薛迪 劉學偉 汪娜 劉宇超 徐濤 裴芳藝

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0597-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.15

摘 要 目的 研究芥子酸對β-淀粉樣蛋白42（Aβ42）誘導PC12細胞損傷的改善作用及機制。方法 將PC12細胞分為對照組、模型組、芥子酸組、激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制劑組、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（ERK）抑制劑組，各抑制劑組先分別加入LY294002和U0126（均為10 μmol/L）培養(yǎng)1 h;然后除對照組外，其余4組分別加入2 μmol/L Aβ42處理24 h以復制阿爾茨海默病細胞模型;除對照組及模型組外，其余3組再分別加入100 μmol/L 芥子酸，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。檢測細胞存活率并觀察其形態(tài)，檢測細胞中Aβ42含量、cAMP反應元件結合蛋白（CREB）mRNA表達水平以及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）、CREB、磷酸化CREB（p-CREB）蛋白表達水平。結果 經芥子酸作用后，PC12細胞存活率、細胞中CREB mRNA表達水平以及cAMP、PKA、p-CREB 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），細胞中Aβ42含量顯著降低（P<0.05），細胞形態(tài)明顯改善、突觸增多;而經 PI3K、ERK抑制劑干預后，PC12細胞存活率及上述mRNA和蛋白表達水平均被顯著逆轉（P<0.05或P<0.01），細胞形態(tài)不規(guī)則、碎片增多，且突觸連接減少。結論 芥子酸可升高Aβ42誘導損傷的PC12細胞存活率，改善細胞形態(tài)，降低細胞中Aβ42含量，其作用機制可能與促進細胞中CREB mRNA轉錄、激活cAMP/PKA/CREB信號通路有關。

關鍵詞 芥子酸;cAMP/PKA/CREB信號通路;阿爾茨海默病;β-淀粉樣蛋白

Improvement effects of sinapic acid on Aβ42-induced injury of PC12 cells and the mechanism

XUE Di1，LIU Xuewei2，WANG Na3，LIU Yuchao4，XU Tao1，PEI Fangyi4（1. School of Pharmacy， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 2. School of Mental Health，Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 3. School of Basic Medicine， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 4. Office of Academic Research， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the improvement effects of sinapic acid on Aβ42-induced injury of PC12 cells and the mechanism. METHODS PC12 cells were divided into five groups： control group， model group， sinapic acid group， phosphoinositide- 3-kinase （PI3K） inhibitor group and extracellular signal-regulated kinase （ERK） inhibitor group. Each inhibitor group was added with LY294002 and U0126 （10 μmol/L） for 1 h; except for control group， other four groups were treated with 2 μmol/L Aβ42 for 24 h to replicate the Alzheimer’s disease cell model; except for control group and model group， other three groups were added with 100 μmol/L sinapic acid respectively. After 24 hours of continuous culture， survival rate of PC12 cells was detected and the morphology of PC12 cells was observed. The content of Aβ42， mRNA expression of cAMP response element binding protein （CREB）， protein expression of cyclic adenosine monophosphate （cAMP）， protein kinase A（PKA）， CREB signaling pathway and phosphorylated CREB （p-CREB） were detected. RESULTS After treated with sinapic acid， the survival rate of PC12 cells， mRNA expression of CREB and protein expressions of cAMP， PKA and p-CREB were increased significantly （P<0.05）， while the content of Aβ42 was decreased significantly （P<0.05）; cell morphology was significantly improved and synapses increased. After intervened with PI3K and ERK inhibitors， the survival rate of PC12 cells， above mRNA and protein expressions were reversed significantly （P<0.05 or P<0.01）; cell morphology was irregular， the fragments increased， and the synaptic connections decreased. CONCLUSIONS Sinapic acid can improve the survival rate of PC12 cells injured by Aβ42， improve cell morphology and decrease the content of Aβ42， the mechanism of which may be associated with? promoting the gene transcription of CREB， and activating cAMP/PKA/CREB signaling pathway.

KEYWORDS? ?sinapic acid;cAMP/PKA/CREB signaling pathway; Alzheimer’s disease; β-amyloid protein

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是與年齡高度相關的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，該疾病的癥狀始于輕度的記憶困難，并逐漸發(fā)展為認知障礙和日?；顒庸δ苷系K，現已成為嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一[1]。AD的神經病理學特征包括一些異常蛋白的積累，如淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein）的分裂導致β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成老年斑，使得突觸丟失，造成神經退行性病變[2-3]，其中Aβ40在AD的發(fā)病機制具有保護作用，而Aβ42具有致病作用[4]。因此，抑制Aβ42的神經毒性已成為現代AD領域研究熱點，找到能夠抑制Aβ42神經毒性的藥物對有效預防和治療AD具有重要意義。

芥子酸及其衍生物canolol、芥子堿、丁香醛等對AD、帕金森病、共濟失調、重癥肌無力等均有一定的治療功效[5]。本課題組前期研究發(fā)現，大鼠灌胃中藥遠志后，在其腦脊液成分中檢測出芥子酸;灌胃開心散后，在其血液中檢測出遠志糖酯類化合物 tenuifoliside A，該化合物與芥子酸存在相似的基本母核，并可以提高大鼠海馬神經元的存活率。相關研究發(fā)現，芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，其作用機制可能與激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成激酶3β（phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase 3β，PI3K/Akt/GSK3β）和腦源性神經營養(yǎng)因子/酪氨酸激酶B/細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（brain-? ? ? derived neurotrophic factor/tyrosine kinase B/extracellular signal-regulated kinase，BDNF/TrkB/ERK）等信號通路有關[6-9]。這提示芥子酸在治療神經退行性疾病方面具有一定作用。另有相關研究發(fā)現，PI3K/Akt/GSK3β和BDNF/TrkB/ERK信號通路下游的環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A/cAMP 反應元件結合蛋白（cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A/cAMP response element binding protein，cAMP/PKA/CREB）信號通路也是大腦內重要的信號通路之一，對神經元的存活與分化、突觸的形成等均具有重要作用[10]。

在本課題組前期研究的基礎上，本研究以具有神經細胞特性的PC12細胞作為研究對象，用Aβ42 誘導該細胞損傷以制備AD的體外模型，然后研究芥子酸對Aβ42誘導PC12細胞損傷的改善作用，并基于cAMP/PKA/CREB信號通路探討其作用機制，以期為芥子酸防治AD提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Series 8000型CO2培養(yǎng)箱、QuantStudio 5型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），DL-CJ-2NDII型超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司），CKX41-A32PH型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），M200 PRO型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），5804R型離心機（德國Eppendorf公司），S11-6-S型恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），LDZH-200KBS型高壓蒸汽滅菌器（上海申安自動化系統(tǒng)工程公司），C1000 Touch 型基因擴增儀、165-8001型電泳儀、1703811型電轉儀、Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有芥子酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥97%，批號S30697）;Aβ42（北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-0107p）;胎牛血清（美國BI公司，批號04-007-1A）;RPMI 1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號SH30809.01）;胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為TB150、P1400）;LY294002對照品（純度100%）、U0126對照品（純度100%）、CCK-8試劑盒（美國AbMole公司，批號分別為15447-36-6、109511-58-2、M4839）;大鼠Aβ42酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，批號 E02A0050）;焦碳酸二乙酯（DEPC）、ECL化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為ST036、P0018AS）;兔源PKA多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號24503-1-AP）;兔源cAMP 多克隆抗體（美國Abcam公司，批號ab76238）;兔源CREB多克隆抗體、兔源磷酸化CREB（p-CREB）多克隆抗體（美國CST公司，批號分別為9197、9198）;鼠源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為151218、122826、122011）。PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司設計、合成（具體引物序列及擴增產物長度見表1）。其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 細胞

大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤PC12細胞（高分化）由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

2 方法

2.1 PC12細胞的培養(yǎng)

將PC12細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）中，于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液1次，待細胞呈單層貼壁狀并進入對數生長期時，用于后續(xù)實驗。

2.2 Aβ42溶液的制備

將1 mg Aβ42溶解于221.5 μL去離子水中，制成濃度為1 000 μmol/L的溶液，然后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以制備Aβ42寡聚體[9]，于-20 ℃保存，備用。

2.3 分組

根據本課題組前期MTT實驗發(fā)現，Aβ42誘導PC12細胞損傷的最適濃度為2 μmol/L，芥子酸的最適給藥濃度為100 μmol/L[8-9]。根據文獻[11-12]報道，處理PC12細胞時，PI3K抑制劑LY294002和ERK抑制劑U0126的最適給藥濃度為均為10 μmol/L。本研究分組如下：對照組、模型組（Aβ42 2 μmol/L）、芥子酸組（Aβ42 2 μmol/L+芥子酸100 μmol/L）、PI3K抑制劑組（Aβ42 2 μmol/L+芥子酸100 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、ERK抑制劑組? （Aβ42 2 μmol/L+芥子酸100 μmol/L+U0126 10 μmol/L）。

2.4 PC12細胞存活率檢測及形態(tài)觀察

采用CCK-8法進行檢測。取對數生長期PC12細胞，調整細胞密度為 1×105 mL-1，接種于 6 孔板中，每孔1.5 mL，按“2.3”項下方法分組，另設僅加入細胞培養(yǎng)基的空白組，每組設置8個復孔。培養(yǎng)24 h后，PI3K抑制劑組、ERK抑制劑組先加入LY294002、U0126培養(yǎng)1 h;然后除對照組外，其余4組分別加入2 μmol/L Aβ42繼續(xù)培養(yǎng)24 h以造模;除對照組及模型組外，其余3組再分別加入100 μmol/L 芥子酸繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照;隨后加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標儀于 450 nm波長下檢測各孔吸光度（OD）值，并計算細胞存活率[細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%]。

2.5 PC12細胞中Aβ42含量檢測

采用ELISA法進行檢測。取對數生長期PC12細胞，按“2.4”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。于細胞培養(yǎng)結束后，棄原培養(yǎng)基，以PBS清洗細胞1遍，用胰酶消化后，加入培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，收集細胞;以PBS清洗3遍后，重懸細胞，采用超聲法裂解細胞，以5 000 r/min離心15 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法操作，測定PC12細胞中Aβ42的含量。

2.6 PC12細胞中CREB mRNA表達水平檢測

采用PCR 法進行檢測。取對數生長期PC12細胞，按“2.4”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。于細胞培養(yǎng)結束后，按 RNAiso Plus試劑盒說明書方法操作提取各組細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA模板，再進行PCR反應。PCR反應體系包括cDNA 10 μL、PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、RNase Free dH2O 4 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 °C退火延伸34 s，共40個循環(huán)。反應結束后，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達水平（以對照組為“1”計算其余組相對值）。實驗重復3次。

2.7 PC12細胞中cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白表達水平檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數生長期PC12細胞，按“2.4”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。于細胞培養(yǎng)結束后，收集細胞，提取細胞總蛋白;采用BCA法測定總蛋白含量，并制備蛋白樣品。將蛋白樣品加至聚丙烯酰胺凝膠中，以恒壓（電壓110 V）電泳進行分離，再以恒壓（電壓75 V，2 h）進行轉膜，以5%BSA 封閉液封閉 1 h，加入cAMP、PKA、CREB、p-CREB一抗（稀釋度均為1 ∶ 800）及β-actin一抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），于4 ℃過夜;以TBST溶液清洗3次，每次 5 min，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），于 37 ℃條件下反應 1 h;以TBST 溶液清洗 3 次，每次 5 min，以 ECL 顯色后，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。采用Image Lab 4.0.1 圖像分析軟件進行分析，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白表達水平（以對照組為“1”計算其余組相對值）。實驗重復3次。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，數據以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 芥子酸對PC12細胞存活率及形態(tài)的影響

與對照組比較，模型組PC12細胞存活率顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，芥子酸組PC12細胞存活率顯著升高（P<0.05）;與芥子酸組比較，PI3K抑制劑組和ERK抑制劑組PC12細胞存活率均顯著降低（P<0.05）。結果見表2。

經顯微鏡觀察后發(fā)現，對照組細胞貼壁良好，飽滿且邊緣清晰，可見長短不一的突觸，細胞間連接緊密。模型組細胞數量較對照組明顯減少，且細胞形態(tài)趨于圓形，突觸變短、變少，并伴有大量碎片。芥子酸組細胞形態(tài)明顯改善，突觸增多，且與對照組形態(tài)相似。而與芥子酸組比較，PI3K抑制劑組和ERK抑制劑組細胞形態(tài)不規(guī)則，碎片增多，且突觸連接減少。結果見圖1。

3.2 芥子酸對PC12細胞中Aβ42含量的影響

與對照組比較，模型組PC12細胞中Aβ42含量顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，芥子酸組PC12細胞中Aβ42含量顯著降低（P<0.05）;與芥子酸組比較，PI3K抑制劑組和ERK抑制劑組PC12細胞中Aβ42含量均顯著升高（P<0.05）。結果見表3。

3.3 芥子酸對PC12細胞中CREB mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組PC12細胞中CREB mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，芥子酸組PC12細胞中CREB mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）;與芥子酸組比較，PI3K抑制劑組和ERK抑制劑組PC12細胞中CREB mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）。結果見表4。

3.4 芥子酸對PC12細胞中cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白表達的影響

各組PC12細胞中CREB蛋白表達水平均無顯著差異（P>0.05）。與對照組比較，模型組PC12細胞中cAMP、PKA、p-CREB 蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，芥子酸組PC12細胞中cAMP、PKA、p-CREB 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;與芥子酸組比較，PI3K抑制劑組和ERK抑制劑組PC12細胞中cAMP、PKA、p-CREB蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結果見表5、圖2。

4 討論

近年研究發(fā)現，芥子酸可改善Aβ42或氰化鉀誘導的小鼠認知障礙，抑制CO2或東莨膽堿引起的大鼠認知障礙，減輕Aβ42或紅藻氨酸造成的海馬神經元損傷[13-15]。細胞內Aβ含量隨著AD患者年齡的增長而增加，其在體內累積可以導致AD患者神經元突觸損傷[16]。因此，加速Aβ降解、減少Aβ沉積，已成為防治AD的主要方法之一。

本研究結果顯示，芥子酸可顯著提高Aβ42誘導的PC12細胞存活率，改善細胞形態(tài);經 PI3K抑制劑LY294002和ERK抑制劑U0126干預后，PC12細胞存活率下降，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞碎片增多，且突觸連接減少。采用ELISA法檢測PC12細胞中Aβ42含量發(fā)現，芥子酸可顯著降低PC12細胞中Aβ42含量;而經PI3K抑制劑LY294002和ERK抑制劑U0126干預后，PC12細胞中Aβ42含量升高。這表明芥子酸能夠降低PC12細胞中Aβ42的含量，但當PI3K和ERK信號通路被阻斷后，芥子酸這一降低作用受到抑制。

研究指出，BDNF與TrkB結合后可介導絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）/ERK、PI3K/Akt、磷脂酶C等信號通路，這些信號通路與神經分化及神經營養(yǎng)密切相關，可直接調控細胞的增殖與分化，同時還能促進CREB蛋白的磷酸化，在神經系統(tǒng)相關疾病中具有重要作用[10，17]。 cAMP/PKA/CREB 信號通路是腦內重要信號通路之一，對長時程記憶的形成起到關鍵作用：cAMP是一種核苷酸衍生物，為細胞的第二信使，具有促進突觸傳遞、記憶形成及神經元存活的作用;PKA可參與神經遞質的合成與釋放，誘導CREB基因轉錄和蛋白合成，促進神經元存活、分化及生長發(fā)育[18];CREB是PI3K/Akt和MAPK/ERK通路的下游信號分子，當其磷酸化后，可誘導BDNF的產生，激活PI3K/Akt信號通路，誘導cAMP反應序列基因表達，減少神經元調亡，從而改善AD患者的認知障礙[19-20]。另有文獻報道，ERK的活化可誘導CREB發(fā)生磷酸化，磷酸化后的CREB又進一步誘導cAMP反應序列基因表達，從而改善AD患者的認知障礙[21-22]。

本研究結果顯示，模型組PC12細胞中CREB mRNA 表達水平顯著低于對照組，而經芥子酸作用后，細胞中CREB mRNA 表達水平顯著升高;但是經PI3K抑制劑LY294002和ERK抑制劑U0126干預后，細胞中CREB mRNA 表達水平均顯著降低。這表明芥子酸對PC12細胞損傷的改善作用與促進CREB mRNA轉錄有關。進一步研究發(fā)現，經芥子酸作用后，PC12細胞中cAMP、PKA、p-CREB蛋白表達水平均顯著升高;但是經PI3K抑制劑LY294002和ERK抑制劑U0126干預后，細胞中上述蛋白表達水平則顯著降低。這表明芥子酸對PC12細胞損傷的改善作用與升高cAMP、PKA蛋白的表達水平，促進CREB蛋白的磷酸化有關。

綜上所述，芥子酸可升高Aβ42誘導損傷的PC12細胞存活率，改善細胞形態(tài)，降低細胞中Aβ42含量，其作用機制可能與促進細胞中CREB mRNA轉錄、激活cAMP/PKA/CREB信號通路有關。

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