滕庭庭， 梁繼東

（西安交通大學 人居環(huán)境與建筑工程學院，西安 710049）

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一種廣泛存在于自然環(huán)境中的持久性污染物，主要來源于有機質(zhì)的不完全燃燒或石化燃料的燃燒[1]。其中，火山和野火排出的氣體是PAHs的主要自然來源，汽車、焦化廠和工業(yè)生產(chǎn)活動中的化石燃料燃燒是環(huán)境中PAHs 的主要人為來源。此外，PAHs 還可以在土壤復雜有機分子的緩慢轉(zhuǎn)化過程中形成[2]，或在工業(yè)熱處理過程中形成，因而石油、天然氣和沼氣中都富含PAHs[3]。

PAHs 由2 個或2 個以上的芳香環(huán)組成，呈線狀、角狀或簇狀結(jié)構(gòu)。一般來說，小于4 個環(huán)的低分子量PAHs(low molecular weight PAHs，LMWPAHs)比4 環(huán)及4 環(huán)以上的高分子量PAHs(high molecular weight PAHs，HMW-PAHs)更容易降解，HMW-PAHs 尤其難以被生物降解[4]。人類可通過攝入、吸入或皮膚吸附等不同方式接觸PAHs污染，攝入受污染的食物是主要途徑[5-7]。環(huán)境中存在100 多種PAHs，美國環(huán)境保護署(United State Environmental Protection Agency，USEPA)根據(jù)其毒性、易接觸性和在污染場所的持久性列出了16 種優(yōu)先控制的PAHs[8]。高效快速、環(huán)境友好的去除土壤中的PAHs 是當前亟待研究的重要課題。

微生物修復技術(shù)是一種環(huán)境友好且行之有效的PAHs 污染治理技術(shù)。常用的微生物修復策略包括自然衰減(nature attenuation，NA)、生物刺激(biostimulation，BS)和生物強化(bioaugmentation，BA)。NA 是一種依靠自然環(huán)境中存在的土著微生物的生物降解與轉(zhuǎn)化來去除PAHs 的方法。BS 是向污染場地添加某種化學物質(zhì)(如N、P 營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及其他生物促進劑等)，來促進天然存在的具有污染物降解能力的微生物的活性提升，以加速PAHs 去除。BA 是將通過人工分離獲得的PAHs降解功能菌或基因工程菌援引入受污染的土壤中，以加速PAHs 的去除[5]。近年來，隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們對環(huán)境中具有PAHs 降解功能微生物的認知激增，為BA 技術(shù)的發(fā)展和應用奠定了豐富的微生物資源基礎(chǔ)。本文主要從PAHs 降解功能微生物發(fā)掘和BA 技術(shù)發(fā)展2 個方面綜述相關(guān)技術(shù)研究進展，以期為該技術(shù)的進一步深化探索提供較為全面的參考。

1 PAHs 降解功能菌的識別

適宜的PAHs 降解功能菌的識別、分離和鑒定，以及它們援引入目標修復場地環(huán)境后的生長繁殖和代謝活性維續(xù)，是BA 技術(shù)得以成功實施的關(guān)鍵。在BA 的應用中，從目標污染物本土環(huán)境中分離功能微生物當為首選，因為其對修復場所生境的適應能力更強，可確保其良好的生存和繁衍[6]。因此，從污染環(huán)境中發(fā)掘PAHs 降解功能微生物資源尤為重要。

1.1 富集培養(yǎng)法篩選功能菌

在過去的100 年里，通過富集培養(yǎng)法[7]來尋找用于BA 的微生物菌株是微生物資源獲取的典型技術(shù)手段。該技術(shù)利用目標污染物作為唯一的碳源，從自然界篩選具備能夠利用污染物生存的菌株，依據(jù)其相對于背景群落的生長優(yōu)勢逐步富集，再進行分離和純化，最終獲得能夠降解目標污染物的功能菌株，如圖1所示。

然而，通過該技術(shù)篩選出來的功能菌可能不是目標生境中的的優(yōu)勢種群，其在實際環(huán)境中的競爭性和有效性可能與實驗室的研究結(jié)果脫離，比如環(huán)境脅迫因子(如水分、營養(yǎng)物質(zhì)、氧化還原、pH 和滲透因子)及土著微生物種群競爭等均對外援菌的修復功能構(gòu)成挑戰(zhàn)[8]。一般認為，正是最初的篩菌條件，特別是對源群落以及目標生境的組成和種群動態(tài)(潛在的競爭者)的了解不足，導致了許多BA的失敗。

優(yōu)先考慮采用從目標污染環(huán)境樣本中篩選出來的具有PAHs 降解能力的土著菌，可能會增加BA 過程外援菌的持久性和代謝活性。也就是說從同一個經(jīng)過時空演變形成的群落中篩選出來的菌株，當重新將其引入到原始生境中，其更有可能持續(xù)存活，而不是短暫的存留。研究表明，篩選土著功能菌有助于接種菌的存續(xù)。Belotte 等[9]采用相同的培養(yǎng)方法從森林土壤的不同生態(tài)位分離出多株功能菌，當把它們重新引入到森林土壤后，它們各自更傾向于在自己的發(fā)源地富集。Belotte 等預測結(jié)果表明，當重新引入到它們的發(fā)源地時，分離株的適者生存能力為50%，且適者生存能力隨離發(fā)源地的距離呈指數(shù)級下降。這為篩選土著微生物強化修復當?shù)匚廴镜沫h(huán)境適應性提供了強有力的證據(jù)。以典型的代表性PAHs 化合物“芘”為例，通過富集培養(yǎng)法獲得的芘降解功能菌被廣泛報道，如表1 所示，其中一部分屬于α-變形菌門，它們在生理和代謝方面具有多功能性[10-25]。

表1 富集培養(yǎng)法篩選出的典型PAHs 化合物“芘”的降解菌舉例Tab. 1 Examples of pyrene (a typical PAH compound) degrading bacteria isolated by enrichment culturing method

據(jù)報道，Sphingobium和Sphingomonas都是有效的PAHs 降解菌[10-12]。此外，從韓國蔚山灣地區(qū)的沉積物中分離出的Novosphingobium pentaromativoransUS6-1[13]和從中國黃海沿岸土壤中分離出的ThalassospiraTSL5-1 [14]均被報道為有效的芘降解菌。

β-變形菌門含有超過75 屬400 多種，這些細菌同樣具有多種代謝途徑，并棲息在不同的生態(tài)系統(tǒng)中。大部分的β-變形菌種是異養(yǎng)的，它們的能量來自于有機化合物。β-變形菌的一些伯克霍爾德菌科成員能有效去除芘，如從被石油污染的阿拉伯灣沿岸分離出來的Burkholderia fungorum[15]、從活性污 泥 中 分 離 出 來 的Herbaspirillum chlorophenolicumFA1[16]以及從人工濕地分離出來的Zoogloeasp.TBM-3[17]。

γ-變形菌的成員也是重要的PAHs 降解菌，與其他種類的變形菌一樣，γ-變形菌在代謝方面也高度多樣化。Pseudomonas是典型的PAHs 降解功能菌屬。Ghosh[18]報道說至少7 種Pseudomonas菌可以有效降解芘，包括從活性污泥、油污土壤、廢水、PAHs 污染場地、廢機油等多種環(huán)境介質(zhì)中分離出來的P. fluorescens，P. aeruginosa，P.putida，P. saccharophila，P. stutzeri，P.taiwanensis和P. plecoglossicida， 表 明Pseudomonas廣泛存在分布于不同PAHs 污染的環(huán)境中，其中PseudomonasISTPY2 對芘的降解效率可高達98%[19]。此外，從土耳其伊茲密爾石化工業(yè)工廠水的生物膜中分離出來的Proteus vulgaris4Bi [20]和從受油污染的土壤中分離出的Leclercia adecarboxylatePS4040 [21]也可以有效的降解芘。

一些放線菌門可以產(chǎn)生高質(zhì)量PAHs 降解關(guān)鍵酶，具備PAHs 降解功能[22]。Mycobacterium是放線菌的一個屬，有190 多種被識別。其中，Mycobacterium gilvumCP13 對芘的降解效率超過95%[23]。其他能夠降解PAHs 的放線菌包括來自PAHs 污染土壤的Arthrobacter[24]和從被PAHs 污染的土壤中分離出來的Rhodococcus[25]。

1.2 穩(wěn)定同位素探針技術(shù)（SIP）識別功能微生物

土著微生物對生物修復處理的成功具有重要意義。但是，土壤中99%的微生物不能通過傳統(tǒng)的富集培養(yǎng)法識別[26]，其他未可培養(yǎng)的功能微生物資源尚未得到充分的認識。近年來，分子生物學技術(shù)的發(fā)展突飛猛進，使得人們不依賴于富集培養(yǎng)，便可獲悉原位種群及具備一定功能的微生物。

穩(wěn)定同位素探針(stable isotope probing，SIP)是原位識別功能微生物的典型技術(shù)。SIP 技術(shù)是通過穩(wěn)定的原子同位素(例如，13C、15N、18O)標記目標污染物，再獲取能夠分解這些污染物合成自身生命體的微生物標記物(如PLFA、DNA、RNA)，進而識別這些功能微生物的技術(shù)方法。SIP 是一種不依賴于純培養(yǎng)的技術(shù)，填補了將環(huán)境微生物增殖與特定代謝功能直接聯(lián)系起來的技術(shù)空白[27]。根據(jù)微生物標記物的不同，SIP 技術(shù)包括PLFA-SIP、DNA-SIP 和RNA-SIP 等。以13C 標記為例，DNA/RNA-SIP 技術(shù)的基本操作過程如圖2 所示。

圖2 DNA/RNA-SIP 示意圖Fig. 2 Schematic diagram of DNA/RNA-SIP

加一定量的穩(wěn)定同位素標記的污染物到環(huán)境樣品中培養(yǎng)，環(huán)境樣品中具有代謝目標污染物活性的生物被標記，形成13C-DNA 和13C-RNA 等，體系中污染物的含量降低，相應地DNA/RNA 中被同位素標記的C 比例增加。培養(yǎng)一段時間后，將樣本中的DNA/RNA 提取出來，進行密度梯度離心，根據(jù)13C-DNA/RNA 和12C-DNA/RNA 在密度梯度離心溶液中的浮力密度不同，將13C-DNA/RNA 和12C-DNA/RNA 分離回收，然后基于高通量測序技術(shù)識別和鑒定功能微生物。

2000 年，DNA-SIP 首次被提出，并被用于識別土壤環(huán)境中能夠利用甲醇作為碳源和能源的功能微生物[28]。2002 年，RNA-SIP 首次被用于土壤中具有苯酚降解能力的功能微生物的研究[29]。2003 年，SIP 技術(shù)首次應用在PAHs 降解功能微生物的識別，Jeon等[30]應用DNA-SIP 識別污染水體底泥中的萘降解菌。2006 年，Singleton[31]首次應用DNA-SIP 識別處理PAHs 污染土壤生物反應器中的芘降解菌。如今，DNA-SIP 技術(shù)已成功應用于多種土壤環(huán)境中PAHs 降解功能微生物的識別，如煤氣廠土壤[32]，煤焦油蒸餾和木材保存設(shè)施土壤[33]，鋼鐵制造工廠和農(nóng)業(yè)土壤[34]，種植黑麥草的土壤[35]，人工PAHs 污染土壤[36]以及油田PAHs 污染土壤等[37]。然而，RNA-SIP 在被成功應用于功能微生物的探索后，被更多地應用于臨床醫(yī)學，如揭示腸道菌群內(nèi)的功能微生物等[38]。

通過SIP 技術(shù)識別的未可培養(yǎng)PAHs 降解功能菌如表2 所示[37-56]。其中Roseimicrobium、unclassified Acidimicrobiales、 未 培 養(yǎng) 的Anaerolineae、Perlucidibaca、Skermanella和Microvirga均為首次通過SIP 技術(shù)證明了它們的PAHs 降解能力。Roseimicrobium為單個卵形或桿狀細胞，不分枝、不運動、不滑行，革蘭氏陰性，需氧和化學有機營養(yǎng)，據(jù)報道能夠降解結(jié)冷膠[39]。Acidimicrobiales的成員與鐵的轉(zhuǎn)化相關(guān)[40]。此外，隸屬于Acidimicrobiales目的Acidimicrobiaceae科曾經(jīng)被報道在厭氧環(huán)境下，在石油污染的土壤中逐漸消失[41]。而隸屬于Acidimicrobiales目的Acidimicrobium屬則被報道參與了有氧環(huán)境下的老化油污染土壤的生態(tài)修復過程[42]。Anaerolineae曾被報道為上流式厭氧污泥床反應器的預酸化過程中的核心功能菌群[43]，Perlucidibaca曾經(jīng)被從農(nóng)田土壤中分離出來，并顯示出促進秸稈水解的能力[44]。

表2 SIP 技術(shù)識別的PAHs 降解功能菌舉例Tab. 2 Examples of PAHs degrading bacteria identified by SIP technology

2003 年，Kanso 等[45]首次描述了一種從自由流動的地熱水中分離出來的Microvirga，證實它是一種革蘭氏陰性、桿狀和絕對需要酵母的菌株。此后，Microvirga從各種環(huán)境中被分離出來，并表現(xiàn)出不同的代謝活性[46]。Skermanella是一種革蘭氏陰性、需氧、能動、桿狀細菌，它是固氮土壤群落中的優(yōu)勢屬[47]。Lelliottia是來自于腸桿菌科的桿狀革蘭氏陰性菌株[48-49]。大多數(shù)的Lelliottia菌種具有臨床相關(guān)性[50]，但也有一些Lelliottia菌種與自然環(huán)境相關(guān)。最近，一種Lelliottiasp.被Kampfer 等[48]從飲用水中分離出來，并且被認為可以分解利用多種碳源。Brevundimonas是在自然界中廣泛分布的革蘭氏陰性菌屬，是一種已經(jīng)報道過的病原體[51]。據(jù)報道，Brevundimonassp.可以利用一些復雜的有機物作為碳源，例如磺胺甲惡唑[52]、芳氧基苯氧基丙酸酯類除草劑[53]、林丹(一種農(nóng)藥殺蟲劑)等[54]。

除上述菌株之外，也有很多常見的PAHs 降解菌被SIP 技術(shù)再次識別。如Microbacterium、Mycobacterium、Acinetobacter、Sphingomonas、Alkanindiges、Brevundimonas、Sphingopyxis、Vibrio、Acidovorax、Rhodococcus、Lysobacter、Pseudomonas、Cyanobacteria、Altererythrobacter、Stenotrophomonas和Comamonas都是眾所周知的PAHs 降解菌[37]，能夠降解多種PAHs。如：Stenotrophomonas可以降解萘、菲、熒蒽和芘[55]，而Comamonas可以降解苊、芴、蒽、熒蒽、芘、菲和萘[56]。

2 PAHs 生物強化研究進展

2.1 生物強化

BA 已被證明可以成功修復被PAHs 污染的環(huán)境樣本，且單菌及混菌均可用于BA 技術(shù)，如表3 所示。

表3 PAHs 污染土壤的BA 修復舉例[64]Tab. 3 Example of BA remediation for PAHs contaminated soil[64]

然而，其成功應用仍面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)，問題之一便是引入土壤的外援菌株的有效存活及其降解功能的有效發(fā)揮。有研究報道，土壤接種后不久，外援微生物的數(shù)量就減少了，從而未發(fā)揮強化降解污染物的功能。Silva 等[57]使用從PAHs 污染的土壤中篩選的3 株降解菌株，研究PAHs 的降解行為，結(jié)果表明BA 策略對PAHs 的生物降解沒有顯著促進作用。Herwijnen 等[58]使用從紅樹林沉積物中富集的PAHs降解菌群，研究PAHs 混合物的去除，結(jié)果表明在BA 與NA 中，3 種PAHs 的降解率沒有顯著差異。上述現(xiàn)象可能是由于本地微生物對外援菌群產(chǎn)生了競爭抑制作用。由于這種抑制作用的存在，一般認為只有當NA 和BS 失敗時，才應采用BA 修復方法[59]。

非生物和生物因素都會影響B(tài)A 的有效性。非生物因素主要包括溫度、水分、pH 和有機物質(zhì)含量等。溫度、水分和pH 會影響底物供應的擴散和微生物的生理生化性質(zhì)，從而可能降低微生物的活性[10]。有機質(zhì)含量在污染物的生物利用度方面起著至關(guān)重要的作用，并可能損害接種菌株的存活及其降解污染物的能力[60]。生物因素包括本地和外援微生物對有限碳源的競爭，以及原生動物和噬菌體的拮抗作用和捕食。生物因素和非生物因素都會造成BA 接種菌株的存活率降低。除此之外，將接種微生物輸送到污染土壤中相對容易，但是微生物對有機物的粘附會嚴重限制它們的分布。為了避免以上限制，選擇合適的外援菌株、使用表面活性劑和泡沫等降低其表面張力[61-62]，或者援引固定化微生物用于BA 修復等[63]技術(shù)被不斷開發(fā)。

2.2 表面活性劑促進生物強化

PAHs 的化學結(jié)構(gòu)復雜，低溶解度和對土壤的強吸附性通常限制了它們的生物利用度[64-65]。表面活性劑同時具有親水和疏水的性質(zhì)，使用后可以降低PAHs 的表面和界面張力，對PAHs 具有增溶效應，增加土壤中污染物與微生物的混合接觸，進而提高PAHs 的生物可降解性。此外，表面活性劑膠束具有疏水核，有助于積累PAHs 并增加其水溶性[66]。

在表面活性劑膠束體系中，烴類分子既可以通過擴散作用，在水相中被微生物降解，也可以直接被微生物從膠束中攝取[66]。微生物從表面活性劑膠束中吸收碳氫化合物的過程分為3 個不同的階段：①基質(zhì)溶解膠束被運送到細胞附近；②基質(zhì)填充膠束與細胞周圍形成的表面活性劑分子的半膠束層交換；③基質(zhì)從半膠束轉(zhuǎn)移到細菌細胞[66]，如圖3 所示。

圖3 細菌從表面活性劑中攝取碳氫化合物[66]Fig. 3 Bacterial uptake of hydrocarbons from surfactants[66]

綜上，表面活性劑提高PAHs 生物利用度的主要機制可概括為：①由于界面張力的降低，非水相液態(tài)烴類的分散；②烴類在表面活性劑膠束疏水核心的溶解度增加[67]；③表面活性劑有助于微生物數(shù)量的增加，導致表面活性劑疏水表面的養(yǎng)分吸收增加，這意味著可以降解更多的PAHs[68]。然而，也有研究表明有些表面活性劑對微生物活性會產(chǎn)生一定的毒性作用，進而對PAHs 的生物降解產(chǎn)生不利影響。比如，使用Tween80 后，1C 菌株對萘和菲的降解速率降低[69]。但是，微生物的生物量呈現(xiàn)正增長，這可能是微生物消耗表面活性劑作為碳源的結(jié)果。有研究表明，添加TX100(1.19 g·L–1)后，Pseudomonas的生長受到抑制，其可能是由于利用TX100 獲得的有毒代謝產(chǎn)物所致[19]。

表面活性劑可以根據(jù)它們的來源分為化學(合成)和天然(生物)表面活性劑[70]。生物表面活性劑相較于人工合成表面活性劑，具有毒性低、成本低、生物可降解、環(huán)境適應性良好等潛在優(yōu)勢，因而被廣泛應用[71]。生物表面活性劑的低毒性優(yōu)勢明顯，許多研究已經(jīng)證明生物表面活性劑對PAHs 降解是有積極影響的,如表4 所示[72]。

表4 表面活性劑在不同微生物群落存在下促進PAHs 的生物降解舉例[72]Tab. 4 Examples of surfactants promoting biodegradation of PAHs in the presence of different microbial communities[72]

添加10 mg·kg–1生物表面活性劑鼠李糖脂，PAHs的生物降解率可以達到95%，而添加50 mg·kg–1Tween80 和50 mg·kg–1十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)化學表面活性劑，PAHs 的生物降解率分別只能達到92%和90%[73]。Bacillus和Pseudomonas在有生物表面活性劑的存在下，對15 種PAHs 的降解率從原來的57%提高到86.5%[74]。蒽的降解速率在添加0.065 mmol·L–1鼠李糖脂后，可提高37.52%。芘的降解速率在添加0.072 mmol·L–1鼠李糖脂后，可提高25.58%[35]。Sphingomonassp.GF2B 在有鼠李糖脂存在的條件下，對菲的降解可達99.5%[75]。Acinetobacterial woffiiRAG-1 在有鼠李糖脂時，對菲的降解可達99.5%[76]。

2.3 生物炭固定化微生物的生物強化

微生物固定化是一種特殊的BA 修復方法，是通過物理或化學方法將微生物固定在載體上實現(xiàn)的[77]。與游離細胞不同，固定化微生物具有更高的細胞密度和生物活性，對環(huán)境干擾的抵抗力更強，更容易回收和再利用[78]。一般來說，固定化微生物的活力和功能受所用載體類型的影響[79]，因此選擇合適的載體來固定微生物至關(guān)重要。

生物炭等炭基材料是用于此技術(shù)的常用材料。這些炭基材料是不溶性的，具有較大的比表面積、較高的機械強度、發(fā)達的孔隙率和可調(diào)控的表面功能等特性。這些特性有利于微生物的附著和生長。此外，一些生物炭在去除污染物方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，從而可保護微生物免受污染物的侵害，并能保持微生物的活性和穩(wěn)定性。生物炭固定化微生物對土壤中PAHs 的降解作用機理可概括如圖4所示[80]：①吸附土壌中PAHs，從而阻止PAHs 向水體和大氣環(huán)境的擴散；②生物炭的孔狀結(jié)構(gòu)為微生物提供一個適合其生存的微環(huán)境，減輕了土著微生物的競爭和有毒有害物質(zhì)的干擾，從而保證了固定化微生物的良性增長，提高了其在有限空間內(nèi)對污染物的降解活性；③生物炭作為良好的吸附劑，可將土壤中的PAHs 有效地富集到生物炭上，提高污染物在有限空間內(nèi)的濃度，通過增加目標微生物與污染物的接觸，促進污染物的降解。此外，在生物炭表面形成的生物膜和胞外聚合物有利于PAHs向固定細胞的傳質(zhì)。然而，生物炭固定化微生物強化去除PAHs 的分子生物學機制仍不明確，還需要進一步研究。

圖4 生物炭固定化微生物對PAHs（以芘為模型化合物）的降解作用機理[80]Fig. 4 The effect of immobilized microorganisms by biochar on PAHs (pyrene as model compound)[80]

目前，已經(jīng)報道了通過基于生物炭的微生物固定化技術(shù)對受污染的廢水、土壤和廢氣的修復，包括對染料、苯、PAHs 及其衍生物、石油碳氫化合物等多種有機污染物在內(nèi)的BA 降解。有研究表明，與游離細胞相比，固定在生物炭-海藻酸小球內(nèi)的Pseudomonassp.增強了對PAHs 的去除，并減輕了土壤污染，固定化細胞在連續(xù)降解修復環(huán)境污染中表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性和高效性[80]，固定化細胞對4 環(huán)和5 環(huán)PAHs 的生物修復效率高于3 環(huán)和6 環(huán)PAHs。Xiong 等[80]將Mycobacterium gilvum負載到稻草生物炭上研究對PAHs 的降解，發(fā)現(xiàn)顯著提升了對菲、熒蒽和芘的降解效果，它們的降解效率分別達到(42.6±3.2)%、(52.1±2.3)%和(62.1±0.9)%。目前，生物炭固定化微生物修復PAHs 研究尚處于起步階段，有關(guān)修復機理，以及工藝參數(shù)調(diào)控與優(yōu)化仍有待深入探索。

3 展 望

DNA/RNA-SIP 用于PAHs 降解功能微生物的原位探究具有廣闊的應用前景，對揭示土壤環(huán)境功能微生物群落及污染物的復雜降解機制具有重要意義。①能極大地拓展人們對環(huán)境功能微生物資源的挖掘；②可以探查環(huán)境中真正發(fā)揮功能的微生物宿命。BA 是土壤PAHs 生物降解最有效的策略之一，對PAHs 在自然界的消減具有重要價值，BA 與其它多種技術(shù)手段聯(lián)合強化復雜污染環(huán)境中PAHs 的降解是今后的重點研究領(lǐng)域，如生物表活劑強化BA 及生物炭固定化強化BA 技術(shù)等。