 0.01）；黏附于β3gnT6/LS174T細(xì)胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細(xì)菌數(shù)明顯少于Ctr/LS174T細(xì)胞株（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 黏附于細(xì)胞表面的EPEC和EHEC O157∶H7（＊＊P ＜ 0.01）

2.2 細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)（直接觀察法）結(jié)果

采用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，黏附于β3gnT6/HT-29細(xì)胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細(xì)菌數(shù)明顯少于Ctr/HT-29細(xì) 胞 株（P＜ 0.01）；黏附于β3gnT6/LS174T細(xì)胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細(xì)菌數(shù)少于Ctr/LS174T細(xì)胞株（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察黏附于細(xì)胞表面的EPEC和EHEC O157∶H7（＊P ＜ 0.05；＊＊P ＜ 0.01）

2.3 細(xì)菌侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

侵襲入β3gnT6/HT-29細(xì)胞株內(nèi)的EIEC細(xì)菌數(shù)多于Ctr/HT-29細(xì)胞株（P＜ 0.05）；侵襲入β3gnT6/LS174T細(xì)胞株內(nèi)的EIEC細(xì)菌數(shù)明顯多于Ctr/LS174T細(xì)胞株（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 侵襲入細(xì)胞內(nèi)的EIEC細(xì)菌數(shù)（＊P ＜ 0.05；＊＊P ＜ 0.01）

2.4 TEER實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在不同時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、12、24 h）檢測(cè)細(xì)胞株TEER值發(fā)現(xiàn)，未在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6過(guò)表達(dá)細(xì)胞株TEER值的變化與其對(duì)照細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6過(guò)表達(dá)細(xì)胞株TEER值下降較其對(duì)照細(xì)胞更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞株TEER值變化

3 討論

在發(fā)展中國(guó)家，引起嬰幼兒腹瀉的主要致病菌是EPEC和EHEC O157∶H7[5]，盡管對(duì)于EPEC或EHEC O157∶H7感染患者有一些有效的治療手段，但為進(jìn)一步優(yōu)化治療策略，需要明確EPEC或EHEC O157∶H7在腸道多重防御屏障保護(hù)下是如何致病的。在人體腸道中，EPEC或EHEC O157∶H7致病的第一步是黏附于腸道黏液屏障中的糖鏈上，進(jìn)而定植和感染腸道上皮細(xì)胞。另一重要步驟是細(xì)菌通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌相關(guān)效應(yīng)蛋白，使細(xì)菌進(jìn)一步侵襲入腸道黏液層，進(jìn)而引起腸道炎癥的發(fā)生[6]。

腸道黏液屏障作為人體阻擋外界病原體、毒素的防御屏障，在人體生命活動(dòng)中起至關(guān)重要的作用。結(jié)腸黏液屏障分為兩層，最外面的一層為疏松層，含大量細(xì)菌；最里面一層為致密層，無(wú)細(xì)菌定植[7-8]。黏液屏障主要由腸道杯狀細(xì)胞分泌的MUC2和IgGFcγBP及穿插在腸上皮細(xì)胞的膜相關(guān)黏蛋白（如MUC1、MUC3、MUC4）組成。分泌型黏蛋白和膜相關(guān)型黏蛋白有一個(gè)共同特點(diǎn)，就是在其內(nèi)部含大量的串聯(lián)重復(fù)序列（VNTRS），該重復(fù)序列中含大量的O-型糖鏈和N-型糖鏈的修飾位點(diǎn)。黏蛋白分子質(zhì)量大約80%由O-型糖鏈組成，因此黏蛋白分子的功能與O-型糖鏈密切相關(guān)[9-12]。同時(shí)有研究表明，腸道黏蛋白O-型糖鏈參與細(xì)菌與宿主相互作用過(guò)程[13-18]，在哺乳動(dòng)物中，敲除Core 1或Core 3 O-型糖鏈將導(dǎo)致自發(fā)性結(jié)腸炎的發(fā)生[19]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)benzyl-α-GalNAc抑制HT-29和HT-29-Gal細(xì)胞O-型糖鏈的合成，將導(dǎo)致EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)抑制腸上皮細(xì)胞MUC2分泌[20-21]，因O-型糖鏈根據(jù)不同的連接在Ser/Thr殘基上，黏蛋白O-型糖鏈可區(qū)分為八種核心結(jié)構(gòu)（Core1~8）[22-23]，benzyl-α-GalNAc抑制的是腸上皮細(xì)胞所有O-型糖鏈的合成，不能區(qū)分是哪一種或哪幾種O-型糖鏈參與細(xì)菌黏附和侵襲。因此本課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制腸上皮細(xì)胞Core 2 O-型糖鏈的合成，將導(dǎo)致EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細(xì)胞數(shù)量減少[24]，這提示Core 2 O-型糖鏈參與EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細(xì)胞。本研究通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞Core 3 O-型糖鏈的合成，進(jìn)而明確Core 3 O-型糖鏈?zhǔn)欠駞⑴c細(xì)菌黏附和侵襲腸上皮細(xì)胞。本研究顯示，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞Core 3 O-型糖鏈的合成將抑制EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細(xì)胞，同時(shí)增加EIEC侵襲入腸上皮細(xì)胞。這提示Core 3 O-型糖鏈可能不是EPEC和EHEC O157∶H7的黏附位點(diǎn)，Core 3 O-型糖鏈合成增加，將阻遏細(xì)菌黏附腸上皮細(xì)胞。同時(shí)Core 3 O-型糖鏈合成增強(qiáng)，導(dǎo)致EIEC侵襲入腸上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)增加，這可能是Core 3 O-型糖鏈的合成破壞了細(xì)胞屏障功能。因此，本研究測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)β3gnT6過(guò)表達(dá)細(xì)胞株與對(duì)照細(xì)胞株的TEER值，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。而在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的TEER值與其對(duì)照細(xì)胞比較明顯下降（P＜ 0.01或P＜ 0.05），提示增加Core 3 O-型糖鏈的合成將導(dǎo)致細(xì)胞屏障的通透性增加，Core 3 O-型糖鏈具有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏膜屏障的作用。同時(shí)有文獻(xiàn)研究表明，在小鼠中，敲除C1galt1（合成Core 1 O-型糖鏈酶）將改變腸道通透性，進(jìn)而增加腸道炎癥及腫瘤的發(fā)生[25]，而Core 1 O-型糖鏈與Core 3 O-型糖鏈的合成共用同一底物，抑制Core 1 O-型糖鏈的合成將增加Core 3 O-型糖鏈的合成[22-23]，該體外研究結(jié)果與其一致。細(xì)胞株TEER值的差異發(fā)生在細(xì)菌感染條件下，而不是非感染條件下，這種差異的發(fā)生有待后續(xù)進(jìn)一步探究其機(jī)制。

總之，本研究結(jié)果提示Core 3 O-型糖鏈參與EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細(xì)胞，同時(shí)Core 3 O-型糖鏈參與EIEC侵襲腸上皮細(xì)胞，或許為將來(lái)腸道感染疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。