阮迎春,彭森,孫鵬鵬,姜維娜,劉志晶,陳樺,

(1 青島大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院病理學系,山東 青島 266071； 2 青島市市立醫(yī)院病理科； 3 青島市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學中心)

利用基因工程技術重編程成體細胞向特定譜系細胞分化是近年來再生醫(yī)學領域的研究熱點，單獨轉(zhuǎn)導Octamer轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)即可觸發(fā)體細胞的重編程[1-3]。有研究將OCT4轉(zhuǎn)導入人毛囊間充質(zhì)干細胞(hHFMSC)后細胞由長梭形變?yōu)槎噙呅?，且逐漸出現(xiàn)一類小而圓的易懸浮細胞，其經(jīng)造血因子誘導可轉(zhuǎn)分化為成熟紅細胞[4]；轉(zhuǎn)錄組測序分析基因表達譜發(fā)現(xiàn)，貼壁細胞中上調(diào)基因富集于胚胎發(fā)育，懸浮細胞中上調(diào)基因富集于造血譜系分化[5]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序檢測OCT4對毛囊、表皮以及皮膚附屬器發(fā)育等組織特異性基因表達的調(diào)控作用，分析貼壁和懸浮細胞去分化程度的差異，探討OCT4對hHFMSC的去分化作用，以及去分化程度對細胞形態(tài)及黏附性的影響，為hHFMSC在再生醫(yī)學等領域廣泛應用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)和試劑

hHFMSC為前期工作中從人毛囊真皮乳頭和真皮鞘中分離并鑒定獲得，用攜帶OCT4的慢病毒載體pLV-EF1α-OCT4-IRES-EGFP及含pVSVG、gag-pol和rev的包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞。然后再用包裝成慢病毒顆粒感染hHFMSC而獲得hHFMSCOCT4。經(jīng)傳代培養(yǎng)12 d后獲得貼壁生長細胞亞群hHFMSCOCT4-adherent，收集hHFMSCOCT4-adherent上層培養(yǎng)液，以800 r/min離心5 min，用完全培養(yǎng)液重懸獲得懸浮細胞亞群hHFMSCOCT4-floating。hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating加含體積分數(shù)0.10的FBS、10 μg/L bFGF和100 kU/L青霉素/鏈霉素的H-DMEM/F12培養(yǎng)液，移入37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

用Trizol提取各細胞樣品總RNA，每組設3個重復樣本。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；以mRNA短片段為模板合成cDNA，經(jīng)過純化、末端修復以及加A尾等處理后進行PCR擴增。用Agilent 2100 Bioanalyzer對構建好的文庫進行質(zhì)檢，使用Illumina HiSeq X Ten測序儀進行測序。采用Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量預處理，并對整個質(zhì)控過程中的reads數(shù)進行統(tǒng)計匯總，htseq-count軟件獲取每個樣本中比對到蛋白編碼基因上的reads數(shù)，用cufflinks軟件計算蛋白編碼基因的表達量(FPKM值)。

1.3 差異基因(DEG)篩選及富集計算

DEG篩選條件為差異倍數(shù)(FC)>2或<-2，且P<0.05。利用DAVID數(shù)據(jù)庫分別對兩兩細胞對比的DEG進行GO功能富集分析，計算Enrichment score。Enrichment score=(m/n)/(M/N)。其中，N為所有基因中具有GO注釋的基因數(shù)目；n為DEG中具有GO注釋的基因數(shù)目；M為所有基因中注釋為某特定GO條目的基因數(shù)目；m為注釋為某特定GO條目的DEG數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計學分析

用basemean值估算各個樣本基因表達量，計算FC；負二項分布檢驗對reads數(shù)進行差異顯著性檢驗；利用超幾何分布檢驗計算GO功能中顯著富集的差異蛋白編碼基因/轉(zhuǎn)錄本列表的P值，對P值進行多重檢驗糾正后得到FDR。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 DEG的功能富集分析

與hHFMSC進行比較，hHFMSCOCT4-adherent中上調(diào)基因共有2 401個，下調(diào)基因共有1 882個；而hHFMSCOCT4-floating中上調(diào)基因3 107個，下調(diào)基因有2 999個。與hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中篩選出1 940個DEG，其中上調(diào)基因有833個，下調(diào)基因有1 107個。表明hHFMSCOCT4-floating與hHFMSC的轉(zhuǎn)錄本差異更為顯著，且貼壁細胞與懸浮細胞是兩種相對獨立的亞群。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對DEG的生物功能進行GO Level 2水平的富集分析，包括生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)。結果顯示，與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-adherent中DEG顯著富集于生物黏附、生物調(diào)節(jié)、細胞過程以及發(fā)育過程等生物過程，并發(fā)現(xiàn)DEG主要分布在細胞連接、細胞外基質(zhì)部分及細胞膜等細胞成分，主要具有結合、通道調(diào)節(jié)因子活性、酶調(diào)節(jié)因子活性、分子轉(zhuǎn)導活性及受體活性等分子功能(圖1)；與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-floating中DEG富集的生物過程主要包括生物黏附、生物調(diào)節(jié)、多器官過程和單器官過程等，DEG主要分布在細胞連接、細胞外基質(zhì)部分、大分子復合物、細胞膜等細胞成分中，并具有結合、催化活性、酶調(diào)節(jié)因子活性、核酸結合轉(zhuǎn)錄因子活性及轉(zhuǎn)運活性等分子功能(圖1)。說明OCT4轉(zhuǎn)導后細胞黏附性、細胞連接組分、器官發(fā)育潛能、信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活性均發(fā)生改變，提示細胞骨架可能發(fā)生重塑，黏附生長的方式可能改變，組織特異性基因轉(zhuǎn)錄失活及多潛能性基因轉(zhuǎn)錄激活共同協(xié)調(diào)器官或組織發(fā)育潛能，從而實現(xiàn)去分化與重編程。

2.2 組織特異性基因的富集分析

本文GO分析OCT4轉(zhuǎn)導對hHFMSC中組織特異性基因表達調(diào)控情況，結果顯示，與hHFMSC相比較，hHFMSCOCT4-adherent中下調(diào)基因富集的組織特異性生物過程有12個(圖2A)，包括間充質(zhì)干細胞分化、表皮細胞命運特異化、表皮發(fā)育、毛囊發(fā)育與成熟、皮脂腺發(fā)育等；hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)基因富集的組織特異性生物過程有3個，包括毛囊形態(tài)發(fā)生、毛囊發(fā)育以及毛囊發(fā)育的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)導OCT4后hHFMSC中毛囊以及皮膚組織的特異性基因表達下調(diào)，OCT4可能通過抑制組織特異性基因的表達而促使hHFMSC去分化(圖2B)。與hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)基因顯著富集于損傷修復與表皮延伸的負調(diào)控、毛囊發(fā)育的調(diào)節(jié)以及體毛水平定向建立的生物過程(圖2C)。hHFMSCOCT4-floating的低黏附性、細胞骨架蛋白表達的改變及緊密連接通路基因的下調(diào)可能與組織特異性基因下調(diào)有關，從而失去了hHFMSC原有的細胞形態(tài)及生長方式。

圖2 OCT4重編程的hHFMSC中組織特異性基因的富集分析

2.3 毛囊、表皮及皮膚附屬器等組織特異性基因的表達情況

與hHFMSC進行比較，hHFMSCOCT4-adherent中有14個特異性基因顯著下調(diào)，其中KRT15、KRT34與表皮發(fā)育及角化相關，GLI2參與表皮細胞分化與基底細胞癌發(fā)生，COL17A1與基底膜形成有關，F(xiàn)ZD3、ALX4等與毛囊發(fā)育有關，RBPJ則在毛囊成熟、皮脂腺發(fā)育、表皮細胞命運的特異化中發(fā)揮重要作用；下調(diào)最顯著的基因為KRT15、FZD3與COL17A1，下調(diào)倍數(shù)分別為-6.92、-4.60和-5.74(圖3A)；而hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)最顯著的特異性基因包括毛囊形態(tài)發(fā)生相關基因FOXQ1、FGF7及毛囊發(fā)育相關基因ALX4，下調(diào)倍數(shù)分別為-9.61、-6.23和-5.43(圖3B)。提示過表達OCT4后，hHFMSC中部分組織特異性基因表達下降，可能在一定程度上消除了基因組定向分化的記憶，抑制了hHFMSC毛囊及皮膚的特異性分化發(fā)育潛能，實現(xiàn)了重編程；與hHFMSCOCT4-adherent相比較，hHFMSCOCT4-floating中體毛水平定向建立的相關基因FZD6和ASTN2、表皮延伸負調(diào)控的相關基因CLASP1以及毛囊發(fā)育的相關基因MYSM1顯著下調(diào)(圖3C)。3組細胞兩兩比較均顯示MYSM1基因表達顯著下調(diào)，MYSM1基因可能是OCT4對hHFMSC發(fā)揮去分化作用的潛在靶點。

藍色表示所有基因富集的GO Level 2條目，紅色表示差異表達基因富集的GO Level 2條目。橫軸為條目名稱，縱軸表示對應條目的基因數(shù)量和其百分比。

3 討 論

OCT4作為一種具有強大重編程作用的多潛能轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于胚胎干細胞(ESC)細胞核內(nèi)，在維持ESC的多潛能性和自我更新中發(fā)揮核心作用[6-8]。OCT4不僅可以維持生殖細胞和腫瘤細胞的“干性”，其異位表達還可提高骨髓間充質(zhì)細胞的“干性”[9]。細胞去分化是指細胞從高度專能性分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變到細胞重新獲得多潛能性的過程；細胞的去分化、轉(zhuǎn)分化以及重編程對于新細胞或組織的再生有重要意義[10]。重編程研究發(fā)現(xiàn)，OCT4、SOX2、KLF4和cMyc(OSKM)可將體細胞重編程為誘導性多能干細胞(iPSC)，還可以將子宮內(nèi)膜息肉與宮頸息肉來源的間質(zhì)干細胞去分化成胚胎樣細胞[11]。

Inf：Infinity，無窮大；-Inf：負無窮大。

轉(zhuǎn)分化研究發(fā)現(xiàn)，OCT4可以促使類胚體中肝細胞向膽管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，還可在內(nèi)皮誘導體系中促使肝癌干細胞向內(nèi)皮樣細胞轉(zhuǎn)分化[12]。

毛囊是可再生的器官并且可進行自我更新[13]。hHFMSC為存在于毛發(fā)真皮乳頭和真皮鞘中的間充質(zhì)干細胞，其免疫原性低且來源廣泛，在體外經(jīng)誘導具有成骨、成軟骨、成脂肪、成神經(jīng)和成肌肉等多向分化潛能[14]。前期研究將OCT4單獨轉(zhuǎn)導入hHFMSC，經(jīng)傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)從長梭形變成多邊形，并逐漸由貼壁生長變成低黏附生長；通過轉(zhuǎn)錄組測序顯示基因表達譜發(fā)生顯著改變，且貼壁細胞與懸浮細胞具有顯著不同的轉(zhuǎn)錄本；二者多潛能性生物過程和多潛能性基因的表達亦不同，即貼壁細胞傾向于胚胎發(fā)育，而懸浮細胞獲得一定造血譜系分化潛能[6]。結合本文研究結果，OCT4轉(zhuǎn)導后下調(diào)基因顯著富集于毛囊、表皮及皮膚附屬器發(fā)育等生物過程，說明轉(zhuǎn)導OCT4使hHFMSC丟失了一部分組織特異性分化發(fā)育專能，從而實現(xiàn)去分化；由于轉(zhuǎn)導OCT4后細胞形態(tài)發(fā)生改變，推測OCT4對hHFMSC的去分化作用可能影響了細胞形態(tài)和骨架結構，且去分化程度的差異可能導致了貼壁細胞和懸浮兩種細胞亞群的產(chǎn)生。還有研究結果證實，RhoA/ROCK通路可通過肌動蛋白細胞骨架聚合參與平滑肌的去分化[15]；microRNA-138可以通過抑制F-肌動蛋白聚合導致軟骨細胞去分化[16]；此外，黏著斑的組裝可誘導軟骨細胞表型改變并發(fā)生去分化，說明細胞骨架蛋白及黏附分子與細胞去分化之間關系密切[17]。

本文對DEG進一步深入分析顯示，OCT4可能通過調(diào)控KRT15、KRT34、ALX4及RBPJ等基因的下調(diào)使hHFMSC去分化，特別是毛囊發(fā)育基因MYSM1在各組細胞表達均下調(diào)，推測其可能是OCT4抑制hHFMSC組織特異性分化的潛在靶點；而懸浮細胞的類圓形形態(tài)以及低黏附性則有可能與hHFMSC更高程度的去分化狀態(tài)相對應，或許與此亞群細胞更易誘導成造血細胞有關。但去分化與細胞骨架重塑及黏附性改變之間的因果關系尚不明確，且OCT4如何調(diào)控組織特異性基因表達的具體分子途徑尚需進一步研究。

綜上所述，過表達OCT4對hHFMSC轉(zhuǎn)錄組進行了重編程，可能通過下調(diào)組織特異性基因的表達在一定程度上抑制了其向毛囊、表皮及皮膚附屬器等組織分化的專能性，從而賦予hHFMSC向造血譜系等多胚層組織及器官的分化潛能，且去分化程度及向造血譜系轉(zhuǎn)分化潛能可能與不同細胞亞群對應的組織特異性基因表達譜有關。本文結果可為hHFMSC在再生醫(yī)學領域應用提供了理論依據(jù)。