蔣春月，馬浩，范慶煒，楊慧凌，徐冬冬，王韻，杜冰，2

1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，四川 南充 637000

插入/缺失（insertion/deletion，InDel）是基因組中插入或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基而形成的遺傳標(biāo)記，屬于二等位基因遺傳標(biāo)記[1]。InDel 多態(tài)性遺傳標(biāo)記兼具STR和SNP的優(yōu)點(diǎn)，突變率低，擴(kuò)增片段可小于100 bp，適用于降解檢材，可采用目前法醫(yī)學(xué)主流遺傳標(biāo)記STR 常用的毛細(xì)管電泳平臺(tái)進(jìn)行分型，受到國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者的關(guān)注[2]。本研究擬通過調(diào)查AGCU InDel 60熒光檢測(cè)試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）中57 個(gè)常染色體InDel（autosomal-InDel，A-InDel）位點(diǎn)在四川省北川羌族自治縣羌族人群中的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，評(píng)估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本

按照知情同意原則，用FTA 采血卡采集200 例四川省北川羌族健康無關(guān)個(gè)體的血樣，其中男性171例，女性29 例。

通過Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens）查詢千人基因組計(jì)劃Ⅲ期數(shù)據(jù)，獲得5 個(gè)東亞人群、5 個(gè)南亞人群、7 個(gè)非洲人群、4 個(gè)美洲人群以及5 個(gè)歐洲人群共26 個(gè)人群的InDel 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率作為比較數(shù)據(jù)，探討本研究人群與這些人群的遺傳關(guān)系，具體信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫中26 個(gè)人群的信息Tab.1 Information of 26 populations in the database

本研究已獲得川北醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批文號(hào)為［2021］14 號(hào)。

1.2 PCR 擴(kuò)增

根據(jù)AGCU InDel 60 熒光檢測(cè)試劑盒說明書，采用直接擴(kuò)增法（免提?。?duì)血樣進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10 μL，其中Reaction Mix 4 μL、InDel 60 Primers 2 μL、熱啟動(dòng)U-Taq酶0.4 μL、去離子水3.6 μL，模板DNA為直徑1.2 mm的血斑1片。采用9700型PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，62 ℃60 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)分析

采用3500 基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳。取1 μL PCR 產(chǎn)物、10 μL去離子甲酰胺和0.3 μL 內(nèi)標(biāo)AGCU Marker SIZ-500 混勻，95 ℃變性3 min 后，立即冰浴3 min。用GeneMapper?ID-X1.4 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行分型。InDel 位點(diǎn)中的插入（insertion）等位基因和缺失（deletion）等位基因分別命名為I 和D，Amelogenin位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因分別為X 和Y。

1.4 質(zhì)量控制

每批樣本的檢測(cè)均采用去離子水和標(biāo)準(zhǔn)品9948分別作為擴(kuò)增的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Modified-Powerstats 標(biāo)準(zhǔn)版軟件計(jì)算獲得57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)的等位基因頻率（Fins和Fdel）、DP、PIC、CDP。采用Cervus 3.0.7 軟件（http://www.fieldge netics.com/pages/home.jsp）進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，并計(jì)算Ho、He、PEtrio、PEduo、CPEtrio和CPEduo。使用STRAF 網(wǎng)頁版（http://cmpg.unibe.ch/shiny/STRAF/）進(jìn)行連鎖不平衡分析。采用Arlequin 3.5.2.2軟件計(jì)算遺傳分化系數(shù)（Fst），并基于基因型數(shù)據(jù)計(jì)算27 個(gè)人群的Fst遺傳距離，再用MEGA 5.05 軟件（https://megasoft ware.net/）采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用POPTREE2 軟件基于基因頻率計(jì)算27 個(gè)人群的Nei’s 遺傳距離，并采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 等位基因分型結(jié)果

200 例北川羌族無關(guān)個(gè)體的血樣中，57 個(gè)AInDel、2 個(gè)Y-InDel 和Amelogenin位點(diǎn)均得到有效擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段均在80～230 bp，InDel 位點(diǎn)信息見表2。男性樣本的Y-InDel 位點(diǎn)檢測(cè)到1 個(gè)等位基因，Amelogenin位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為XY；女性樣本的Y-InDel位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為陰性，Amelogenin位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為X。

表2 北川羌族人群59 個(gè)A-InDel位點(diǎn)的基本信息Tab.2 Basic information of 59 A-InDels in Beichuan Qiang population

2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)中，除rs5787309、rs10590825、rs1160980、rs33971783和rs561160795 外，其余52 個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。采用Bonferroni法進(jìn)行校正，57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)的P值均大于0.000 88（0.05/57），表明所有位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg 平衡。

2.3 連鎖不平衡檢驗(yàn)

57個(gè)A-InDel位點(diǎn)兩兩之間共進(jìn)行了1 596次連鎖不平衡檢驗(yàn)，其中87 次比較結(jié)果的P值為0.000 947～0.049 932，且該87 對(duì)兩兩比較的位點(diǎn)均位于不同的染色體上。經(jīng)過Bonferroni法校正，各位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象［P值均大于0.000 031（0.05/1 596）］。

2.4 等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)

57個(gè)A-InDel位點(diǎn)的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)見表3。Fdel值為0.272 5～0.760 0，F(xiàn)ins值為0.240 0～0.727 5；Ho值為0.370 0～0.585 0，He 值為0.365 7～0.501 2，PIC 值為0.298 3～0.375 0，DP 值為0.529 5～0.659 0，PEtrio值為0.234 9～0.281 2，PEduo值為0.066 5～0.125 0。由于57個(gè)A-InDel位點(diǎn)間處于連鎖平衡狀態(tài)，故可采用乘積定律計(jì)算其CDP 和CPE。57 個(gè)A-InDel位點(diǎn)在北川羌族人群中的CDP 值為1-2.974 8×10-24，CPEtrio值為0.999 999 999，CPEduo值為0.999 062 660。

2.5 北川羌族人群與其他人群基于57個(gè)A-InDel位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)比較

應(yīng)用本研究獲得的北川羌族人群和數(shù)據(jù)庫所得26 個(gè)人群57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)的數(shù)據(jù)，計(jì)算得到Fst值（表3）、Fst遺傳距離（圖1）和Nei’s 遺傳距離（表4）。rs151335218、rs769299 和rs140683187 等22 個(gè)InDel位點(diǎn)的Fst值小于0.06，其余35 個(gè)InDel 位點(diǎn)的Fst值均大于0.06。Nei’s 遺傳距離和Fst遺傳距離均顯示北川羌族人群與北京漢族和南方漢族人群遺傳距離最近，與岡比亞西部人群遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖1 27 個(gè)人群的Fst遺傳距離Fig.1 Fst genetic distances of 27 populations

表3 北川羌族人群57 個(gè)A-InDel位點(diǎn)的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)Tab.3 Allele frequencies and population genetic parameters of 57 A-InDels in Beichuan Qiang population（n=200）

續(xù)表3Continued Tab.3

根據(jù)Nei’s 遺傳距離和Fst遺傳距離，采用NJ 法構(gòu)建27 個(gè)人群間的系統(tǒng)發(fā)育樹?；贜ei’s 遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2A）顯示，整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為4個(gè)分支，北川羌族人群與東亞人群位于同一分支?；贔st遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2B）群體分布格局與基于Nei’s 遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹相似。

圖2 27 個(gè)人群間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of 27 populations

3 討論

羌族是我國少數(shù)民族之一，根據(jù)第六次全國人口普查結(jié)果，羌族的總?cè)丝跀?shù)為309 576 人[3]，主要居住在四川省阿壩藏族羌族自治州的茂縣、汶川、理縣和北川羌族自治縣[4]。羌族的民族語言是羌語，屬于漢藏語系中藏緬語族的羌族分支。目前已有學(xué)者[5-7]對(duì)羌族線粒體DNA、SNP 和STR 等遺傳標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行了研究，本研究對(duì)200 例羌族健康無關(guān)個(gè)體57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查分析，為InDel 遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Bonferroni 法校正后，57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg 平衡，因此，本研究樣本資料可靠。連鎖不平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在北川羌族人群中不存在連鎖不平衡現(xiàn)象（P＞0.000 031），提示這些位點(diǎn)是相互獨(dú)立的遺傳標(biāo)記，可用于法醫(yī)學(xué)鑒定。北川羌族人群57 個(gè)AInDel位點(diǎn)中，除rs66595817、rs72085595外，其余55個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率均在0.3～0.7范圍內(nèi)，表明這57個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在北川羌族人群中的等位基因分布較均衡。由表3 可見，F(xiàn)ins、DP、PIC、Ho、He、PEduo、PEtrio的最小值均在rs72085595 出現(xiàn)，該位點(diǎn)在已報(bào)道的藏族[8]、成都漢族[8]、摩梭人[8]、黑龍江漢族[9]、上海漢族[9]等人群中的Fins、H 及PIC 也較低，提示該位點(diǎn)在亞洲人群中的遺傳多態(tài)性可能較低。57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在北川羌族人群中的CDP 值為1-2.974 8×10-24，高于0.999 999 999 999 99，可以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別；而CPEtrio值 為0.999 999 999，CPEduo值 為0.999 062 660（小于0.999 9），提示其可以應(yīng)用于三聯(lián)體親子鑒定，單獨(dú)應(yīng)用不能滿足二聯(lián)體親子鑒定要求，但可作為常規(guī)STR 檢測(cè)試劑盒的補(bǔ)充和驗(yàn)證。

Fst反映了特定基因座在群體間分布的差異程度，F(xiàn)st值越小，說明差異程度越小[10]。有學(xué)者[11]認(rèn)為，F(xiàn)st值小于0.06 可保證所選擇的位點(diǎn)適用于不同群體，從而得到穩(wěn)定的個(gè)體識(shí)別能力。本研究中rs151335218、rs769299、rs140683187 等22 個(gè)A-InDel位點(diǎn)的Fst值小于0.06，提示該22 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在27 個(gè)人群間差異很小，可適用于不同群體。另外，rs34421865、rs3076465、rs34287950 等35 個(gè)A-InDel位點(diǎn)的Fst值大于0.06，說明這35 個(gè)位點(diǎn)在27 個(gè)人群間基因頻率差異較大，在群體遺傳學(xué)和種群識(shí)別方面有重要的應(yīng)用價(jià)值[10]。

遺傳距離是用于評(píng)估群體間遺傳差異或遺傳分化的重要參數(shù)。本研究中北川羌族人群與北京漢族和南方漢族人群遺傳距離最近，與非洲人群遺傳距離較遠(yuǎn)，其中與岡比亞西部人群遺傳距離最遠(yuǎn)，提示遺傳距離和實(shí)際地域的物理距離區(qū)分度基本相似。此外，基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2A）顯示有4 個(gè)主要分支（東亞分支、南亞分支、歐洲分支和非洲分支），提示群體所處地理位置與遺傳距離密切相關(guān)；美洲人群分散在東亞和非洲的分支，可能是因?yàn)槎?zhàn)前亞洲及非洲人口遷移至美洲所致[12]。就研究人群而言，北川羌族人群屬于東亞分支，與南方漢族和日本人群首先聚類，該結(jié)果與王敬方等[6]對(duì)四川羌族SNP 多態(tài)性進(jìn)行分析得到的結(jié)論類似。為了進(jìn)一步驗(yàn)證27 個(gè)人群之間的遺傳結(jié)構(gòu)，本研究使用基因型數(shù)據(jù)計(jì)算Fst遺傳距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2B）。基于Fst遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹群體分布格局與基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹相似，但北川羌族與北京漢族人群的遺傳關(guān)系更為密切。由此可以看出，基于基因頻率的Nei’s 遺傳距離的分析結(jié)果與基于基因型的Fst遺傳距離的分析結(jié)果基本一致，提示這57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在一定程度上可以用于生物地理祖先推斷。

本研究獲得了57 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在四川省北川羌族人群中的等位基因頻率及遺傳學(xué)參數(shù)，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。