關(guān)冀弛，劉丹，陳艷閣，樊雪，汪海峰*

（1.沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110142；2.遼寧成大生物股份有限公司）

抗腫瘤藥物的研發(fā)依賴于藥理學(xué)體內(nèi)及體外病理模型，與體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)相比，體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方便、省時(shí)省力、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，能夠清晰地體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、轉(zhuǎn)移分化、信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)等重要過程，為腫瘤疾病的治療、藥物研發(fā)與篩選提供方法和依據(jù)［1-2］。

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是使細(xì)胞在三維空間生長(zhǎng)、相互作用，使細(xì)胞群形成一個(gè)三維立體結(jié)構(gòu)。三維細(xì)胞培養(yǎng)有諸多優(yōu)勢(shì)：三維細(xì)胞培養(yǎng)具有直觀性和條件可控性，高度模擬體內(nèi)微環(huán)境［3-4］；可提高細(xì)胞培養(yǎng)效率、細(xì)胞因子、抗體及其他生物分子等產(chǎn)量，使細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)更健康；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如基因表達(dá)譜、毒理等與體內(nèi)研究數(shù)據(jù)更吻合，可降低藥物研發(fā)成本和周期［5］。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅可代替部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而且該技術(shù)以人體細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果更真實(shí)準(zhǔn)確。目前，腫瘤細(xì)胞的三維技術(shù)按照有無支架可分為兩大類：無支架培養(yǎng)法和支架培養(yǎng)法。

1 無支架培養(yǎng)法

無支架培養(yǎng)是以細(xì)胞本身的附著力為基礎(chǔ)，使細(xì)胞聚集成三維結(jié)構(gòu)。主要包括成球培養(yǎng)法、懸滴培養(yǎng)法、微重力旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)（Rotary cell culture system，RCCS）、磁懸浮培養(yǎng)、超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)法、生物反應(yīng)器等。

1.1 成球培養(yǎng)法 成球培養(yǎng)法是將細(xì)胞聚集成團(tuán)狀物細(xì)胞集合體，在三維環(huán)境下形成細(xì)胞球［6］。對(duì)于腫瘤干細(xì)胞，其成球能力是體外鑒定的一個(gè)重要方法，該方法可檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞在特定的生長(zhǎng)條件下自我更新能力，所以用細(xì)胞成球率表示其成球能力。對(duì)于一些膠質(zhì)瘤和乳腺癌等腫瘤細(xì)胞，它們的成球率相對(duì)較高，而上皮腫瘤如肝癌細(xì)胞或者結(jié)腸癌細(xì)胞，它們的成球能力相對(duì)較低。所以為了研究該類腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，就需要提供細(xì)胞防止貼壁生長(zhǎng)的條件，讓腫瘤細(xì)胞在特定培養(yǎng)基內(nèi)成球生長(zhǎng)。王靜等［7］通過成球培養(yǎng)法研究胰腺癌腫瘤干細(xì)胞成球能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與普通腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)方式相比，成球培養(yǎng)法獲得的胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的CD24、CD44基因表達(dá)水平顯著提升。張雙鶴等［8］通過成球培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)了三陰型乳腺癌相關(guān)的miRNAs，并檢測(cè)出microRNA-297及其靶基因SLC7A5在乳腺癌的發(fā)病及干性形成具有重要作用。

1.2 懸滴培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法是利用表面張力將細(xì)胞混懸液置于培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板底部表面制成懸滴，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，使細(xì)胞懸掛聚集在液滴底部，利用細(xì)胞間的附著力聚集成三維結(jié)構(gòu)［9］。此方法操作比較簡(jiǎn)便，不需要特別的儀器設(shè)備，其缺點(diǎn)是懸滴液體的體積受表面張力限制而局限在50μl以內(nèi)，且在后續(xù)的藥物處理及形態(tài)觀察方面較繁瑣，難以用于大規(guī)模培養(yǎng)。林鶴等［10］通過懸滴培養(yǎng)法建立三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，結(jié)果表明48孔培養(yǎng)板進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)得到的細(xì)胞活性測(cè)試更加精準(zhǔn)、方便、經(jīng)濟(jì)。

1.3 RCCS RCCS是一種通過模擬微重力環(huán)境從而使細(xì)胞、組織和培養(yǎng)液在一種類似自由落體的狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)［11］。該系統(tǒng)可以有效促進(jìn)各種細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)分化，有利于細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)，同時(shí)RCCS無推進(jìn)器、無攪拌器，故剪切力極低，對(duì)細(xì)胞幾乎無傷害，并且隨著細(xì)胞團(tuán)塊的增大，可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)速度來降低其沉降率。Tan等［12］研究表明，微重力下顯著抑制局部粘著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）、Rho家族蛋白（RhoA、Rac1和Cdc42）及mTORC1激酶的激活，從而抑制FAK和RhoA信號(hào)傳導(dǎo)及mTORC1通路，降低黑色素瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。Strube等［13］運(yùn)用微重力培養(yǎng)法為人類乳腺癌細(xì)胞提供了易于處理、無支架的三維培養(yǎng)模型，證明在微重力下乳腺癌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架形態(tài)和基因表達(dá)等方面都有很大的變化，為識(shí)別其潛在機(jī)制提供新的治療選擇。

1.4 磁懸浮培養(yǎng) 磁懸浮培養(yǎng)是應(yīng)用噬菌體、磁性氧化鐵微粒組成的水凝膠介質(zhì)進(jìn)行三維培養(yǎng)，通過對(duì)磁場(chǎng)的空間控制，可以控制細(xì)胞群的幾何形狀，且實(shí)現(xiàn)不同種細(xì)胞在共培養(yǎng)過程中的多細(xì)胞聚集［14］。秦文娟等［15］通過懸浮培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生物鐘節(jié)律現(xiàn)象，對(duì)該方法培養(yǎng)下的腫瘤細(xì)胞在不同階段進(jìn)行給藥處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥處理后的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生明顯的時(shí)辰反應(yīng)，有助于生物鐘與腫瘤治療的相關(guān)研究。腫瘤細(xì)胞做出不同的反應(yīng)產(chǎn)生藥后效果，這對(duì)治療腫瘤細(xì)胞及給藥方式提供前提。依據(jù)該種培養(yǎng)方式，細(xì)胞的產(chǎn)率以及生存率提高，可用于細(xì)胞大量培養(yǎng)且優(yōu)勢(shì)顯著。Leonard等［16］利用磁懸浮法測(cè)定腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞的特定比率，最快在24 h內(nèi)形成具有特定細(xì)胞成分和密度的腫瘤球，為腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制、營(yíng)養(yǎng)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、治療提供重要實(shí)驗(yàn)工具。

1.5 超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)法 超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)法采用內(nèi)表面經(jīng)惰性超低吸附材料包被處理的圓底培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞。由于細(xì)胞無法吸附在內(nèi)壁生長(zhǎng)，因此細(xì)胞聚集黏附成球，形成一定三維結(jié)構(gòu)。此方法操作簡(jiǎn)便，也不需要額外的儀器設(shè)備。然而超低吸附培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板的價(jià)格昂貴，限制了其方法的廣泛使用［17］。

1.6 生物反應(yīng)器 生物反應(yīng)器根據(jù)具體的培養(yǎng)方法，制作出不同類型的培養(yǎng)設(shè)備，它們的溫度、濕度、壓強(qiáng)、養(yǎng)分、CO2濃度、物理或化學(xué)刺激等因素都要極度接近體環(huán)境，在設(shè)備下的培養(yǎng)比在其他環(huán)境中的培養(yǎng)方式更能精準(zhǔn)，條件可控，對(duì)腫瘤的培養(yǎng)會(huì)便捷很多，故而可廣泛應(yīng)用［18］。Manfredonia等［19］通過生物反應(yīng)器的三維培養(yǎng)系統(tǒng)灌注培養(yǎng)可維持腫瘤組織結(jié)構(gòu)，增殖的腫瘤細(xì)胞密度明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)，基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞也被保存并完全存活，可高度顯示腫瘤微環(huán)境的主要特性，為腫瘤藥物的評(píng)估提供平臺(tái)。Calamak等［20］設(shè)計(jì)蠕動(dòng)連續(xù)流生物反應(yīng)器應(yīng)用于HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞，以模擬循環(huán)的流體動(dòng)力學(xué)，這種流動(dòng)反應(yīng)器模型可對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行重新編程，使其朝著更具間充質(zhì)生態(tài)位的方向發(fā)展，從而模擬血液循環(huán)，證明血流動(dòng)力學(xué)可以影響癌細(xì)胞的細(xì)胞膜成分和形態(tài)特征，為癌癥治療提供依據(jù)。

2 支架培養(yǎng)法

支架系統(tǒng)主要是將細(xì)胞接種或分散于體外可見的細(xì)胞外基質(zhì)支架自組裝成三維形態(tài)的細(xì)胞，這類系統(tǒng)包括水凝膠支架、微流控芯片、固體多孔支架、纖維支架、3D打印法等。

2.1 水凝膠支架 水凝膠支架是在三維空間上搭建孔狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞可以在此黏附、生長(zhǎng)、遷移。在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)了來自天然的水凝膠支架材料，如膠原蛋白，它來自于細(xì)胞外基質(zhì)，性能強(qiáng)大，具有高度的支撐和可塑性，而且易相溶，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)最多。其他還有人工組織培養(yǎng)的塑料，也有可降解類塑料。不同的細(xì)胞培養(yǎng)需要不同的支架材料，所以，三維細(xì)胞培養(yǎng)的支架要選擇更適合細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、觀察、檢測(cè)等方面的材料，這也是一個(gè)重要的培養(yǎng)步驟?；谝陨蟽?yōu)勢(shì)，對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)方式的差異進(jìn)行分析，制造出一系列三維膠原支架材料，廣泛應(yīng)用于三維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過程［21-22］。

水凝膠的性質(zhì)如同人體組織般具有柔軟性，同時(shí)還賦有彈性、可擴(kuò)散介質(zhì)，具有支撐細(xì)胞、滲透養(yǎng)分、營(yíng)養(yǎng)傳送的作用。常用的凝膠成分有纖維蛋白、瓊脂糖、聚乙烯、乙二醇等物質(zhì)，但是凝膠支架也有不足之處，如材質(zhì)和組成的差異，會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸入和養(yǎng)分傳送產(chǎn)生障礙，不利于細(xì)胞培養(yǎng)。Song等［23］合成了一種新的非病毒載體G5-BGG，并將其與shRNA質(zhì)粒形成基因復(fù)合體，G5-BGG/shRNA871負(fù)載水凝膠聯(lián)合替莫唑胺下調(diào)CD47蛋白表達(dá)，引發(fā)骨髓源性巨噬細(xì)胞對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，增加巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至殘余腫瘤。

2.2 固體多孔支架 固體多孔支架是具有通透性好、密度均勻、孔稀率高的材料支架，且該技術(shù)制作簡(jiǎn)單易得，能夠?qū)⒁恍┛股鼗蛘呖寡趸瘎┙Y(jié)合在一起［24-25］。Wang等［26］將含有β-磷酸三鈣、2D黑磷納米片、低劑量鹽酸阿霉素和高劑量成骨肽的水/聚乳酸-羥基乙酸/二氯甲烷乳液聚合，低溫三維打印成具有分級(jí)多孔和機(jī)械強(qiáng)度的納米復(fù)合支架，證明具有治療骨腫瘤切除引起組織缺損的功能。趙培培［27］通過建立r-GdPO4/CS/Fe3O4支架，在紅外燈光照射下，使支架溫度升高，刺激腫瘤細(xì)胞的死亡，并且GdPO4是一種全新的生物活性成分，能夠促進(jìn)血管的生成和成骨能力，對(duì)骨腫瘤的治療帶來新希望。

2.3 纖維支架 纖維支架材料主要是應(yīng)用它們的纖維結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育提供較大的附著面積，該類支架具有廣闊的空隙，為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換和氣體運(yùn)輸提供方便。該種支架如同加密的蜘蛛網(wǎng)狀的空隙可變的三維結(jié)構(gòu)，包括天然纖維支架如蠶絲，合成的纖維支架殼聚糖等［28］。雷冬梅等［29］通過裁剪不同尺寸的聚苯乙烯馬來酸酐短纖維支架，研究肝癌細(xì)胞在不同尺寸的纖維支架上的增殖與形態(tài)，結(jié)果表明，在50μm的纖維支架上，肝癌細(xì)胞的形態(tài)和功能最好。這一支架的建立，對(duì)三維腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的真實(shí)環(huán)境給予最大的顯示，有助于腫瘤給藥測(cè)試。Liu等［30］在3D打印的海藻酸鹽-明膠水凝膠（Gelatin，Gel）支架上涂復(fù)一層均一的聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL），制備了核/殼纖維支架，PCL涂層可以減少藥物從核心凝膠中的自由擴(kuò)散，隨后，將聚多巴胺（Polydopamine，PDA）包復(fù)在Gel/PCL核/殼支架上，賦予支架極大的光熱效應(yīng)。由于核心凝膠的熱誘導(dǎo)溶膠凝膠轉(zhuǎn)變，本系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了近紅外激光觸發(fā)的按需釋藥。釋放的藥物（多柔比星）和光熱療法可以在體內(nèi)外有效地抑制或消融腫瘤，Gel/PCL/PDA核/殼支架具有應(yīng)用于腫瘤局部治療和組織再生的潛力，特別是對(duì)于那些接受手術(shù)切除的癌癥患者，可在切除部位植入支架以殺滅殘存或復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞以及修復(fù)手術(shù)造成的組織缺損。

2.4 天然支架 天然支架類是由天然物質(zhì)如膠原、殼聚糖、多糖、海藻鹽、細(xì)胞外基質(zhì)等物質(zhì)材料制備而成［31］。這種材料支架具有高度的生物相容性、可降解和低毒性等優(yōu)勢(shì)。只是其結(jié)構(gòu)強(qiáng)度相對(duì)較低，沒有其他材料支架強(qiáng)度高。近年來殼聚糖納米粒的興起，在腫瘤細(xì)胞的治療過程中大顯能力。殼聚糖納米?？砂d藥物送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，其外部可進(jìn)行修飾增加腫瘤細(xì)胞可識(shí)別的受體或配體，這樣可識(shí)別腫瘤細(xì)胞，釋放藥物［32］。在殼聚糖納米粒表面增加葉酸等物質(zhì)構(gòu)造葉酸納米粒，載有紫杉醇、氟尿嘧啶等藥物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可識(shí)別并殺死大量腫瘤細(xì)胞［33］。Chaicharoenaudomrung等［34］建立人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)的3D鈣（Ca）-海藻酸鹽支架，并研究了其對(duì)多柔比星和蟲草素兩種抗癌藥物的反應(yīng)，結(jié)果膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖減少，瘤球形成增多，腫瘤干細(xì)胞基因（CD133、SOX2、Nestin和Musashi-1）表達(dá)增強(qiáng)，分化潛能相關(guān)基因（膠質(zhì)纖維酸性蛋白和β-微管蛋白Ⅲ）表達(dá)增強(qiáng)，為抗癌藥物篩選和腫瘤耐藥機(jī)制的研究提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。

2.5 微球支架 微球支架是一個(gè)粒徑約數(shù)十個(gè)到上百個(gè)微米之間的球體結(jié)構(gòu)，在它的內(nèi)部包含著提供細(xì)胞生長(zhǎng)的因子、促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂的營(yíng)養(yǎng)所需［35］。通過改變微球的制備條件或在微球中加入肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)等活性成分，可提高微球支架的傳質(zhì)能力，使其更接近與體內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。孫東升［36］構(gòu)造海藻酸鈣凝膠微球模型，通過調(diào)整微球凝膠浴的濃度，改變微球的傳質(zhì)能力，發(fā)現(xiàn)微球傳質(zhì)能力的提高可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，又引入肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9的活性增強(qiáng)，表明細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力提高，為探究肝癌細(xì)胞的遷移侵襲機(jī)制、研發(fā)高效抗癌藥物提供依據(jù)。

2.6 微流控芯片 微流控芯片是在玻璃、硅等基底上雕刻出微米甚至納米級(jí)的通道及分析檢測(cè)單元，實(shí)現(xiàn)微量樣品分析、細(xì)胞培養(yǎng)和信號(hào)傳導(dǎo)等功能的微型技術(shù)平臺(tái)，內(nèi)部具有能通過流體、反應(yīng)操作平臺(tái)、分析檢測(cè)、分離等一系列操作的類似于整個(gè)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的功能，并且它的大小與血管尺寸相近，芯片具有控制流體流動(dòng)、減少試劑損耗、檢測(cè)速度加倍、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)優(yōu)勢(shì)，可充分模擬體內(nèi)微環(huán)境，對(duì)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)提供幫助［37］。喬苗苗等［38］通過制作聚二甲基硅氧烷雙層芯片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果表明，微流控芯片的獨(dú)特結(jié)構(gòu)與特征作用下，大大促進(jìn)了細(xì)胞的聚集，使細(xì)胞存活率達(dá)80%。Gwak等［39］研制新型的微流控芯片，可高效、及時(shí)地選擇性分離腫瘤來源的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），EVs可以用來生成評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的補(bǔ)充方法上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指數(shù)，結(jié)果顯示每100μl進(jìn)樣量6.7 min內(nèi)可選擇性分離出90%以上表達(dá)上皮標(biāo)志物和間充質(zhì)標(biāo)志物的EVs，這一技術(shù)的廣泛研究與開展，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、耐藥性質(zhì)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等研究提供重要意義。

2.7 3D打印法 3D打印法使用專門的打印機(jī)來創(chuàng)建固體物件，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行設(shè)計(jì)，分析所需支架的材質(zhì)、形狀、尺寸、結(jié)構(gòu)等方面內(nèi)容，這樣再通過一系列的程序加工制造，得到一個(gè)實(shí)體的材料［40］。三維打印技術(shù)將三維立體打印機(jī)與計(jì)算機(jī)結(jié)合，將所需材料投入機(jī)體內(nèi)，在計(jì)算機(jī)的控制下將打印機(jī)內(nèi)部的材料噴射出，這樣一層層地疊加起來，形成實(shí)體物件。當(dāng)下3D打印法廣泛應(yīng)用于各類物品制作行業(yè)，利用該方法可定制出各類的支架結(jié)構(gòu)。該類型培養(yǎng)方法對(duì)計(jì)算機(jī)和打印機(jī)的要求較高，價(jià)格昂貴，故目前應(yīng)用較少。3D打印法也可與其他支架材料結(jié)合，共同應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和活性檢測(cè)過程，可增加支架的強(qiáng)度、韌性、無毒等優(yōu)勢(shì)。Ong等［41］通過制作3D打印微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置，對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤和肝癌細(xì)胞球體進(jìn)行無泵灌注培養(yǎng)，證明了3D打印設(shè)備的生物學(xué)性能且該裝置能夠直接固定和維持3D多細(xì)胞球體的活力和功能。

3 腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)可應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)、腫瘤疾病發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移、侵襲、復(fù)發(fā)以及治療方案的研究和藥物研發(fā)、篩選等。

3.1 腫瘤生物學(xué)行為 腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)可研究腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、蛋白表達(dá)等諸多方面，更清晰準(zhǔn)確地觀察記錄腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與發(fā)展過程。通過長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)的觀察和追蹤，為腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法、遷移行為、生物學(xué)特性、藥物研發(fā)與篩選等提供依據(jù)［42］。Poggi［43］在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞，研究腫瘤細(xì)胞表型和生長(zhǎng)的程序，結(jié)果表明，在光學(xué)顯微鏡下觀察到三維培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞在超低貼壁培養(yǎng)板中呈多細(xì)胞聚集式生長(zhǎng)，逐漸形成細(xì)胞球體，可清晰觀察到腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。

3.2 腫瘤新生血管形成 腫瘤血管生成是在腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)下在原有血管基礎(chǔ)上形成以毛細(xì)血管為主的血液系統(tǒng)，并在腫瘤組織內(nèi)建立血液循環(huán)的過程［44］。該過程需要細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的共同運(yùn)作，腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)可提供與體內(nèi)血管組織高度吻合的新生血管系統(tǒng)，這有利于在體外開展腫瘤遷移、侵襲方面研究。Valipour等［45］分離了來源于人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hEnMSCs）的外泌體，研究以hEnMSCs外泌體作為阿托伐他汀的載體，在三維共培養(yǎng)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤球體的促凋亡和抗血管生成作用，結(jié)果表明，負(fù)載阿托伐他汀的hEnMSCs外泌體對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，且該方法增強(qiáng)了阿托伐他汀促腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤血管生成能力，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供了新的前景。

3.3 腫瘤干細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞以自我復(fù)制和多項(xiàng)細(xì)胞分化引起腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。從本質(zhì)上講，腫瘤干細(xì)胞自我更新和無限增殖維持腫瘤細(xì)胞群的活力。腫瘤干細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷徙可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，腫瘤干細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)并具有多種耐藥分子，而對(duì)殺傷腫瘤細(xì)胞的外界理化因素不敏感［46-47］。Monzur等［48］通過三維培養(yǎng)建立腫瘤干細(xì)胞模型，將二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）作用于腫瘤干細(xì)胞中，結(jié)果表明DPI是腫瘤干細(xì)胞靶向線粒體呼吸的合適候選物，與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)體系的貼壁單分子層相比，三維培養(yǎng)方法更有效地篩選抗腫瘤干細(xì)胞藥物候選物，更好地模擬腫瘤微環(huán)境。

3.4 腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境由多種細(xì)胞成分組成，包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞等，復(fù)雜多樣且易于變化，與腫瘤的產(chǎn)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［49］。腫瘤微環(huán)境可促進(jìn)原癌基因和腫瘤生長(zhǎng)蛋白的表達(dá)，又可抑制免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫功能，腫瘤與微環(huán)境之間相互調(diào)節(jié)、相互作用，通過對(duì)腫瘤與微環(huán)境關(guān)系的研究，對(duì)腫瘤生物學(xué)行為、診斷和治療都會(huì)產(chǎn)生重要意義［50］。Baru等［51］利用新型AXTEX-4D平臺(tái)建立三維組織樣體模型，結(jié)果表明腫瘤三維組織樣細(xì)胞顯示了三維細(xì)胞培養(yǎng)的基本特征，具有快速附著和增殖能力且細(xì)胞壽命更長(zhǎng)，細(xì)胞骨架和缺氧核心相連。該研究還表明，與二維單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D-MCF-7組織樣細(xì)胞具有更大的耐藥性，三維組織樣細(xì)胞在模擬重要的腫瘤特征、腫瘤微環(huán)境、抗凋亡特征及其產(chǎn)生的耐藥性方面比二維培養(yǎng)細(xì)胞更強(qiáng)。

3.5 抗腫瘤藥物研發(fā)與篩選 檢驗(yàn)候選藥物的安全性一般利用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，體外實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)給藥后靶細(xì)胞的受損程度、毒副作用、安全性等。藥物的作用價(jià)值直接在靶細(xì)胞的損傷程度上體現(xiàn)出來，在檢測(cè)過程中，安全性實(shí)驗(yàn)可體現(xiàn)候選藥物的毒副作用和其他不良結(jié)果。腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)下的細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)移侵襲，以及其他生理過程近似于體內(nèi)微環(huán)境，故而三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可應(yīng)用于腫瘤藥物篩選，此過程效率、安全性更高且結(jié)果更準(zhǔn)確。Rosendahl等［52］在3D TEMPO-CNF支架中培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF7和MDA-MB-231，在光學(xué)顯微鏡下觀察到腫瘤細(xì)胞以不同形態(tài)呈多層生長(zhǎng)；基因表達(dá)分析表明，相較于二維培養(yǎng)，三維TEMPO-CNF支架誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞中的干細(xì)胞標(biāo)記CD44和遷移標(biāo)記VIM和SNAI1升高，TEMPO-CNF被證明是一種有前景的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型材料，可用于抗腫瘤藥物篩選。

4 小結(jié)

三維培養(yǎng)技術(shù)以體外培養(yǎng)技術(shù)極大程度地模擬體內(nèi)細(xì)胞生存的環(huán)境，這種環(huán)境是細(xì)胞生存和生長(zhǎng)所必需，用以維持細(xì)胞正常的生理代謝功能，其組成也復(fù)雜多樣。然而這種細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境成分變化也導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生異常，容易引起死亡或凋亡。腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)，能更清晰地觀察出腫瘤組織的生長(zhǎng)特征，對(duì)其新生血管形成、生理相關(guān)的信號(hào)通路、基因表達(dá)、細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用等方面提供更有力的證據(jù)，同時(shí)三維培養(yǎng)技術(shù)也會(huì)推動(dòng)解剖生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的研究，具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前，腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)仍存在一定缺陷，一些技術(shù)由于制作材料復(fù)雜、成本過高、操作困難等諸多因素未能夠全面開發(fā)應(yīng)用，并且該技術(shù)始終不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境。隨著科技的不斷發(fā)展，腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)會(huì)日趨完善，相信會(huì)開發(fā)出更多成熟、應(yīng)用型技術(shù)，為腫瘤疾病的發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、藥物研發(fā)和篩選提供方法和依據(jù)。