賈宇晴，王天琦，趙銳，朱寶利，曹志鵬

1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室 遼寧省法醫(yī)學(xué)生物證據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，遼寧 沈陽 110122；2.遼寧大學(xué)司法鑒定中心，遼寧 沈陽 110031；3.德國海德堡大學(xué)法醫(yī)學(xué)與交通醫(yī)學(xué)研究所，德國 海德堡 69115

利用死后血清中尿素、肌酐水平評估生前氮質(zhì)血癥狀態(tài)及其嚴(yán)重程度，在急、慢性腎功能衰竭，致命性高（低）溫?fù)p傷，高滲性脫水等死因診斷中具有重要的輔助診斷價值[1-3]。研究[4]表明，體液中尿素、肌酐水平在死后早期相對穩(wěn)定，受死后變化影響較小。然而在我國，由于尸體多以冷凍方式儲存，在死后早期經(jīng)緩凍的尸體會發(fā)生嚴(yán)重的溶血[5-6]。目前，包括尿素及肌酐在內(nèi)的絕大多數(shù)生物化學(xué)指標(biāo)主要依賴生物化學(xué)方法檢測，樣本溶血是干擾其檢測最重要的原因[7-8]。因此，降低溶血對死后生物化學(xué)檢測的干擾是目前亟待解決的問題。

為降低溶血對血液樣本中尿素檢測的干擾，本課題組在前期研究[5]中采用超濾技術(shù)截留溶血樣本中血紅蛋白等大分子物質(zhì)，有效降低了溶血對尿素檢測的干擾。超濾是利用超濾膜表面的微細(xì)孔徑截獲流體（溶血樣本）內(nèi)一定分子量的物質(zhì)，從而達(dá)到去除或截留流體中目標(biāo)物質(zhì)的目的[9]。由于其操作簡便、高效、低成本等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于血液透析、水質(zhì)凈化、生物制藥等諸多領(lǐng)域[9-10]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，探討死后溶血對血液樣本中肌酐檢測的影響以及超濾處理是否可降低其干擾。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及納入標(biāo)準(zhǔn)

血液樣本收集于中國醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心2018 年9 月—2019 年3 月受理并進(jìn)行系統(tǒng)尸體檢驗(yàn)的案例，共33例。在尸體檢驗(yàn)過程中利用無菌注射器從左心室抽取全血樣本，每例15 mL。為保證血液未發(fā)生溶血，納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）尸體未經(jīng)冷凍保存；（2）死后48 h 內(nèi)進(jìn)行尸體解剖[4]；（3）在滿足第1、2 項(xiàng)要求的基礎(chǔ)上所提取的左心血液經(jīng)離心后可分離出無肉眼可見溶血的血清。

本研究已獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 多梯度溶血樣本的制備

每例全血樣本中抽取5 mL 立即以4 000×g離心10 min 后收集血清，測定血清中肌酐濃度（即基線肌酐濃度），對于脂血樣本（血清明顯脂濁），將血清進(jìn)行高速離心可降低血液中脂質(zhì)成分對生物化學(xué)檢測的干擾[11-12]。其余10 mL 用于制備多梯度溶血樣本。

8 例全血樣本分別抽取其10%～20%體積的血液，5 例全血樣本分別抽取其40%～60%體積的血液，經(jīng)反復(fù)凍融3 次（-20 ℃冷凍、4 ℃解凍）后，注入原全血樣本，輕柔混合后以4 000×g離心10 min，取上層溶血血清。另外20 例全血樣本直接進(jìn)行反復(fù)凍融3 次（-20 ℃冷凍、4 ℃解凍）后-20 ℃冷凍保存待用。檢測上述人工溶血樣本中的血紅蛋白質(zhì)量濃度，并據(jù)其將33 例溶血樣本分為H1～H4 4 個梯度：H1，＜50 g/L（n=8）；H2，50～＜100 g/L（n=9）；H3，100～＜150 g/L（n=6）；H4，≥150 g/L（n=10）。對制備的33 例溶血樣本各取250 μL 檢測其肌酐濃度，其余部分進(jìn)行超濾處理。

1.3 超濾處理

方案1：從人工溶血樣本中取1 mL注入Centrifree?超濾管（膜孔徑為30 000 NMWCO，美國Merck 公司）中，固定角轉(zhuǎn)子離心（2 000×g，30 min）后收集超濾液。當(dāng)超濾液足夠250 μL 時，檢測其肌酐濃度；若不足250 μL，棄用，采用方案2 進(jìn)行超濾處理。

方案2：利用無菌注射器取3～5 mL 溶血樣本經(jīng)MicroKros?中空纖維超濾組件（美國Spectrum Laboratories 公司）進(jìn)行超濾，膜孔徑為50 000 NMWCO，膜面積為20 cm2。收集約500 μL 初步超濾液，將其轉(zhuǎn)移至Amicon Ultra-0.5超濾管（膜孔徑為30 000 NMWCO，美國Merck 公司）中，固定角轉(zhuǎn)子離心（14 000×g，10 min）后收集超濾液并檢測其肌酐濃度。

1.4 生物化學(xué)檢測

血紅蛋白質(zhì)量濃度采用文齊氏液（氰化法測定，天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所）使用UV-1800紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）進(jìn)行檢測。肌酐濃度采用肌酐測定試劑盒（改良JAFF 法，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）使用MOL-300 全自動生化分析儀（上海艾諾電子有限公司）進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

本研究以人工溶血前血清中的肌酐濃度作為基線肌酐濃度，溶血樣本、超濾液中肌酐濃度偏離基線肌酐濃度的程度［偏倚（B）］作為所受干擾的評價指標(biāo)。B的計(jì)算公式如下：

式中，C溶血樣本或超濾液表示溶血樣本或超濾液中的肌酐濃度，C血清表示基線肌酐濃度。

使用SPSS 26.0 軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及ROC 曲線作圖，使用GraphPad Prism 8.02 軟件（美國GraphPad Software 公司）進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 溶血樣本超濾方案的選擇

溶血樣本的顏色隨血紅蛋白質(zhì)量濃度的增高逐漸由透明的淡紅色變成暗紅色。經(jīng)超濾后，其超濾液均為無色透明的溶液。

33 例中，經(jīng)方案1 超濾后，13 例溶血樣本［血紅蛋白質(zhì)量濃度為（41.15±33.53）g/L］獲得了足夠進(jìn)行生物化學(xué)檢測的超濾液；20 例溶血樣本［血紅蛋白質(zhì)量濃度為（143.87±52.14）g/L］的超濾液不足250 μL，采用方案2 進(jìn)行超濾處理后獲得了足夠進(jìn)行生物化學(xué)檢測的超濾液。

2.2 溶血樣本在超濾前后肌酐檢測的偏倚

表1 總結(jié)了H1～H4 各組基線肌酐濃度、溶血樣本中血紅蛋白質(zhì)量濃度、溶血樣本經(jīng)超濾前后的肌酐濃度及其偏倚情況。隨著溶血樣本中血紅蛋白質(zhì)量濃度的增高，其偏倚逐漸增大，最高為589.06%（r=0.84，P＜0.05），經(jīng)超濾后偏倚最高為32.14%，其余樣本在±30%內(nèi)。H1 和H2 組因溶血程度相對較低，超濾前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），溶血程度較高的H3和H4 組在超濾后所受干擾降低（P＜0.05）。

表1 各組溶血樣本的血紅蛋白質(zhì)量濃度、超濾前后的肌酐濃度及其偏倚Tab.1 The hemoglobin mass concentration，creatinine concentration and the bias（B）before and after ultrafiltration in the hemolyzed samples of different groups

2.3 溶血樣本超濾前后肌酐濃度與基線肌酐濃度間的相關(guān)性

隨著溶血程度的增加，溶血樣本的偏倚逐漸增大，經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，溶血樣本肌酐濃度與基線肌酐濃度間的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.472 7，r=0.129 5），超濾處理后所受溶血干擾程度降低且較集中，超濾液中肌酐濃度與基線肌酐濃度間呈正相關(guān)（P＜0.05，r=0.918 2），詳見圖1。

圖1 溶血樣本超濾前后肌酐濃度與基線肌酐濃度間的相關(guān)性Fig.1 Correlation between creatinine concentrations before and after ultrafiltration in hemolyzed samples and baseline creatinine concentrations

2.4 溶血樣本超濾前后其肌酐濃度診斷價值的初步評估

33 例溶血樣本中，3 例（H2、H3、H4 組各1 例）的基線肌酐濃度（245.48～392.43 μmol/L）高于221.03 μmol/L[13]；9 例在超濾前肌酐濃度（225.98～722.34 μmol/L）高于221.03 μmol/L，其中7例為假陽性，均分布在H3和H4 組中，H4 組出現(xiàn)1 例假陰性樣本（基線肌酐濃度為245.48 μmol/L，溶血樣本肌酐濃度為176.92 μmol/L）。

超濾后，超濾液中未觀察到假陽性樣本，H4 組出現(xiàn)1 例假陰性樣本（與溶血樣本中的假陰性案例為同一案例，超濾液中肌酐濃度為181.94 μmol/L）。ROC分析結(jié)果（圖2）顯示：溶血樣本的AUC 為0.78，P=0.117 5；超濾液的AUC 為0.99，P=0.005 9。

圖2 溶血樣本超濾前后的ROC 曲線Fig.2 ROC curves of hemolyzed samples before and after ultrafiltration

3 討論

血液中肌酐濃度已被證實(shí)在死后早期相對穩(wěn)定，在急、慢性腎功能衰竭，致命性高（低）溫?fù)p傷，高滲性脫水等涉及氮質(zhì)血癥的死因分析中可作為可靠的生物化學(xué)參考指標(biāo)[1-4，14-18]。尸體其他體液的相關(guān)研究[1，14]發(fā)現(xiàn)，心包液中肌酐濃度與血液相近，玻璃體液、腦脊液等體液中肌酐濃度顯著低于血液，因此，當(dāng)血液樣本不可用時，心包液可謹(jǐn)慎用于替代血液進(jìn)行肌酐檢測。由于我國尸體常選擇冷凍保存，使得心包液易受溶血影響，且目前尚無心包液中肌酐的死后參考值范圍，故較難用于實(shí)際鑒定。同時，大部分機(jī)構(gòu)以血液為常規(guī)采集的體液樣本，基于上述原因，本研究以血液作為受試對象。

溶血樣本中的血紅蛋白可干擾大部分依靠光電比色法原理進(jìn)行檢測的生物化學(xué)指標(biāo)，盡管臨床上有文獻(xiàn)報道肌酐檢測還受到樣本內(nèi)葡萄糖及膽紅素等物質(zhì)的干擾，但對于死后生物化學(xué)檢測而言，溶血樣本中高質(zhì)量濃度的血紅蛋白是最主要的干擾物質(zhì)[7-8]。

本課題組前期研究[5]結(jié)果表明，嚴(yán)重溶血的血液樣本無法用于尿素的死后檢測。本研究也顯示出類似的結(jié)果：隨著溶血樣本中血紅蛋白質(zhì)量濃度的增加，溶血樣本中肌酐所受干擾也逐漸增加，偏倚最高可達(dá)589.06%，因偏倚波動較大，故與基線肌酐濃度間的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.472 7，r=0.129 5），因此也難以利用回歸分析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)校正。

本研究所使用的超濾管及中空纖維超濾組件為市售的常見超濾耗材，適用于小體積流體樣本且成本低廉。在33 例溶血樣品中，有13 例血紅蛋白質(zhì)量濃度相對較低［（41.15±33.53）g/L］的樣本僅利用30 000 NMWCO 超濾管即可獲得足夠的超濾液進(jìn)行檢測（＞250 μL）；20 例溶血樣本因血紅蛋白質(zhì)量濃度較高［（143.87±52.14）g/L］，利用上述超濾方案無法獲得足夠的超濾液進(jìn)行檢測，因此，采用較大孔徑（50 000 NMWCO）的中空纖維超濾組件去除部分血紅蛋白后，再利用30 000 NMWCO 超濾管離心，獲得足夠的超濾液進(jìn)行生物化學(xué)檢測。溶血樣本經(jīng)超濾處理后，超濾液為無色透明的溶液，分子量約65 000 的血紅蛋白被完全濾除。因H1、H2 組溶血程度相對較低，超濾前后偏倚差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。溶血程度較高的H3、H4 組經(jīng)超濾后偏倚顯著降低，同時，因超濾液與基線肌酐濃度間呈正相關(guān)（P＜0.05，r=0.918 2），為進(jìn)一步建立溶血樣本中肌酐濃度的回歸方程提供了可行的前處理方案。在診斷價值上，因受溶血的干擾，溶血樣本中的肌酐濃度常顯著高于其真實(shí)濃度，導(dǎo)致易出現(xiàn)假陽性（7/33），缺乏診斷價值（P=0.117 5）。超濾液中未出現(xiàn)假陽性樣本，ROC 分析初步顯示其可能具有良好的診斷價值，但受樣本量限制，本研究尚無法界定診斷閾值。在H4 組中存在同一案例在超濾前后均為假陰性，考慮可能由于本例的基線肌酐濃度（245.48 μmol/L）較為接近閾值（221.03 μmol/L[13]）所致。臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)具備完整的質(zhì)量保證及控制體系，受限于死后尸體樣本的特殊性，直接套用臨床標(biāo)準(zhǔn)則過于苛刻且不利于實(shí)際工作，因此，建立針對死后樣本的檢驗(yàn)質(zhì)量控制體系、診斷標(biāo)準(zhǔn)等也是今后進(jìn)一步研究的方向之一[19]。

本研究亦存在較多局限。在方法學(xué)方面，受樣本量限制，本研究僅初步探究了血紅蛋白被濾除后是否能夠降低其對肌酐檢測的干擾，尚未就兩種超濾方案的差異進(jìn)行更深入的探討。在診斷性能方面，超濾液中肌酐濃度診斷腎功能損傷的閾值及其敏感性及特異性在本研究中尚無法確定，因此，直接利用超濾液中肌酐濃度進(jìn)行輔助死因診斷的具體參考范圍等仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，血液樣本溶血將嚴(yán)重干擾肌酐的死后檢測，經(jīng)超濾處理后可顯著降低其偏倚，且與溶血前血清間呈正相關(guān)。本研究為進(jìn)一步建立溶血樣本中肌酐檢測值的回歸方程以及確定超濾液中肌酐的診斷閾值等提供了初步研究基礎(chǔ)，也為超濾液中全系列多生物化學(xué)指標(biāo)同時分析提供了一種可行的預(yù)處理方法。