夏廣韜 俞 潔 劉宇飛 鄭立紅 裴耘婕 張 龍 隋 茹 張明龍▲

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

乳腺癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，多項(xiàng)研究表明乳腺癌的發(fā)生機(jī)制與遺傳易感基因的突變密切相關(guān)[1-2]，而單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）則是在進(jìn)化中基因突變所導(dǎo)致遺傳差異的主要形式，也是疾病易感性、藥物敏感性等生物性狀差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為一種主要的血管生成因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化，增加血管對(duì)大分子物質(zhì)的通透性[4]。已有研究表明，VEGF 多態(tài)性可能影響VEGF 水平和活性，從而影響患乳腺癌在內(nèi)的各種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[5-8]?；诖?，本研究選取VEGF 基因的rs699947 位點(diǎn)，分析其與漢族女性乳腺癌發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性，以期為乳腺癌的防治、診斷和個(gè)體化治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月至2018年8月黑龍江省大慶油田總醫(yī)院、齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院、齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院以及齊齊哈爾建華醫(yī)院收治的258 例乳腺癌患者作為乳腺癌組，選取同期162 例健康女性作為對(duì)照組。乳腺癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：①女性患者，均為漢族，診斷年齡為18～70 歲；②經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為乳腺癌，雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）情況明確；③無合并其他部位原發(fā)性腫瘤。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①健康個(gè)體，無腫瘤及癌前病變患者；②非病毒性肝炎、艾滋病患者。所有樣本的采集和臨床資料的獲取均符合各醫(yī)院和醫(yī)學(xué)院的醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的要求，所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書。對(duì)乳腺癌組和對(duì)照組的基本特征信息進(jìn)行采集，包括年齡、絕經(jīng)史和腫瘤家族史，同時(shí)對(duì)乳腺癌的臨床生物學(xué)特性資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括乳腺癌患者的腫瘤大小（T1～T4）、腫瘤分期（G1～G3）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移史（表1）。

表1 樣本基本特征信息[n（%）]

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取和PCR 抽取對(duì)照組和乳腺癌組外周血2 ml，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，-80℃條件下儲(chǔ)存。采用小量全血基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，采用Nano500 微量核酸分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）對(duì)DNA 的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，以保證后續(xù)PCR 反應(yīng)檢測(cè)的質(zhì)量需要。PCR：采用Sta 等[9]報(bào)道的方法對(duì)VEGF 基因rs699947 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，引物序列（北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司）：通用正向引物：5'-CTAGTGCACGAATGATGGAAAGG-3'，野生型基因（C）引 物F：5'-TCAGTCTGATTATCCACCCAGATCT-3'，突變型基因（A）引物5'-TCAGTCTGATTATCCAC CCAGATCG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小295 bp。PCR 反應(yīng)體系（20 μl）：50 ng DNA 模板（2 μl），正、反向引物各1 μl，Buffer 2 μl，MgCl 2 μl，Taq 酶1 U（0.2 μl），dNTP mixture 2 μl，加純化水至20 μl；PCR 熱循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)內(nèi)95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共循環(huán)35 次，72℃進(jìn)一步延伸5 min，野生型和突變型基因的擴(kuò)增條件均一致。

1.2.2 基因分型 同一DNA 樣本需分別進(jìn)行兩次PCR，以分別擴(kuò)增可能檢出的野生型和（或）突變型基因，采用1.5%瓊脂糖凝膠（上海默璽生物科技有限公司）電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以在295 bp 處是否出現(xiàn)條帶作為判定標(biāo)準(zhǔn)，若兩次PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物均為295 bp，則該樣本基因型為AC，若單一PCR 反應(yīng)產(chǎn)物為295 bp，則該樣本基因型為AA 或CC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩組的Hardy-Weinberg 定律檢驗(yàn)采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)； 采用logistic 回歸分析各基因型和不同遺傳模型與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間的均衡性檢驗(yàn)和Hardy-Weinberg 定律檢驗(yàn)

對(duì)乳腺癌組和對(duì)照組的基本特征信息進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：乳腺癌組的絕經(jīng)比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺癌組有腫瘤家族史比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組的初潮年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。兩組的Hardy-Weinberg 定律檢驗(yàn)結(jié)果顯示： 兩組基因型分布的觀察值與期望值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2乳腺癌組=2.674，χ2對(duì)照組=3.629，P＞0.05），表明本研究選取的研究對(duì)象符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，符合群體遺傳學(xué)研究的要求。

2.2 兩組VEGF 基因rs699947 多態(tài)性與乳腺癌易感性分析

兩組的rs699947 位點(diǎn)的等位基因頻率、 基因型頻率分布和不同遺傳模型的比較分析以及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)見表2，結(jié)果顯示：兩組的等位基因和基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)年齡、絕經(jīng)與否和腫瘤家族史等因素予以校正后，攜帶基因型AC 和AA 的個(gè)體發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)分別為0.341（P＜0.05）和0.170（P＜0.05）。校正相關(guān)混雜因素后，兩組的顯性模型（AA+AC/CC）和隱性模型（CC/AC+AA）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），顯性模型和隱性模型下對(duì)乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)值分別為0.276 和2.657（P＜0.05）。

表2 VEGF 基因rs699947 位點(diǎn)等位基因和基因型分布及不同遺傳模式下對(duì)乳腺癌易感性的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)

2.3 乳腺癌組VEGF 基因rs699947 多態(tài)性與臨床生物學(xué)特性的關(guān)系

rs699947 位點(diǎn)的基因型分布與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率、腫瘤大小、雌、孕激素受體陽性率和組織病理分型無明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表3）。

表3 乳腺癌組患者VEGF 基因rs699947 多態(tài)性與乳腺癌生物學(xué)特性的關(guān)系

3 討論

VEGF 基因可通過多種機(jī)制促進(jìn)血管的生成，已被證明在腫瘤發(fā)生、 發(fā)展和預(yù)后中起著關(guān)鍵作用[10]，有研究報(bào)道VEGF 在乳腺癌中過度表達(dá)[11-12]與微血管密度增加和乳腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)[13]，并且VEGF 基因單核苷酸多態(tài)性可以通過影響蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的易感性和嚴(yán)重程度[14]。Rahoui 等[15]對(duì)摩洛哥女性的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)A 等位基因攜帶者降低了患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，而Jacobs 等[16]已經(jīng)證明C 等位基因與美國(guó)人群中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，但與原位癌或整體乳腺癌無關(guān)；與之矛盾的是，Kapahi 等[17-19]的研究顯示，AA 基因型與北印度人群、 伊朗人群和沙特阿拉伯人群乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)，Sa 等[20-21]對(duì)巴基斯坦人群和西班牙人群的研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)聯(lián)不大?；谝陨涎芯拷Y(jié)果分析，VEGF 基因rs699947 位點(diǎn)多態(tài)性在世界范圍內(nèi)的不同人種和群體中存在著差異?；诖?，本研究探討VEGF 基因rs699947 位點(diǎn)多態(tài)性與漢族女性群體乳腺癌易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示VEGF 基因rs699947位點(diǎn)的多態(tài)性分布與乳腺癌易感性明顯相關(guān)，且攜帶AA 和AC 基因型的個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)分別降低0.170 倍和0.341 倍。本研究采用不同遺傳模型進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)rs699947 的多態(tài)性與乳腺癌易感性相關(guān)聯(lián)，顯性模型的結(jié)果表明攜帶AA 和AC 基因型是攜帶CC 基因型個(gè)體發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的0.276 倍； 而與此相對(duì)應(yīng)的隱性模型的結(jié)果表明攜帶CC 基因型是攜帶AC/AA 基因型個(gè)體發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的2.657 倍。因此，可以認(rèn)為攜帶AC 和AA 基因型能夠降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，是乳腺癌易感性的保護(hù)性因素之一。

為進(jìn)一步研究rs699947 位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)展和預(yù)后間的關(guān)聯(lián)，本研究將rs699947 位點(diǎn)的基因型分布與乳腺癌的臨床生物學(xué)特性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示基因型分布與腫瘤分期和大小、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及雌、孕激素受體陽性率等乳腺癌生物學(xué)特征均不具有相關(guān)性，說明rs699947 位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)展和預(yù)后無明顯關(guān)聯(lián)。

本研究尚存在一些不足：首先，本研究的人群均為漢族，由于不同研究人群可能有不同的遺傳背景及生活方式，因此rs699947 位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)乳腺癌易感性的影響可能在世界范圍內(nèi)存在較大差異； 其次，納入分層分析的患者數(shù)量不足，有待于更大樣本納入，結(jié)果可能會(huì)更顯著；最后，本研究只納入了rs699947一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，沒有考慮位于其他基因與其連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)，不排除與之連鎖的多態(tài)位點(diǎn)共同作用影響乳腺癌的發(fā)病。

綜上所述，VEGF 基因rs699947 多態(tài)性與乳腺癌的易感性具有顯著關(guān)聯(lián)，基因型AC 和AA 是乳腺癌發(fā)病的保護(hù)因素。這些發(fā)現(xiàn)為根據(jù)SNP rs699947 基因型評(píng)估乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供前期研究數(shù)據(jù)，有望為個(gè)體化醫(yī)療打下基礎(chǔ)。