葉梅榮，王曉鵬，黃守程

(安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

【研究意義】馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)屬于馬齒莧科(Portulacaceae)馬齒莧屬(Portulaca)類(lèi)野生藥食同源植物，除寒冷帶地區(qū)外，世界各地均有分布，具有食用和藥用的功效，是世界最普通的野生植物之一[1]。馬齒莧營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2-3]，且具有抗菌、抗炎的功能，對(duì)胃癌、肝癌、糖尿病等具有一定的療效[4-5]；其對(duì)外界的高溫、干旱、高濕、高鹽、重金屬污染等不良環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)大[6-7]，但不耐低溫，低溫是限制馬齒莧生長(zhǎng)發(fā)育和地理分布的主要環(huán)境因素，因此鑒于其不耐低溫，擬通過(guò)二代和三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究馬齒莧在低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，以期為馬齒莧低溫脅迫研究及培育馬齒莧耐低溫品種研究等提供參考依據(jù)。低溫脅迫一般出現(xiàn)在早春、晚秋和冬季，低溫脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和地理分布最主要的自然因子之一[8]。低溫脅迫下，植物生理代謝功能受阻，如光合作用下降，呼吸作用先升后降，生物分解大于生物合成而造成物質(zhì)代謝失調(diào)，植物吸水小于失水而造成的水分代謝失衡，膜系統(tǒng)受到破壞，透性增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲，從而造成植物永久性傷害，甚至死亡。因此，探討植物在低溫脅迫下的生理及分子機(jī)制對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)非常重要，有助于耐寒植物品種的培育，從而增加植物的種植面積，有利提高作物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已從轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組及轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控等不同層面研究植物低溫脅迫的分子機(jī)制[8]。如二代和三代的高通量測(cè)序技術(shù)，使得基因組的研究得到了空前發(fā)展；而二代、三代的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為所有物種的轉(zhuǎn)錄組研究提供了可能[9]。如張少平等[10]利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析馬齒莧根莖葉中類(lèi)黃酮代謝，張鶴等[11]分析了低溫脅迫下花生(ArachishypogaeaL.)幼苗的轉(zhuǎn)錄組；齊曉等[12]鑒定了紫花苜蓿(Medicagosativa)響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，并且發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫誘導(dǎo)下不同轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達(dá)存在差異；白雪等[13]分析了低溫條件下蓖麻(RicinuscommunisL.)種子萌發(fā)期轉(zhuǎn)錄組。田玉珍等[14]分析了蘋(píng)果(Malusdomestica)樹(shù)體休眠期前花芽對(duì)低溫早期響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組，揭示了Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能主要參與了蘋(píng)果花芽的冷響應(yīng)過(guò)程。目前三代Isoform sequencing(Iso-Seq)技術(shù)在無(wú)需參考基因組情況下，可獲得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，極有利深入揭示生物體的轉(zhuǎn)錄機(jī)制[15-16]。如Kuang等[17]用Iso-Seq技術(shù)分析東北紅豆杉(Taxuscuspidata)的轉(zhuǎn)錄基因組揭示了紫杉醇生物合成的復(fù)雜性；Minio等[18]基于Iso-Seq技術(shù)分析葡萄(CabernetSauvignon)漿果發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)馬齒莧的研究主要集中在栽培、抗性(如抗旱性、抗鹽性和抗?jié)承缘?、食用和藥用價(jià)值等方面，對(duì)其不耐低溫脅迫機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究從其轉(zhuǎn)錄組方面探討低溫脅迫對(duì)馬齒莧生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用二代和三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析馬齒莧在低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，篩選差異表達(dá)基因，闡釋低溫脅迫對(duì)馬齒莧生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)制，以期為馬齒莧耐低溫品種篩選和培育提供參考依據(jù)，也為馬齒莧的栽培種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

馬齒莧種子種在花盆里(盆高14 cm，下口直徑11 cm，上口直徑23 cm)，通用型中禾營(yíng)養(yǎng)土作為種植基質(zhì)。馬齒莧培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱里，白天溫度設(shè)置為30 ℃、14 h，晚上為25 ℃、10 h。種子萌發(fā)后，每盆只保留5株苗，待苗高度長(zhǎng)至5 cm 左右，進(jìn)行低溫處理(縮寫(xiě)為L(zhǎng)TS，白天10 ℃、14 h，晚上5 ℃、10 h)，適溫處理(縮寫(xiě)為C，白天30 ℃、14 h，晚上25 ℃、10 h)，處理14 d后，取馬齒莧的成熟葉片裝在封口塑料袋子里立即投入液氮里速凍，然后埋在干冰里速運(yùn)到武漢貝納科技服務(wù)有限公司進(jìn)行三代和二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。

1.2 總RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

首先提取馬齒莧樣本高質(zhì)量的RNA，RNA的大小和降解程度用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RNA的純度和濃度用NanoDrop ND-1000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，RNA的完整性采用Agilent2100 生物分析儀精確檢測(cè)，高通量測(cè)序用Illumina HiSeq 2500 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw data)經(jīng)過(guò)過(guò)濾得到clean reads，基于目前馬齒莧沒(méi)有參考轉(zhuǎn)錄基因組，因此用三代測(cè)序得到的全長(zhǎng)非嵌合的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)CD-HIT去冗余后獲得的isoform 作為參考系列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果用RSEM進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)≥1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選有效表達(dá)基因，以qvalue<0.05，|log2FoldChange|>1為標(biāo)準(zhǔn)，利用DEGseq 軟件篩選差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes，DEGs)。所有數(shù)據(jù)已上傳NCBI(BioProject：PRJNA734447)。

1.4 差異表達(dá)基因GO分析和KEGG分析

GO富集分析根據(jù)Gene Ontology 進(jìn)行，Pathway 富集分析根據(jù)KEGG 公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

從表1可知，9個(gè)樣本獲得的clean reads在39 097 730～56 767 358，樣本產(chǎn)生的clean bases在5864 659 500～8515 103 700 bp，最少產(chǎn)生5.86 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，GC比在46.82%～48.21%，Q20 堿基百分比在97.58%～97.85%，Q30堿基百分比在93.04%～93.75%。以上數(shù)據(jù)顯示樣本的測(cè)序質(zhì)量和文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量都比較好，能用于后續(xù)分析。

表1 低溫脅迫下馬齒莧葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列比對(duì)

以全長(zhǎng)非嵌合的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過(guò)CD-HIT去冗余后得到的isoform作為參考序列，用Bowtie2軟件將二代高通量測(cè)序數(shù)據(jù)與上述參考序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表2，只有唯一比對(duì)位點(diǎn)的reads、有多個(gè)比對(duì)位點(diǎn)的reads和未比對(duì)上的reads占總reads的比值分別為6.71%～9.15%、73.98%～80.24%和12.45%～16.88%。有多個(gè)比對(duì)位點(diǎn)的reads占比較高，因此二代測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

表2 二代數(shù)據(jù)比對(duì)到三代參考序列的結(jié)果

表3 重復(fù)處理間的相關(guān)性系數(shù)分析

2.3 基因表達(dá)量及差異表達(dá)基因分析

除對(duì)照C3在1C，其次是110的基因數(shù)量最少，并且在這區(qū)域轉(zhuǎn)錄本數(shù)目C>LTS(圖1)。轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的箱線(xiàn)圖(圖2)，不僅顯示各個(gè)樣品轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的離散程度，而且比較不同樣品的整體轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平，不同處理的轉(zhuǎn)錄本整體離散程度基本一致。

圖1 對(duì)照和冷脅迫處理下馬齒莧的基因表達(dá)量分布 Fig.1 Distribution of gene expression of P.oleracea under control and low temperature stress treatment

圖2 對(duì)照和冷脅迫處理下馬齒莧的FPKM箱線(xiàn)圖Fig.2 The diagram of FPKM of P.oleracea under control and low temperature stress treatment

2.4 樣品相關(guān)性

重復(fù)處理間樣品相關(guān)程度的分析可以揭示重復(fù)處理間樣品的相關(guān)度，從表3可看出,重復(fù)處理間的皮爾遜(Person)相關(guān)系數(shù)都大于0.8，揭示每種處理間3次重復(fù)的相關(guān)性較強(qiáng)，而不同處理間的相關(guān)度都小于0.8，暗示相關(guān)性不強(qiáng)。

2.5 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的篩選

差異表達(dá)基因(DEGs)用軟件DESeq2篩選，上調(diào)差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是qvalue<0.05，且log2FoldChange>1，而下調(diào)差異表達(dá)基因則是qvalue<0.05，且log2FoldChange<-1。不同處理前后的差異基因分布可以用差異基因火山圖來(lái)表示(圖3)，其中用紅色代表顯著上調(diào)的基因，以綠色代表顯著下調(diào)的基因，以黑色代表無(wú)顯著性差異的基因。結(jié)果表明C vs LTS之間有26 621個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括上調(diào)12 045個(gè)DEGs，下調(diào)14 576個(gè)DEGs。

圖3 對(duì)照相對(duì)低溫脅迫處理的馬齒莧火山圖 Fig.3 Volcano map of P.oleracea under control compared to low temperature stress treatment

2.6 馬齒莧響應(yīng)低溫脅迫差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

根據(jù)qvalue值大小列出前20個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目(表4)。馬齒莧對(duì)紫外光A、高光強(qiáng)、遠(yuǎn)紅光、紅光、藍(lán)光、紫外光B、葉綠素生物合成過(guò)程和光保護(hù)等基因的調(diào)節(jié)，其上調(diào)的基因數(shù)目顯著大于下調(diào)的基因數(shù)目；而對(duì)丙酮酸磷酸雙激酶活性、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)碳水化合物代謝過(guò)程和光系統(tǒng)反應(yīng)中心I等方面的基因，其下調(diào)基因數(shù)目明顯大于上調(diào)基因數(shù)目。C vs LTS差異表達(dá)基因的KEGG富集表現(xiàn)在蛋白酶體、DNA復(fù)制、真核生物的核糖體起源、晝夜節(jié)律、玉米素生物合成、氰基氨基酸代謝、萜類(lèi)主鏈生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成等方面。

表4 DEGs的GO富集分析

圖4 對(duì)照和冷脅迫相比差異表達(dá)基因KEGG富集Fig.4 KEGG enrichment of DEGs in control compared to low temperature stress treatment

3 討 論

低溫脅迫嚴(yán)重影響了植物生長(zhǎng)、發(fā)育和分布，因此研究低溫脅迫下植物的適應(yīng)性機(jī)制對(duì)提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義?，F(xiàn)在高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為低溫脅迫分子機(jī)制的研究提供了途徑和方法。如對(duì)低溫脅迫下百香果(PassifloraeduliaSims)[19]、高加索三葉草(TrifoliumambiguumBieb.)[20]、早熟禾(Poapratensis)[21]、苦瓜(MomordicacharantiaL．)[22]、仁用杏花(PrunusarmeniacaL.)[23]和黃花蒿(Artemisiaannua)[24]等轉(zhuǎn)錄基因組的研究，揭示了低溫脅迫下顯著存在差異基因表達(dá)，一些代謝途徑如淀粉和蔗糖合成途徑、激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等參與低溫脅迫響應(yīng)，且揭示了一些響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子如AP2/ERF、ZFP、MYB等。這些說(shuō)明植物在低溫脅迫下能誘導(dǎo)一些基因表達(dá)，產(chǎn)生生理代謝變化，從而提高植物的抗冷和抗寒性。本研究發(fā)現(xiàn)C vs LTS相比馬齒莧對(duì)不同光反應(yīng)、葉綠素生物合成、光保護(hù)、蘇氨酸類(lèi)肽鏈內(nèi)切酶活性、幾丁質(zhì)反應(yīng)等上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目明顯高于下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目；而對(duì)丙酮酸磷酸二激酶活性、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞質(zhì)大核糖體亞基、調(diào)節(jié)碳水化合物代謝過(guò)程、光系統(tǒng)反應(yīng)中心Ⅰ等上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目明顯低于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目。馬齒莧為C4植物，低溫脅迫下，GO分析顯示其明顯下調(diào)了對(duì)不同光的反應(yīng)和葉綠素的生物合成的基因數(shù)目，但是反而明顯上調(diào)了丙酮酸磷酸二激酶活性、調(diào)節(jié)碳水化合物代謝過(guò)程和光系統(tǒng)反應(yīng)中心Ⅰ等基因數(shù)目，這似乎很矛盾，可能也正好說(shuō)明馬齒莧抗逆性強(qiáng)的原因，因?yàn)楸崃姿岫っ甘谴龠M(jìn)C4植物的光合碳循環(huán)CO2底物磷酸烯醇式丙酮酸再生的酶，該酶基因被上調(diào)，說(shuō)明底物再生可能被增加，即光合作用明顯升高，能有效合成光合產(chǎn)物供其生長(zhǎng)；但因?qū)Ω鞣N光反應(yīng)、葉綠素合成等基因數(shù)目明顯被下調(diào)，可能造成光吸收的減少和葉綠素合成的下降，可能長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致馬齒莧光合能力下降，即低溫脅迫明顯影響馬齒莧的光合作用。而低溫脅迫下，馬齒莧的莖桿變成紫紅色，這可能因?yàn)轳R齒莧通過(guò)積累可溶性糖進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)來(lái)抵御低溫脅迫，從而增加了花色素苷的合成，這樣可能有利提高對(duì)低溫脅迫的耐性，這些有待進(jìn)一步將轉(zhuǎn)錄組和代謝組結(jié)合起來(lái)進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)是生命功能的體現(xiàn)者，而植物遭受干旱、低溫等非生物逆境脅迫時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物受到傷害和各種異常蛋白質(zhì)的積累，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，細(xì)胞的各種代謝功能和生長(zhǎng)發(fā)育受到影響。付晨熙等[25]研究認(rèn)為相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生變化是植物對(duì)逆境的防御機(jī)制。而蛋白酶體，尤其植物體內(nèi)的泛素/26S蛋白酶體降解途徑，能介導(dǎo)植物中80%～85%的蛋白質(zhì)降解，能有效清除異常蛋白質(zhì)，對(duì)維護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性具有重要的作用，因此其成為植物調(diào)控非生物脅迫的一種重要途徑[26]。烏鳳章和王賀新[27]認(rèn)為蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)了植物低溫脅迫反應(yīng)，并認(rèn)為在低溫脅迫下導(dǎo)致不同物種產(chǎn)生了重大的轉(zhuǎn)錄組重新編程，參與植物低溫脅迫反應(yīng)調(diào)節(jié)的是泛素連接酶(Ubiquitin-ligase enzymes，E3)；王爽和李海英[28]認(rèn)為E3泛素連接酶可以響應(yīng)不同的脅迫反應(yīng)(如干旱、鹽脅迫、冷脅迫)，但調(diào)控方式并不相同。本研究發(fā)現(xiàn)C vs LTS相比KEGG顯著富集蛋白酶體差異表達(dá)基因，富集的蛋白酶體差異表達(dá)基因是否和蛋白質(zhì)降解有關(guān)？另外也發(fā)現(xiàn)顯著富集萜類(lèi)及帶苯環(huán)的氨基酸的生物合成，暗示適溫情況下馬齒莧的次生代謝明顯，這些有待進(jìn)一步研究。本研究探討了低溫脅迫下馬齒莧差異表達(dá)基因的差異，為培育耐冷性馬齒莧品種提供參考，也為低溫脅迫下馬齒莧抗逆性的分子機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

采用二代和三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Φ蜏孛{迫下野生馬齒莧轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫和適溫相比共有26 621個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中上調(diào)的DEGs為12 045個(gè)，下調(diào)的DEGs為14 576個(gè)。適溫和低溫脅迫相比導(dǎo)致馬齒莧雖明顯上調(diào)了對(duì)各種光反應(yīng)的基因數(shù)目，但顯著下調(diào)了丙酮酸磷酸二激酶的活性的基因數(shù)目，暗示低溫脅迫可能明顯影響了馬齒莧的光合作用。