姚魯清,崔寶龍,何曉燕,趙芳,周暢

(青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東 青島 266003)

肌萎縮側索硬化(ALS)是一種累及上、下運動神經(jīng)元的進行性神經(jīng)系統(tǒng)變性病[1]，可以導致延髓、軀體部肌肉萎縮[2-3]。約90%的ALS病例是散發(fā)性的，只有10%的ALS病例為家族性的[4-5]。目前還沒有有效的治療方法可以阻止疾病進展。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)目前僅批準利魯唑和依達拉奉作為有效延緩病程的藥物[6]。有研究證實，家族性ALS中部分病人的發(fā)病與超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變有關[5,7]，還有一部分病人發(fā)病與TARDBP基因突變有關。目前認為TARDBP基因的突變可以導致異常TDP-43蛋白聚集而致病[7-9]。最新研究表明，TDP-43是ALS的病理性標志物。BRETTSCHNEIDER等[10-11]發(fā)現(xiàn)，異常聚集TDP-43在體內(nèi)沉積具有病理特征性，從而提出4階段分期，進一步突出了TDP-43在疾病進展中的作用。研究表明，百草枯(PQ)可以誘導SH-SY5Y細胞產(chǎn)生異常聚集的TDP-43蛋白[12]。

自噬是一種細胞進行自我吞噬的過程，更是清除細胞錯誤折疊蛋白質的關鍵機制。影響細胞自噬機制的主要是饑餓狀態(tài)[13]、細胞凋亡[14]和某些藥物[15]等。細胞自噬異常，可使異?；蝈e誤折疊的蛋白質聚集在細胞質、細胞核中，從而導致細胞器損傷及神經(jīng)元功能障礙[16]。通過調(diào)節(jié)自噬可以減少神經(jīng)變性病中的異常蛋白質聚集。天然小分子生物堿的調(diào)節(jié)自噬作用已經(jīng)被廣泛探究[15]?？轮Z辛堿B(Cory B)作為一種天然小分子生物堿在帕金森病模型中可激活自噬、減少α突觸核蛋白的表達[17]。但是，Cory B在ALS模型中的作用尚無明確的研究。故本研究用PQ處理細胞制備ALS模型，探討Cory B是否可以通過調(diào)節(jié)自噬而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，以期為治療ALS提供新方向和新思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

所用Cory B購于MCE公司；PQ購于Sigma-Aldrich公司；SH-SY5Y細胞購于American Type Culture Collection公司；細胞培養(yǎng)耗材購于Corning公司；胎牛血清購于BI公司；所有抗體均購于Cell Signaling Technology公司；LC3B購于Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

取回細胞后先復蘇細胞，再以800 r/min離心5 min，棄去上清液。用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，轉移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d按1∶6比例進行傳代。根據(jù)細胞密度，將細胞接種于6孔板內(nèi)，并用血細胞計數(shù)板計數(shù)，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實驗分組及處理

實驗分為正常對照組(Control組)、模型組(PQ組)和Cory B干預組(PQ+Cory B組)。Control組：用加入PBS緩沖液200 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h；PQ組：用加入PBS緩沖液100 μL和1 mmol/L的PQ 100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h；PQ+Cory B組：用加入設定濃度Cory B 100 μL的培養(yǎng)液預處理細胞12 h，再加入1 mmol/L的PQ 100 μL處理細胞12 h。在設定的時間點終止培養(yǎng)，進行下一步實驗。

1.4 CCK8法檢測細胞存活率

收集各組細胞，培養(yǎng)24 h后接種于96孔板中。按1∶10的體積比加入CCK8試劑，37 ℃孵育1 h后，于酶標儀上測560 nm波長處光密度(OD)值。計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值―空白組OD值)×100%。進行3次獨立實驗，結果取平均值。

1.5 細胞免疫熒光染色

實驗分組處理24 h，鋪板細胞，待細胞種植6孔板貼于玻片后，用40 g/L多聚甲醛固定液固定細胞20 min，PBS浸洗。接著用5 g/L TritonX室溫通透20 min，PBS浸洗。加入山羊血清封閉30 min，去除血清封閉液，加入LC3B一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。用PBS洗凈一抗后，在避光條件下，加入熒光二抗稀釋液孵育1 h。用PBS洗凈二抗后，加入DAPI避光孵育5 min復染核，以PBS洗凈DAPI，用抗熒光淬滅劑進行封片，觀察并收集圖像。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測

實驗分組處理24 h，收集細胞，用RIPA裂解液、PMFS和蛋白酶抑制劑配成的試劑提取蛋白。采用BCA法測定每組的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳條件：80 V、40 min，120 V、45 min。電泳完畢，進行轉膜，條件為295 mA恒流電轉90 min。加入50 g/L脫脂奶粉置搖床上常溫封閉1.5 h。去除封閉液，用TBST洗滌3次，每次10 min。加入按1∶1 000比例稀釋的TDP-43(兔源)、GADPH(鼠源)、LC3B(兔源)一抗4 ℃過夜。去除一抗，使用TBST洗滌3次，每次10 min。加入按1∶5 000比例稀釋的二抗(羊抗鼠和羊抗兔)，置搖床上室溫孵育1.5 h。去除二抗，使用TBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL發(fā)光液顯影，使用Image J軟件進行圖像分析。以GADPH作為對照計算目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 PQ對SH-SY5Y細胞TDP-43聚集的影響

根據(jù)先前的研究[18-20]，用1 mmol/L PQ處理SH-SY5Y細胞12 h，然后進行Western blot檢測。結果顯示，PQ組細胞TDP-43(35 000)蛋白相對表達量為0.838±0.456，較Control組(0.600±0.012)的表達量明顯增多(n=3，t=8.729，P<0.001)。見圖1。細胞免疫熒光染色結果顯示，PQ誘導了SH-SY5Y細胞胞質內(nèi)TDP-43(35 000)的異常聚集，該結果與Western blot檢測結果一致。見圖2。

圖1 TDP-43蛋白表達Western blot檢測

2.2 Cory B對PQ誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響

CCK8法檢測結果顯示，Control組和PQ組的細胞存活率分別為1.070±0.043和0.351±0.041(n=3)，PQ組的細胞存活率明顯降低(t=20.930，P<0.001)。PQ+不同濃度Cory B組(Cory B濃度分別為10、15、20、25、30 μmol/L)細胞存活率分別為0.434±0.046、0.517±0.016、0.618±0.007、0.705±0.010、0.634±0.018(n=6)，Cory B在一定濃度范圍內(nèi)，以劑量依賴的方式提高了1 mmol/L PQ誘導的SH-SY5Y細胞的存活率(F=179.800，P<0.001)，當Cory B濃度為25 μmol/L時，細胞存活率達到峰值。提示Cory B具有神經(jīng)保護作用，當Cory B濃度為25 μmol/L 時細胞存活率最高，因此使用25 μmol/L的Cory B進行后續(xù)研究。

SH-SY5Y細胞免疫熒光染色，箭頭(↑)示異常TDP43聚集體。Scale bar為100 μm。

2.3 Cory B對PQ誘導的SH-SY5Y細胞自噬的影響

為了研究Cory B是否可以誘導細胞自噬，采用LC3B抗體進行細胞免疫熒光染色。熒光顯微鏡下觀察到，Control組細胞LC3B綠色點狀熒光在胞質內(nèi)分布較彌散、不清，聚集分布不明顯；PQ組細胞LC3B在胞質內(nèi)分布與Control組相似；與PQ組和Control組細胞相比較，PQ+Cory B組細胞內(nèi)呈綠色點狀熒光的LC3B明顯增多。見圖3。Control組、PQ組和PQ+Cory B組的免疫熒光定量分別為0.105±0.002、0.161±0.002和0.089±0.004(n=3)，3組比較差異有顯著性(F=10.809，P<0.001)。表明Cory B可激活PQ誘導的細胞自噬。

LC3是自噬標志蛋白，一般分為分子量16 000的LC3-Ⅰ和分子量14 000的LC3-Ⅱ。自噬進行時，LC3-Ⅰ會向LC3-Ⅱ轉化[21]。為了進一步驗證Cory B的自噬誘導作用，采用Western blot方法檢測LC的表達水平，并計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。檢測結果顯示，Control組、PQ組、25.0 μmol/L Cory B組、PQ+12.5 μmol/L Cory B組和PQ+25.0 μmol/L Cory B組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別為2.099±0.165、0.785±0.049、4.212±0.355、1.754±0.116和5.099±0.472(n=5)。與PQ組和Control組相比，PQ+25.0 μmol/L Cory B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高(F=172.913，P<0.001)。實驗進一步證實了Cory B可以促進PQ誘導的SH-SY5Y細胞自噬。見圖4。

圖4 SH-SY5Y細胞LC3蛋白表達的Western blot檢測

2.4 Cory B對PQ誘導的SH-SY5Y細胞TDP-43蛋白表達的影響

為了研究Cory B是否可以減少TDP-43蛋白異常聚集，采用Western blot檢測TDP-43(35 000)蛋白的表達。結果顯示，Control組、PQ組和PQ+Cory B組TDP-43(35 000)蛋白的相對表達量分別為0.570±0.330、0.953±0.336、0.449±0.223(n=3)。與Control組相比，PQ組的TDP-43(35 000)蛋白表達明顯增高，而PQ+Cory B組的蛋白表達較PQ組明顯下降(F=229.791，P<0.001)。表明Cory B可以減少PQ誘導的SH-SY5Y細胞異常的TDP-43蛋白聚集。見圖5。

圖5 SH-SY5Y細胞TDP-43蛋白表達的Western blot檢測

3 討 論

本研究根據(jù)先前的研究通過PQ的氧化應激作用誘導細胞產(chǎn)生異常聚集的TDP-43蛋白[12]，制備病理性TDP-43聚集的ALS細胞模型。不僅觀察到Cory B提高了PQ誘導的SH-SY5Y細胞的存活率，還觀察到Cory B可以激活自噬進程，減少異常聚集TDP-43(35 000)蛋白的表達。

LC3B蛋白在SH-SY5Y細胞胞質內(nèi)呈點狀聚集，箭頭(↑)示自噬體生成。Scale bar為100 μm。

許多研究認為，帕金森病、阿爾茨海默病、ALS及亨廷頓病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病與自噬途徑受損導致的蛋白質的異常聚集有關[22]。目前，關于通過調(diào)節(jié)自噬進程治療神經(jīng)變性疾病的研究很多，RAVIKUMAR等[23]在亨廷頓病的細胞模型中進行誘導自噬從而治療疾病的研究；ROSCIC等[24]的研究報道了誘導自噬可以減少亨廷頓病模型中蛋白質異常聚集；STEELE等[25]也發(fā)現(xiàn)一些藥物可以通過誘導自噬減少阿爾茨海默病模型中Aβ蛋白的異常聚集[26]；最近的研究發(fā)現(xiàn)，p-香豆酸(巴西綠色蜂膠中的活性成分)通過自噬作用在Neuro2a細胞中對致病性SOD1引起的神經(jīng)毒性起保護作用[27]。因此，激活自噬可能是清除神經(jīng)變性疾病病理性蛋白質聚集的重要途徑。

Cory B是鉤藤中重要活性物質，為吲哚生物堿中的一種。鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿及Cory B互為同分異構體。鉤藤對心血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)均存在廣泛的保護作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面其應用廣泛，在心血管系統(tǒng)疾病治療方面，其用于治療高血壓、心律失常也并不罕見。Cory B作為一種天然小分子生物堿，具有許多同分異構體，CHEN等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Cory B的一種同分異構體柯諾辛堿，也可以通過Akt/mTOR通路誘導自噬。本文研究結果表明，Cory B能夠減少PQ誘導的SH-SY5Y細胞TDP-43蛋白的異常聚集，提高暴露于PQ的細胞的存活率，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。在自噬方面，本研究結果顯示，Cory B可以促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，并減少分子量35 000的TDP-43蛋白的異常聚集，表明Cory B可能通過促進自噬，分解異常聚集的蛋白質，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但Cory B的具體作用機制目前仍不清楚。以往的研究證明[17]，Cory B主要通過Beclin-1依賴性途徑調(diào)節(jié)細胞自噬。自噬具有細胞保護作用，但這并不意味著我們可以無限制地激活自噬，過度激活自噬可以導致神經(jīng)元萎縮，同時也能引起細胞死亡[29-30]。對自噬進行更好的調(diào)控，可以使其達到治療疾病的目的[31]。鉤藤堿各種成分的作用，至今仍不完全清楚，但其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用，已經(jīng)受到了廣泛的關注。本文的研究結果表明，對細胞自噬進行調(diào)控，可以減少異常的蛋白質聚集，這進一步揭示了神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機制。這類天然小分子生物堿的自噬激活作用，雖然在抗腫瘤、抗衰老以及抗感染等方面有著重要作用，但在神經(jīng)變性疾病治療方面仍需要不斷探索。由于實驗條件的限制，本研究并沒有進一步探究Cory B的自噬通路途徑。但本研究結果為今后探討Cory B的自噬激活作用與ALS之間的關系提供了參考方向，為治療ALS提供了新思路。