魏孫祥，陳惠香，胡勝，趙一霞，石慧霞，王哲，李文，季安全，孫啟凡

1.山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，山西 太原 030001；2.公安部鑒定中心 現場物證溯源技術國家工程實驗室法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京 100038

確定案發(fā)現場遺留的體液斑跡組織屬性對于推斷案件性質、重建犯罪現場等具有重要意義[1-2]，其中精液（斑）是法醫(yī)物證鑒定中常見的生物物證，尤其對于強奸、猥褻案件至關重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長度為18～24 個堿基的非編碼RNA，具有高穩(wěn)定性、強保守性、良好的組織特異性、可兼容DNA 同步分析等優(yōu)勢，是法醫(yī)學體液鑒定的重要工具[3-8]。微滴式數字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是一種高靈敏度、高精確性的定量方法，對于低濃度核酸分子檢測結果的可重復性好，可用于miRNA 的絕對定量檢測[9-10]。研究[5-6]結果表明，miR-888 和miR-891a 具有良好的精液特異性，可通過對其表達量的檢測進行精液鑒定，但目前使用的檢測方法均為實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR）相對定量法，使用不同的內參基因可能會對檢測結果作出不同的解釋[11]，受抑制劑、檢測平臺和擴增效率影響較大，對結果的解釋不夠直接和客觀[12]。

本研究旨在建立可同時檢測miR-888和miR-891a的雙重ddPCR 檢測體系，通過絕對定量對miR-888 和miR-891a 作為精液特異性標記的可靠性進行評估，以期為精液鑒定提供更科學、準確的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑

QX200 AutoDG 微滴式數字PCR 系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），包括自動化微滴生成器、PX1 PCR 反應板熱封儀、帶96-深孔反應模塊的C1000 Touch 熱循環(huán)儀和QX200TM微滴讀取器；NanoDrop 2000c 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

miRNeasy Mini試劑盒（德國Qiagen公司），TaqManTMMicroRNA逆轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），ddPCR超混合液（無dUTP，美國Bio-Rad公司）。

1.1.2 引物、探針設計與標準品RNA 合成

miR-888、miR-891a 的成熟序列[5]及引物和探針信息見表1，探針的報告基團分別采用6-FAM 和HEX熒光修飾。自行設計引物、探針后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-888、miR-891a 標準品RNA 由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 miR-888、miR-891a 的成熟序列及引物和探針信息Tab.1 Information of mature sequences，primers and probes of miR-888 and miR-891a

1.1.3 樣本制備

對75 名來自中國北方地區(qū)年齡在25～35 歲的健康志愿者進行樣本采集，收集5 種法醫(yī)學相關體液樣本共75 份，其中精液35 份，外周血、月經血、唾液、陰道分泌液各10 份。

外周血通過靜脈穿刺收集后置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝采血管內。

唾液使用無菌塑料管收集（樣本收集前志愿者禁食1 h）。

精液使用無菌廣口塑料杯收集（樣本收集前，志愿者禁欲2 d）。

月經血（于月經周期的第2 天或第3 天采集）和陰道分泌液使用衛(wèi)生棉條獲取。

所有樣本采集制備后均儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

本研究已通過公安部鑒定中心倫理委員會的審查（審批文號：2020-024），所有志愿者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和定量

按照miRNeasy Mini 試劑盒操作說明書進行總RNA 的提取[13]，使用NanoDrop 2000c 分光光度計測定總RNA 的質量濃度和純度（D260/D280）[8]。

1.2.2 互補DNA（complementary DNA，cDNA）合成

采用莖環(huán)反轉錄法[8]，按照TaqManTMMicroRNA逆轉錄試劑盒操作說明書進行反轉錄。每15 μL 反應體系包括總RNA 10 ng，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）預混液（100 mmol/L）0.15 μL，MultiScribeTM逆轉錄酶（50 U/μL）1.00 μL，10×反轉錄緩沖液1.50 μL，RNA 酶抑制劑（20 U/μL）0.19 μL，miR-888逆轉錄莖環(huán)引物（1 μmol/L）0.15 μL，miR-891a 逆轉錄莖環(huán)引物（1 μmol/L）0.15 μL，加無核酸酶水（日本TaKaRa 公司）至15 μL。設置反轉錄陰性對照（用無核酸酶水取代逆轉錄酶）。反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保持。

1.2.3 雙重ddPCR 檢測體系的建立和優(yōu)化

按照微滴生成、PCR 擴增和微滴讀取3個步驟進行體系的建立。首先針對miR-888 和miR-891a 建立單獨的ddPCR 檢測體系，在此基礎上，通過優(yōu)化退火溫度和熱循環(huán)數，建立雙重ddPCR 檢測體系。

（1）微滴生成。雙重ddPCR 檢測miR-888和miR-891a，每22 μL 反應體系包括探針用ddPCR 超混合液（無dUTP）11 μL，cDNA 1.1 μL，通用反向引物（20 μmol/L）0.99 μL，miR-888、miR-891a 特異性正向引物（20 μmol/L）各0.99 μL，miR-888、miR-891a 熒光探針（20 μmol/L）各0.275 μL，無核酸酶水6.38 μL。設置陰性對照（使用無核酸酶水代替cDNA 作為模板）。將樣品轉移至96 孔板中，于自動化微滴生成器中生成微滴，放置另一96 孔板以接收生成的微滴。

（2）PCR 擴增。將接收微滴的96 孔板蓋膜，封膜，PCR 擴增。PCR 擴增程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56～62 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，45 個循環(huán)；98 ℃ 10 min，4 ℃保持。升降溫速度為2 ℃/s。miR-888、miR-891a的單獨檢測及雙重檢測均使用此反應條件。

（3）微滴讀取。擴增完畢后，在QX200TM微滴讀取器上讀取微滴數據，采用QuantaSoft v1.7.4軟件（美國Bio-Rad公司）獲取目標片段的拷貝濃度。包含10 000個以上微滴的反應被視為有效反應，并用于數據分析[14-15]。

（4）雙重ddPCR 檢測條件優(yōu)化。優(yōu)化ddPCR 反應條件，包括退火溫度和熱循環(huán)數。使用帶96-深孔反應模塊的C1000 Touch 熱循環(huán)儀溫度梯度功能進行PCR 擴增退火溫度的優(yōu)化，設置退火溫度梯度為：62 ℃、61.6 ℃、60.9 ℃、59.8 ℃、58.4 ℃、57.3 ℃、56.5 ℃、56 ℃。設置熱循環(huán)數為35、40、42、43、45、46 個。

1.2.4 雙重檢測與單獨檢測的結果比較

為驗證雙重ddPCR 檢測體系的準確性，使用雙重體系與單一體系同時對隨機挑選的4 份精液樣本進行miR-888 和miR-891a 的檢測和拷貝濃度比較。雙重ddPCR 檢測體系為在同一反應孔內加入miR-888 和miR-891a 的正反向引物和探針，其中miR-888和miR-891a 的引物濃度配比為1∶1，利用5′端不同熒光修飾的探針可同時檢測這兩種miRNA。單獨miRNA 檢測體系為在同一反應孔內僅加入其中一個miRNA 的引物和探針，用無核酸酶水代替另一個miRNA 的引物和探針，即miR-888 和miR-891a 在不同反應孔內單獨進行檢測。

1.2.5 靈敏度檢測

對隨機挑選的6 份樣本（精液2 份、外周血1 份、月經血1份、唾液1份、陰道分泌液1份）提取的總RNA從10 ng 開始進行10 倍梯度稀釋，共4 個梯度，即總RNA 量分別為10 ng、1 ng、0.1 ng、10 pg，利用1.2.3 節(jié)建立和優(yōu)化后的雙重ddPCR 檢測體系進行檢測。

1.2.6 重復性檢測

對miR-888、miR-891a標準品RNA 各5 ng進行稀釋，稀釋倍數分別為2 500、12 500、62 500、312 500 倍。以不同濃度的標準品核酸為模板，使用1.2.3 節(jié)建立和優(yōu)化后的雙重ddPCR 檢測miR-888 和miR-891a，每個濃度設立3個復孔，計算其變異系數，以評價檢測方法在不同濃度下的批內重復性。在同樣的反應條件下進行2 次試驗（每次試驗每個濃度設置3 個重復求平均值作為結果），計算其變異系數，評價該方法的批間重復性。

1.2.7 數據分析

采用配對樣本t檢驗對ddPCR 雙重檢測與單獨檢測的結果進行差異性分析，采用Mann-WhitneyU檢驗對精液與其他常見體液中目標片段的拷貝濃度進行差異性分析，通過受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析，根據曲線下面積（area under the curve，AUC）評估m(xù)iR-888 和miR-891a區(qū)分精液的能力，并計算約登指數（Youden index）確定最佳的鑒別截斷值。使用GraphPad Prism 9.0 軟件（美國GraphPad Software 公司）進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 總RNA 的質量濃度和純度

本研究5 種體液共75 份樣本提取后的總RNA 質量濃度和純度見表2。不同類型體液之間的總RNA質量濃度和純度具有一定差別。外周血樣本具有最高的質量濃度，而唾液樣本的質量濃度始終較低。所提總RNA 的平均純度在（1.75±0.10）～（1.99±0.06）。

表2 5 種體液的總RNA 質量濃度和純度Tab.2 Mass concentration and purity of total RNA extracted from 5 body fluids（±s）

表2 5 種體液的總RNA 質量濃度和純度Tab.2 Mass concentration and purity of total RNA extracted from 5 body fluids（±s）

2.2 雙重ddPCR 檢測體系的建立和優(yōu)化

如1.2.3節(jié)所述，經退火溫度梯度實驗（56～62 ℃），根據兩個檢測通道陽性微滴和陰性微滴的分離狀態(tài)，將退火溫度設為56.5 ℃；分別嘗試將熱循環(huán)數設為35、40、42、43、45、46 個，發(fā)現當擴增效率較低時，適當增加熱循環(huán)數能夠提高陽性微滴信號，并使其更加集中分布，有利于陽性和陰性信號的區(qū)分，最終將最優(yōu)熱循環(huán)數設置為45 個。

經優(yōu)化后，雙重ddPCR檢測miR-888和miR-891a的擴增圖見圖1。

圖1 雙重ddPCR 檢測miR-888 和miR-891a 的擴增圖Fig.1 Amplification plots of miR-888 and miR-891a detected by duplex ddPCR

2.3 雙重檢測與單獨檢測的結果比較

4 份精液樣本經ddPCR 雙重檢測與單獨檢測的結果見表3，經配對樣本t檢驗，兩種方法得出的目標片段拷貝濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 精液樣本經ddPCR 雙重檢測和單獨檢測的目標片段拷貝濃度Tab.3 The target fragment copy concentrations of semen samples detected by duplex ddPCR and single ddPCR（copies/μL）

2.4 靈敏度檢測

雙重ddPCR 檢測體系的靈敏度檢測結果見圖2。當稀釋100 倍后（0.1 ng 總RNA），該體系仍然能準確地從5種體液中鑒別出精液。當總RNA 量為10 pg時，該體系在月經血中檢測出1 個miR-888 陽性微滴、在陰道分泌液中檢測出1 個miR-891a 陽性微滴從而出現假陽性。因此，使用該體系時，初始總RNA 的質量至少需要0.1 ng。

圖2 雙重ddPCR 檢測體系的靈敏度檢測結果Fig.2 Sensitivity test results of duplex ddPCR detection system

2.5 重復性檢測

以4 種稀釋倍數的標準品核酸為模板，使用雙重ddPCR 檢測miR-888 和miR-891a，計算得到miR-888的批內變異系數分別為1.86%、2.12%、5.60%和10.72%，miR-891a的批內變異系數分別為1.56%、0.71%、1.17%和2.03%（表4）；miR-888的批間變異系數分別為2.27%、1.03%、2.39%和3.91%，miR-891a 的批間變異系數分別為1.78%、0.78%、6.90%和6.98%。4 種稀釋倍數下的批內和批間變異系數均小于15%。

表4 4 種稀釋倍數下標準品的拷貝濃度Tab.4 Copy concentrations of standard substances at 4 dilutions（n=3，±s，copies·μL-1）

表4 4 種稀釋倍數下標準品的拷貝濃度Tab.4 Copy concentrations of standard substances at 4 dilutions（n=3，±s，copies·μL-1）

2.6 精液與其他常見體液表達的差異性分析

本研究對5種體液共75份樣本進行了雙重ddPCR檢測，結果見表5。將精液分別與外周血、月經血、唾液、陰道分泌液中miR-888 和miR-891a 的檢測結果進行Mann-WhitneyU檢驗，miR-888 和miR-891a 在精液中的表達量高于其他體液（P＜0.05）。

表5 5 種體液中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度Tab.5 Copy concentrations of miR-888 and miR-891a in 5 body fluids（±s，copies·μL-1）

表5 5 種體液中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度Tab.5 Copy concentrations of miR-888 and miR-891a in 5 body fluids（±s，copies·μL-1）

注：1）與精液樣本比較，P＜0.05。

2.7 ROC 曲線分析

對精液與非精液樣本中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度進行ROC 曲線分析，結果見圖3。miR-888的AUC 為0.976，最佳截斷值為2.250 copies/μL，此時靈敏度為94.29%，特異性為100%，約登指數為0.943，75 份樣本中有2 份精液樣本被誤判為非精液，判別正確率為97.33%；miR-891a 的AUC 為1.000，最佳截斷值為1.100 copies/μL，此時靈敏度和特異性均為100%，約登指數為1，75 份樣本均被正確判別。

圖3 ROC 曲線分析結果Fig.3 Analysis results of ROC curve

3 討論

一直以來，RT-qPCR 被認為是檢測miRNA 表達量的金標準[16-17]，也是目前基于miRNA 進行體液鑒定的主要檢測方法，但該方法一方面需要科學準確地選擇內參基因進行相對定量分析[11]，或通過已知濃度的標準品制作標準曲線以進行絕對定量；同時，qPCR 針對不同的目標基因需要設計單獨的檢測體系，復合檢測難度較大，無形中限制了其在法醫(yī)學實踐中的廣泛應用。ddPCR 是近些年逐漸發(fā)展成熟的一種可對微量核酸進行絕對定量檢測的方法，其原理是將待測樣品分成數萬個微滴，每個微滴不含或含有至少1 個待檢核酸靶分子，經過獨立PCR 反應后，對微滴進行逐個檢測，最終根據泊松分布原理及陽性微滴比例給出待檢靶分子的拷貝濃度[9-10]。

本研究將ddPCR 技術引入法醫(yī)學體液鑒定領域，克服了miRNA 序列較短，引物和探針的設計較為復雜等技術難點，自行設計TaqMan 探針，分別選擇6-FAM 和HEX 熒光修飾的報告基團用于兩條miRNA探針，建立雙重ddPCR 檢測體系，實現了miRNA 的ddPCR 雙通道檢測，可同時對miR-888 和miR-891a兩種miRNA 進行絕對定量分析，經配對樣本t檢驗，ddPCR 雙重檢測與單獨檢測結果差異無統(tǒng)計學意義，說明雙重ddPCR 檢測結果可信，能夠達到與單獨ddPCR 檢測同樣的準確性。經重復性試驗，批內和批間變異系數均小于15%，說明該體系穩(wěn)定性和重復性良好[18]，檢測結果準確、可靠。探針根據以下原則進行設計：跨越莖環(huán)序列和miRNA 成熟序列連接處且不與正向引物重疊，盡可能增加長度以提高解鏈溫度（melting temperature，Tm）值，同時設計5′報告基團、3′淬滅基團以及3′小溝結合物（minor groove binder，MGB）[19]。與傳統(tǒng)的TaqMan 探針相比，MGB 探針能夠在顯著提高Tm的同時增加特異性，尤其是當錯配發(fā)生在MGB區(qū)域時，單個堿基不匹配就能顯著降低DNA雙鏈的Tm值[20]。這些性質決定了MGB 探針尤其適用于長度較短的核酸（如miRNA）和單堿基突變等研究。

miR-888 最初被定義為附睪特異性表達的miRNA[21]，是一種前列腺分泌液來源的miRNA，具有促進前列腺細胞增殖、遷移和集落形成的功能[22]，miR-891a 的功能和作用研究相對較少，但miR-891a與miR-888 同樣位于人類X 染色體上同一miRNA 集群中，分布穩(wěn)定且集中，具有較強的精液特異性[5-6，23-24]。本研究結果支持以上結論。通過檢測5種體液共75份樣本中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度，經非參數檢驗證實了miR-888 和miR-891a 在精液中的表達量均高于其他常見體液。經ROC分析，miR-888和miR-891a 均具有很高的鑒別精液的能力，且兩者相比，miR-891a 的判別正確率高于miR-888。在本研究使用的75 份樣本中，僅通過miR-891a 的表達情況即可區(qū)分精液與其他體液，且當截斷值定為1.100 copies/μL時，判別正確率可達100%。將miR-888 和miR-891a結合使用，能夠進一步增加結果的可信度，避免檢測單個標記造成的假陽性或假陰性。此外，大多數法醫(yī)學生物檢材為微量降解樣本，因此，靈敏度是評估檢測體系法醫(yī)學實際應用能力的重要指標。經靈敏度檢測，該體系在僅使用0.1 ng 總RNA 時仍然能準確區(qū)分出精液，具有較好的應用前景。有研究[25]表明，ddPCR 在檢測空白樣品時可能會由于檢出1 個陽性微滴而被判定為陽性，未觀察到2 個或更多陽性微滴的存在，本研究支持上述結論。在總RNA 量為10 pg時，該體系在月經血中檢測出1個miR-888陽性微滴、在陰道分泌液中檢測出1 個miR-891a 陽性微滴從而出現假陽性，無法準確鑒別精液。因此，對于只檢出1 個陽性微滴的樣品，應重復多次檢測以進一步驗證和分析[15]。

綜上所述，本研究建立了雙重ddPCR 檢測miR-888 和miR-891a 的方法，能夠實現對精液的準確鑒別。鑒于法醫(yī)實際檢材微量性的特點，雙重ddPCR 檢測可以大大節(jié)省樣品，簡化實驗流程，縮減檢測成本。因此，本研究建立的雙重ddPCR 檢測體系有望在法醫(yī)實際案件中進行推廣和應用。