魏志雄 劉丹丹 藍(lán)明雄 王昆鵬

東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東東莞 523808

吲哚美辛屬芳基乙酸類(lèi)非甾體抗炎藥，為強(qiáng)力鎮(zhèn)痛消炎藥，對(duì)炎癥性疼痛作用顯著，臨床主要用于對(duì)水楊酸類(lèi)療效不顯或不易耐受的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等[1-3]。其長(zhǎng)期或大量使用可引起皮膚過(guò)敏、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及造血系統(tǒng)反應(yīng)等多種不良反應(yīng)[4-6]。風(fēng)濕病為常見(jiàn)多發(fā)病，易復(fù)發(fā)難根治，我國(guó)風(fēng)濕病患者數(shù)量巨大，抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品需求巨大，但目前市場(chǎng)存在著產(chǎn)品添加化學(xué)藥物等亂象[7-13]，給人民群眾的身體健康造成極大威脅。本研究采用顯色反應(yīng)法，旨在建立一種前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、專(zhuān)屬的抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品中吲哚美辛的快速篩查方法，為監(jiān)管部門(mén)打擊假藥劣藥提供技術(shù)支撐，降低監(jiān)管成本，提升監(jiān)管效率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB 3200 Q-trap 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Sartorius CPA225D 電子天平（瑞士賽多利斯公司）；BRANSON 5510 R-MTH 超聲波處理器（美國(guó)必能信公司）。

1.2 試藥

吲哚美辛對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院；批號(hào)：100258-200904；含量：99.9%）；樣品：112 批樣品為監(jiān)督抽檢樣品或由本所從市場(chǎng)采購(gòu)（四種劑型，其中片劑27 批，顆粒劑5 批，膠囊劑61 批，丸劑19批）。乙腈（德國(guó)默克化工）、乙酸銨（上海麥克林生化科技）為色譜純，甲醇（德國(guó)默克化工）、硫酸（廣州化學(xué)試劑廠）、氫氧化鈉（廣州化學(xué)試劑廠）、三氯化鐵（阿拉丁試劑有限公司）及30%過(guò)氧化氫溶液（廣州市溢聯(lián)化工有限公司）均為分析純，水為超純水。

2 方法及結(jié)果

2.1 顯色反應(yīng)法

2.1.1 取樣 結(jié)合收集樣品及市場(chǎng)流通樣品的實(shí)際情況，方法建立的取樣量及樣品前處理見(jiàn)表1。其中，27批片劑中有4 批為紅色包衣，3 批為深褐色包衣，取樣時(shí)先用水洗去表層包衣顏色，減少干擾。

表1 不同劑型樣品取樣量及前處理

2.1.2 顯色反應(yīng)法實(shí)驗(yàn)溶液的制備

2.1.2.1 供試品溶液1 的制備 按“2.1.1 項(xiàng)”表1 所述取樣品適量，放入內(nèi)裝0.4%氫氧化鈉溶液4 ml 的玻璃瓶（A 瓶）中，閉塞，強(qiáng)力振搖約30 s，靜置約30 s。用一次性吸管吸取A 瓶?jī)?nèi)上清液約1 ml，置內(nèi)裝3 mol/L硫酸溶液2 ml 的玻璃瓶（B 瓶）中，搖勻，靜置約10～30 s。取一次性針頭注射器吸取B 瓶溶液，經(jīng)微孔濾膜（水系，25 mm，0.45 μm）濾過(guò)，濾液置離心管，收集濾液至約1 ml。

2.1.2.2 典型陰性對(duì)照溶液的制備 取壯骨強(qiáng)筋片（東莞市中醫(yī)院；批號(hào)：20140927）按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制成典型陰性對(duì)照溶液。

2.1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取吲哚美辛對(duì)照品適量用0.4%氫氧化鈉溶液制成對(duì)照品溶液（0.5 mg）。取典型陰性對(duì)照溶液加入等體積對(duì)照品溶液制得陽(yáng)性對(duì)照溶液（0.25 mg）。

2.1.2.4 空白試劑的制備 不取樣品，按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制成空白試劑溶液。

2.1.2.5 干擾溶液的制備 取抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛類(lèi)常用藥物雙氯芬酸鈉、布洛芬、保泰松、吡羅昔康、氨基比林、醋酸潑尼松、氫化可的松、地塞米松、阿司匹林、萘普生、甲氧芐啶及對(duì)乙酰氨基酚適量，分別用0.4%氫氧化鈉溶液溶解成1 mg/ml 的溶液，作為干擾溶液。

2.1.3 顯色反應(yīng)法 向離心管中依次加入5%三氯化鐵溶液及3%過(guò)氧化氫溶液各1 滴，靜置10～30 s。觀察接觸面環(huán)的顏色變化（此時(shí)較為靈敏，觀察結(jié)果有助于后續(xù)對(duì)濃度較低添加樣品的判斷），搖勻，再觀察離心管溶液的顏色變化。

2.1.4 結(jié)果判斷 若離心管溶液顏色變?yōu)榈t至紫紅色，表明樣品中含有吲哚美辛；若離心管溶液顏色無(wú)變化，表明樣品中不含有吲哚美辛。如樣品過(guò)濾后離心管溶液顏色本身偏紅色時(shí)，需做樣品隨行對(duì)照，觀察滴加反應(yīng)試劑后顏色是否加深，如顏色不變或變淡，則判斷為陰性；如紅色加深，須進(jìn)一步使用微孔濾膜（水系，25 mm，0.45 μm）濾過(guò)，如濾膜顯示為淡紅至紫紅色，則判斷為陽(yáng)性。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性 取陽(yáng)性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、典型陰性對(duì)照溶液及空白試劑依法顯色，結(jié)果見(jiàn)圖1 （封四）。離心管中陽(yáng)性對(duì)照溶液及對(duì)照品溶液的顏色為淡紅色，典型陰性對(duì)照溶液及空白試劑管中為淺黃色。同法制備其余樣品的陰性對(duì)照溶液，依法顯色，結(jié)果陰性對(duì)照溶液管為淺黃至棕褐色，均不顯紅色。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)顯色結(jié)果

取12 種干擾溶液依法顯色，結(jié)果各溶液顏色均未變紅，用微孔濾膜（水系，25 mm，0.45 μm）過(guò)濾，濾膜不顯紅色。試驗(yàn)結(jié)果表明陰性樣品及同類(lèi)抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛添加成分均無(wú)干擾，方法的專(zhuān)屬性強(qiáng)。

2.2.2 檢出限 采用陰性樣品壯骨強(qiáng)筋片添加吲哚美辛對(duì)照品考察檢出限，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加量在0.25 mg時(shí)，溶液能形成可供穩(wěn)定辨別的淡粉紅色。吲哚美辛成人一次口服起效劑量為25 mg，本法檢出限為0.25 mg，僅為起效劑量的百分之一，故方法的靈敏度高。

2.3 樣品快篩結(jié)果

對(duì)收集的112 批樣品按2.1.2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)行快速篩查，結(jié)果有16 批樣品檢出吲哚美辛，詳見(jiàn)表2。

表2 樣品快速篩查陽(yáng)性結(jié)果

2.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法確證

2.4.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18MG Ⅲ（2.0 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以0.02 mol/L 乙酸銨為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表3 梯度洗脫，流速：0.2 ml/min，柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：10 μl。

表3 色譜梯度洗脫程序

2.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式：負(fù)離子（ESI-）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；氣簾氣（curtain gas，CUR）：25 psi；霧化氣（ion source gas 1，GS1）：40 psi；輔助氣（ion source gas 2，GS2）：40 psi；電離電壓（ionspray voltage，IS）：-4500 V；輔助加熱器溫度：500℃；碰撞氣體（collision gas，CAD）：Medium；出口電壓（cell exit potential，CXP）：-2.0 V。

表4 吲哚美辛對(duì)照品的質(zhì)譜條件

2.4.3 實(shí)驗(yàn)溶液制備

2.4.3.1 供試品溶液2 的制備 取表2 中產(chǎn)品的一次口服用量樣品（包衣片除去包衣，研細(xì)；膠囊取內(nèi)容物研細(xì)；丸劑剪碎，必要時(shí)用適量硅藻土分散；顆粒劑研細(xì)）置50 ml 容量瓶中，加甲醇25 ml，超聲處理10 min，放冷至室溫后再加水至刻度，搖勻，靜置過(guò)夜。精密吸取靜置后的上層溶液1 ml 置10 ml 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜（有機(jī)系，13 mm，0.22 μm）濾過(guò)，制得供試品溶液2。

2.4.3.2 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取吲哚美辛對(duì)照品適量，用甲醇溶解并逐級(jí)稀釋制成濃度約為500 ng/ml的吲哚美辛對(duì)照品溶液。

2.4.3.3 典型陰性對(duì)照溶液的制備 取壯骨強(qiáng)筋片按“2.4.3.1”項(xiàng)下方法制得典型陰性對(duì)照溶液。

2.4.3.4 空白溶液的制備 不取樣品，按“2.4.3.1”項(xiàng)下方法制得空白溶液。

2.4.4 專(zhuān)屬性與檢出限 分別精密吸供試品溶液、吲哚美辛對(duì)照品溶液、 典型陰性對(duì)照溶液及空白溶液各10 μl 進(jìn)樣，記錄提取離子流圖。結(jié)果均未出現(xiàn)干擾，表明方法專(zhuān)屬性良好，典型圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法確證典型圖譜

取1.0、2.0 及5.0 ng/ml 的吲哚美辛對(duì)照品溶液，分別取樣注入液質(zhì)聯(lián)用儀分析，記錄提取離子流圖并計(jì)算信噪比S/N 值，至S/N≈3 為檢出限，結(jié)果方法檢出限為0.01 ng。

2.4.5 確證結(jié)果 通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)快速篩查結(jié)果進(jìn)行確證，結(jié)果見(jiàn)表5。方法的誤檢率及漏檢率均為0，正確率為100%（n=112）[誤檢率=假陰性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100%；漏檢率=假陽(yáng)性/（假陽(yáng)性+真陰性）×100%；正確率=（真陽(yáng)性+真陰性）/（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性+假陰性+真陰性）×100%]。

表5 快速篩查及確證結(jié)果匯總表（n）

3 討論

中成藥及保健品成分復(fù)雜，常規(guī)的理化鑒別反應(yīng)靈敏度及專(zhuān)屬性較差[14]。目前市面上已有的基本藥物（吲哚美辛）快速篩查試劑盒整個(gè)操作過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，且需使用恒溫金屬浴/水浴儀器加熱，具有一定局限性；已有吲哚美辛ELISA 檢測(cè)技術(shù)相關(guān)報(bào)道[15-17]，但尚不成熟。本方法利用吲哚美辛可被強(qiáng)酸堿液水解，生成對(duì)氯苯甲酸和5-甲氧-2-甲基吲哚-3-乙酸，并可進(jìn)一步被氧化成有色物質(zhì)的原理，合理設(shè)置試驗(yàn)步驟、提取及反應(yīng)試劑，降低了其他成分的干擾，簡(jiǎn)化操作，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高了結(jié)果專(zhuān)屬性與準(zhǔn)確性。

對(duì)顯色反應(yīng)法前處理的各個(gè)步驟進(jìn)行考察，最終選擇質(zhì)量百分比濃度為0.4%氫氧化鈉溶液，此條件下提取效率最高；將0.4%氫氧化鈉溶液和3 mol/L 硫酸溶液的用量比例設(shè)為2∶1，使既能達(dá)到稀釋干擾物的目的，又可生成明顯的紫紅色物質(zhì)，有利于結(jié)果判斷；此外采用先加入硫酸溶液，過(guò)濾后再加入5%三氯化鐵溶液，可消除硫酸酸化后生成的沉淀干擾；使用5%三氯化鐵溶液及3%過(guò)氧化氫溶液作為顯色試劑，可進(jìn)一步加快反應(yīng)速率，常溫下一般在30 s 內(nèi)可進(jìn)行結(jié)果觀察。通過(guò)對(duì)干擾樣品的研究，加入簡(jiǎn)單的水洗前處理或隨行對(duì)照，對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化補(bǔ)充，取得良好效果。

對(duì)低含量樣品（以陰性樣品加標(biāo)的方式）進(jìn)行了研究，取其“2.1.3 項(xiàng)”下離心管溶液用微孔濾膜（水系，25 mm，0.45 μm）濾過(guò)，觀察濾膜的顏色變化，使檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步提高。濾膜如顯淡粉紅色至紫紅色，可判斷含吲哚美辛；濾膜如顯其他顏色（一般為棕色或黃色），則判斷不含吲哚美辛。按以上步驟判斷，方法檢出限可降低至0.1 mg/次?？紤]到吲哚美辛常用口服劑量為25 mg/次，按“2.1 項(xiàng)”下方法定性鑒別反應(yīng)所需吲哚美辛量?jī)H為0.25 mg/次，已可滿足吲哚美辛的鑒別靈敏度要求，考慮操作的簡(jiǎn)便性，故未將此濾膜判斷方法列入。

本法無(wú)需使用有機(jī)溶劑，無(wú)需額外設(shè)備，無(wú)毒環(huán)保，可制成商品化的試劑盒，不僅可用于監(jiān)管部門(mén)的現(xiàn)場(chǎng)篩查，而且可廣泛應(yīng)用于其他場(chǎng)所，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。