楊光遠(yuǎn)，袁春艷，陶瑞旸，夏若成，王亞麗，董新宇，3，柴思雨，4，吳黎明，3，蔣志偉，5，蔣婷婷，6，陳開琴，4，李成濤，陳麗琴

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010030；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；4.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；5.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035；6.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515

STR 具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、分型快速等優(yōu)勢(shì)，是目前法醫(yī)物證鑒定中最常使用的遺傳標(biāo)記，被廣泛用于個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定[1]。然而，STR 也存在一定的局限性，其存在影子峰（stutter peak）、突變率較高、擴(kuò)增片段長(zhǎng)等缺點(diǎn)[2]。插入/缺失（insertion/deletion，InDel）和SNP 大多為二等位遺傳標(biāo)記，突變率低于STR[3]，且擴(kuò)增片段相對(duì)較短[4-5]，一定數(shù)量InDel 和SNP 的復(fù)合檢測(cè)可作為輔助工具彌補(bǔ)STR 檢測(cè)的不足。其中，SNP 的檢測(cè)方法復(fù)雜多樣，在實(shí)驗(yàn)室間難以統(tǒng)一，不易于推廣應(yīng)用。相比之下，InDel適用于復(fù)合熒光多重PCR 聯(lián)合毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）分型平臺(tái)，易于在法醫(yī)DNA 實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。目前，已有研究針對(duì)不同群體設(shè)計(jì)了多重InDel 擴(kuò)增體系并評(píng)估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值[6-14]，其中，Investigator DIPplex試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）是應(yīng)用較為廣泛的商品化試劑盒，包含30 個(gè)常染色體InDel（autosomal-InDel，A-InDel）位點(diǎn)。然而，有研究[15-17]表明該體系中部分InDel 位點(diǎn)在我國(guó)人群中的多態(tài)性較低，如rs16438 和rs1305047 在我國(guó)漢族人群中的PIC 值分別為0.11 和0.14[15]，低多態(tài)性位點(diǎn)的存在導(dǎo)致Investigator DIPplex試劑盒的應(yīng)用受到限制。因此，為了建立一套適用于中國(guó)人群的高多態(tài)性InDel 擴(kuò)增體系，本課題組前期研究[18]針對(duì)我國(guó)人群篩選出遺傳多態(tài)性較高且數(shù)量更多的InDel 位點(diǎn)，構(gòu)建了SifaInDel 45plex 體系，其中包括27 個(gè)A-InDel、16 個(gè)X 染色體InDel（X-InDel）和2 個(gè)Y 染色體InDel（Y-InDel）位點(diǎn)。

漢族是我國(guó)的主體民族，在我國(guó)呈現(xiàn)東密西疏的分布特點(diǎn)。漢族的語言通稱漢語，屬漢藏語系，是世界上歷史最悠久、最豐富的語言之一。蒙古族則是我國(guó)傳統(tǒng)的游牧民族，主要分布于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等省份，其民族語言為蒙古語，屬阿爾泰語系。根據(jù)2020 年第七次全國(guó)人口普查數(shù)據(jù)[19]，漢族人口超過12億，占全國(guó)總?cè)丝诘?1.11%，而蒙古族人口接近630萬人，相較于2010，其人口增加200 萬余，是我國(guó)人口較多的少數(shù)民族之一。本研究擬應(yīng)用SifaInDel 45plex體系對(duì)我國(guó)江蘇漢族和內(nèi)蒙古蒙古族人群進(jìn)行遺傳多態(tài)性調(diào)查，并評(píng)估該體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效能，為其在法醫(yī)DNA領(lǐng)域的應(yīng)用積累人群數(shù)據(jù)。同時(shí)基于gnomAD 數(shù)據(jù)庫(kù)[20]篩選獲得東亞人、非洲及美國(guó)非洲裔人、美洲拉丁裔人、阿米什人、芬蘭人、非芬蘭歐洲人、猶太人與中東人8個(gè)洲際人群數(shù)據(jù)，探討不同人群間的遺傳關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本

實(shí)驗(yàn)樣本：本研究共采集398 例健康無關(guān)個(gè)體的外周血樣本，其中，江蘇漢族200 例、內(nèi)蒙古蒙古族198 例。所有研究對(duì)象在采樣前均簽署知情同意書，該研究已獲得司法鑒定科學(xué)研究院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

參考人群樣本：東亞人、非洲及美國(guó)非洲裔人、美洲拉丁裔人、阿米什人、芬蘭人、非芬蘭歐洲人、猶太人與中東人8 個(gè)不同洲際人群數(shù)據(jù)選自gnomAD 數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 DNA 提取與定量

使用QIAamp DNA Blood Mini 試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）進(jìn)行DNA提取，具體操作參照試劑盒說明書。使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）檢測(cè)樣本DNA 的濃度及純度。

1.3 PCR 擴(kuò)增

基于9700 型PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司），使用SifaInDel 45plex 體系對(duì)DNA 樣本進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為10 μL，包括：2 μL 反應(yīng)預(yù)混液，2 μL 引物混合物，2 μL DNA 模板（1 ng/μL），4 μL 去離子水。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 60 min；4 ℃保存。

1.4 電泳與分型

PCR產(chǎn)物在3130xl基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，使用GeneMapperTMIDv3.2.1 軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）對(duì)電泳原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Arlequin v3.5.2 軟件[21]檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡并進(jìn)行連鎖不平衡分析。運(yùn)用Microsoft Office Excel 軟件分別統(tǒng) 計(jì)27 個(gè)A-InDel 和16 個(gè)X-InDel 位點(diǎn)的等位基因頻率、Ho、He、DP、CDP、PIC、PE、CPE、MEC、CMEC等群體遺傳學(xué)參數(shù)。27個(gè)A-InDel位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù)根據(jù)《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T 37223—2018）計(jì)算。16 個(gè)X-InDel 位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群男性群體和女性群體中的群體遺傳學(xué)參數(shù)依據(jù)文獻(xiàn)[22-23]公式進(jìn)行計(jì)算。使用Arlequin v3.5.2 軟件計(jì)算2 個(gè)研究人群和8 個(gè)參考人群間的Fst遺傳距離，根據(jù)遺傳距離矩陣分別應(yīng)用MEGA 11軟件[24]和SPSS 25.0 軟件（美國(guó)IBM 公司）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹與多維尺度（multidimensional scaling，MDS）分析圖。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡和連鎖不平衡分析

Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Bonferroni校正后27 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.001 9），且16 個(gè)X-InDel 位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.003 1）。連鎖不平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，所有位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象，即27 個(gè)A-InDel 和16 個(gè)XInDel位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中可視為彼此獨(dú)立遺傳。

2.2 等位基因頻率分布

27 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中的缺失等位基因頻率：在江蘇漢族為0.240 0（rs2307783）～0.697 5（rs66850318），在內(nèi)蒙古蒙古族 為0.219 7（rs2308232）～0.669 2（rs2307805）。

16 個(gè)X-InDel 位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中的缺失等位基因頻率：在江蘇漢族為0.116 7（rs36208458）～0.896 7（rs200177947），在內(nèi)蒙古蒙古族為0.132 1（rs36208458）～0.906 1（rs200177947）。

2.3 群體遺傳學(xué)參數(shù)

27 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)在江蘇漢族和內(nèi)蒙古蒙古族人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù)見表1。其中，PIC 分別為0.298 3（rs2307783）～0.374 9（rs35248926）和0.284 1（rs2308232）～0.375 0（rs35248926、rs3837647），CDP分別為0.999 999 999 982 175和0.999 999 999 986 552，CPEtrio分別為0.991 449 541 和0.997 986 006，CPEduo為0.953 418 308 和0.955 381 659。

表1 27 個(gè)A-InDel位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù)Tab.1 Population genetic parameters of 27 A-InDels in two studied populations

16 個(gè)X-InDel 位點(diǎn)在江蘇漢族和內(nèi)蒙古蒙古族人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù)見表2。其中，PIC 分別 為0.168 1（rs200177947）～0.374 9（rs66554185）和0.155 7（rs200177947）～0.374 6（rs72513349），CMECtrio分別 為0.998 018 512 和0.998 243 638，CMECduo分 別為0.974 854 830 和0.976 907 303。在2 個(gè)研究人群的女性群體中，CDPfemale分別為0.999 997 962 和0.999 998 389；男性群體中，CDPmale為0.999 818 940和0.999 856 063。

表2 16 個(gè)X-InDel位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù)Tab.2 Population genetic parameters of 16 X-InDels in two studied populations

此外，2 個(gè)Y-InDel 位點(diǎn)在所有男性群體中均被檢出，在所有女性群體中均未被檢出。

2.4 10個(gè)人群間的遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)10 個(gè)人群27 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)的等位基因頻率，使用Arlequin v3.5.2軟件計(jì)算得到Fst遺傳距離，結(jié)果顯示，江蘇漢族、內(nèi)蒙古蒙古族和東亞人群間Fst遺傳距離較近（0.000 06～0.000 27），以上3 個(gè)人群與其他7個(gè)洲際人群間Fst遺傳距離較遠(yuǎn)（0.001 82～0.004 62）。

為了更加直觀地反映不同人群間的遺傳關(guān)系，基于人群間的遺傳距離矩陣構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）與MDS 分析圖（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：10 個(gè)人群共分為兩大主支；本研究中的漢族、蒙古族和東亞人群為一支，且漢族與蒙古族人群進(jìn)一步聚為同一分支；7 個(gè)洲際人群聚為一支，其中3 個(gè)歐洲人群、2 個(gè)西亞人群、1 個(gè)美洲人群以及1 個(gè)非洲人群分別位于獨(dú)立分支。MDS 分析圖中，漢族、蒙古族和東亞人群聚集在右上方；除非洲外的6 個(gè)洲際人群分布在右下方，非洲人群則位于左下方。

圖1 10 個(gè)人群間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 10 populations

圖2 10 個(gè)人群間的MDS 分析圖Fig.2 MDS analysis diagram of 10 populations

3 討論

InDel是一種二等位基因遺傳標(biāo)記，廣泛存在于人類基因組中，兼具STR 與SNP 的優(yōu)點(diǎn)，可用于群體遺傳學(xué)領(lǐng)域，其中包括探尋祖先遺傳信息、分析群體的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)等[25]。本研究使用自主研發(fā)的SifaInDel 45plex 體系對(duì)我國(guó)江蘇漢族和內(nèi)蒙古蒙古族共398 名無關(guān)個(gè)體進(jìn)行遺傳多態(tài)性調(diào)查，并基于其27 個(gè)AInDel 位點(diǎn)分析上述2 個(gè)研究人群與其他8 個(gè)參考人群間的遺傳關(guān)系。

在江蘇漢族和內(nèi)蒙古蒙古族人群中，27個(gè)A-InDel和16 個(gè)X-InDel 位點(diǎn)的分布均符合Hardy-Weinberg平衡，位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。CPE、MEC和CDP 是法醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域常用的評(píng)估指標(biāo)，在本研究中，27 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)的CDP 均高于0.999 999 999 9，說明該試劑盒可用于江蘇漢族與內(nèi)蒙古蒙古族人群的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別。但CPEtrio在2 個(gè)研究人群中均小于0.999 9，不建議單獨(dú)應(yīng)用于親權(quán)鑒定，可作為常規(guī)STR 分型試劑盒的有效補(bǔ)充。相比于以往的檢測(cè)體系[10，26-28]，SifaInDel 45plex體系同時(shí)包含了27個(gè)AInDel、16 個(gè)X-InDel 和2 個(gè)Y-InDel 位點(diǎn)，可獲得更多的遺傳信息，并能夠有效地提高性染色體的識(shí)別度，為復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定提供有效的遺傳信息。該體系的不足之處在于CPE 值較低，無法獨(dú)立應(yīng)用于親權(quán)鑒定，在后續(xù)優(yōu)化過程中，可將該體系中部分InDel 位點(diǎn)進(jìn)行替換以提高該體系的系統(tǒng)效能。

不同民族人群的遺傳標(biāo)記分布存在差異，這對(duì)全面了解各人群的遺傳多態(tài)性和相互遺傳關(guān)系具有重大意義。研究InDel 位點(diǎn)在不同人群間的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，可促進(jìn)其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用。本研究選取了10 個(gè)具有代表性的人群，包括1 個(gè)中國(guó)江蘇漢族人群、1 個(gè)中國(guó)內(nèi)蒙古蒙古族人群以及8 個(gè)洲際人群。其中，江蘇漢族人群主要分布在我國(guó)華東地區(qū)，內(nèi)蒙古蒙古族人群主要分布在我國(guó)西北地區(qū)，其他8 個(gè)參考人群則分布在不同洲際。江蘇漢族、內(nèi)蒙古蒙古族與東亞人群的地理位置分布較近，與其他7 個(gè)洲際人群地理距離較遠(yuǎn)，將遺傳關(guān)系與地理分布信息相結(jié)合，有助于加深對(duì)不同地區(qū)、不同民族間遺傳關(guān)系和遺傳背景的理解。基于27 個(gè)A-InDel 位點(diǎn)的等位基因頻率計(jì)算得到10 個(gè)人群間的遺傳距離矩陣，其結(jié)果顯示，我國(guó)江蘇漢族、內(nèi)蒙古蒙古族以及東亞人群間遺傳距離較近，與其他7 個(gè)洲際人群間遺傳距離較遠(yuǎn)。為了進(jìn)一步明確人群間的遺傳關(guān)系，本研究根據(jù)遺傳距離矩陣構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹和MDS 分析圖。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，10 個(gè)人群分為2 個(gè)主支，第一主支由我國(guó)江蘇漢族、內(nèi)蒙古蒙古族以及東亞人群構(gòu)成。本研究中東亞參考人群包含除我國(guó)外的其他東亞地區(qū)人群，如韓國(guó)人群、日本人群等，包含樣本數(shù)量多且分布范圍較廣。也就是說，第一主支中遺傳關(guān)系較近的3 個(gè)人群均分布在東亞地區(qū)。因此，本研究進(jìn)一步從分子遺傳學(xué)角度證實(shí)，地理位置相近的民族可能會(huì)有更多的基因交流，從而具有較近的遺傳關(guān)系。第二主支由其他7 個(gè)洲際參考人群構(gòu)成，其中3 個(gè)歐洲人群、2 個(gè)西亞人群、1 個(gè)美洲人群以及1 個(gè)非洲人群進(jìn)一步形成各自分支。MDS 分析圖顯示，本研究中江蘇漢族、內(nèi)蒙古蒙古族與東亞人群聚在一起，遺傳關(guān)系較近，且與其他洲際人群的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。上述遺傳距離矩陣、系統(tǒng)發(fā)育樹和MDS 分析圖所反映的遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近與歷史文化背景及地域分布等較為吻合，江蘇漢族、內(nèi)蒙古蒙古族與地理位置分布近的東亞參考人群具有較近的遺傳關(guān)系，與地理位置相隔遠(yuǎn)的其他洲際人群的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，這也間接表明地域隔離對(duì)人群間遺傳背景的影響，從而形成了獨(dú)特的地域遺傳差異。本研究結(jié)果與既往研究[29-30]結(jié)果基本一致。

綜上所述，本研究應(yīng)用SifaInDel 45plex 體系對(duì)我國(guó)江蘇漢族和內(nèi)蒙古蒙古族共398 名無關(guān)個(gè)體進(jìn)行了遺傳多態(tài)性調(diào)查，獲得了人群的等位基因頻率以及PIC、CDP、CPE 等群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，并與不同洲際人群進(jìn)行了遺傳關(guān)系分析。結(jié)果表明，SifaInDel 45plex體系包含的InDel 位點(diǎn)在2 個(gè)研究人群中有較好的多態(tài)性和鑒別能力，并能夠區(qū)分不同洲際人群。本研究獲得了2 個(gè)研究人群45 個(gè)InDel 位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)及等位基因頻率等信息，豐富了中國(guó)人群InDel 數(shù)據(jù)庫(kù)，也為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及群體遺傳研究提供了數(shù)據(jù)支持。