厙廣東，陳娟，代小敏，韓霞

動脈粥樣硬化（AS）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、腦卒中等的主要病理基礎(chǔ)[1]。AS作為一種慢性炎癥疾病，局部或全身性的免疫反應(yīng)始終貫穿發(fā)病過程，而巨噬細胞在其中起到重要作用[2]。胰高血糖素樣肽1（GLP-1）是一種新型降糖藥物，具有低血糖反應(yīng)少、對體重影響小的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床，其心血管保護作用也成為臨床關(guān)注的熱點[3]。目前GLP-1對AS的作用及具體機制尚未完全清楚，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠能短期內(nèi)形成類似人類病理特征的AS斑塊，是研究AS病理的良好模型。本研究旨在分析GLP-1是否能影響高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠體內(nèi)巨噬細胞泡沫化及動脈粥樣斑塊發(fā)生發(fā)展，以期為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器6周齡雄性ApoE-/-小鼠（廣東省醫(yī)學(xué)部動物實驗中心）。小鼠體重17～22 g，平均（19.1±1.7）g，均在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～25 ℃。GLP-1（7-36）、GLP抑制劑Exendin（9-39）均購自成都凱捷生物醫(yī)藥有限公司；高脂飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司）；蘇木素-伊紅染色液（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；紅油O染色試劑盒（美國Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（美國Sigma公司）；細胞裂解液（美國Sigma公司）；鼠抗人SR-A、CD36一抗（美國R&D公司）；FITC標(biāo)記的IgG二抗（美國Invitrogen公司）；β-action（美國Santa Cruz公司）；全自動生化儀（邁瑞B(yǎng)S-280型）；顯微鏡（日本Olympus BX41型）。

1.2 小鼠分組及處理將40只ApoE-/-小鼠隨機均分為對照組、模型組、GLP-1組和GLP-1阻斷組，每組各10只。其中，對照組采用普通飼料喂養(yǎng)，其余三組采用高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料為含10%豬油和1.25%膽固醇的飼料，喂養(yǎng)12周。于8周末開始，GLP-1組小鼠每天腹腔注射GLP-1 2.2 nmol/（L·kg），GLP-1阻斷組小鼠每天腹腔注射GLP-1 2.2nmol/（L·kg）和Exendin22 nmol/（L·kg）。兩組均連續(xù)注射4周，對照組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。本研究經(jīng)醫(yī)院動物管理委員會審核通過。

1.3 血清學(xué)檢測喂養(yǎng)12周后采集小鼠靜脈血，待血液凝固血塊收縮后以4000 r/min離心10 min，取上清液，采用全自動生化儀檢測小鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.4 小鼠主動脈病理學(xué)形態(tài)觀察采集血液樣本后剪開右心耳，采用磷酸鹽緩沖液從左心室灌注至右心房流出，分離主動脈并在4% HCHO溶液中過夜，在蔗糖濃度梯度溶液中脫水，包埋、制備組織切片（5 μm），進行HE染色觀察血管內(nèi)斑塊大小、管腔狹窄程度、泡沫細胞形成等病理變化。

1.5 小鼠腹腔巨噬細胞分離及泡沫細胞脂滴形成檢測小鼠處死后在其腹腔中注射2 ml預(yù)冷的PBS緩沖液，輕揉小鼠腹部并將腹腔液吸出，重復(fù)操作3次后，放置于5 ml離心管中，以2000 r/min離心10 min，棄去上清液后加入DMEM重懸；再次離心棄去上清液，在沉淀細胞中加入RPMI 1640培養(yǎng)液重懸；將得到的巨噬細胞在4% HCHO溶液中國定10 min，采用油紅O染色1 min，其后采用60% C3H8O溶液清洗2次、超純水漂洗3次，在顯微鏡下觀察細胞泡沫化狀況并拍照。

1.6 RT-PCR檢測巨噬細胞中CD36、SR-A mRNA表達在獲取的巨噬細胞中加入細胞裂解液提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共35 cycles后72℃延長7 min，分別取CD36、SR-A擴增產(chǎn)物10 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外線透射反射分析儀下拍照。采用凝膠分析系統(tǒng)和ID Image分析軟件對產(chǎn)物進行灰度圖像分析，以β-action為內(nèi)參，計算CD36、SR-A mRNA的相對表達量。引物序列：CD36上游3'- GGAGGCATTCTCATGCCAGT -5'，下游3'- CTGCTGTTCTTTGCCACGTC -5'，SR-A上游3'- ATCTTCCACCAAGGCCAGTG -5'，下游3'- CCTAGACTCCGGCAGACAAC -5'。

1.7 Western blot檢測細胞中CD36、SR-A蛋白表達采用含1%蛋白酶抑制劑的細胞裂解液加入到巨噬細胞中，以12 000 r/min離心15 min來提取上清液中總蛋白；BCA法測定蛋白濃度后，進行SDSPAGE電泳、200 mA恒流電轉(zhuǎn)膜、含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入CD36、SR-A一抗（1:1000稀釋），4℃過夜；二抗室溫孵育60 min，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，采用成像掃描分析系統(tǒng)進行拍照和圖像保存，并計算CD36、SR-A蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠血脂水平比較與對照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平降低（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻斷組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平升高（P＜0.05），（表1）。

表1 各組小鼠血脂水平比較

2.2 各組小鼠主動脈病理學(xué)形態(tài)觀察HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠主動脈血管內(nèi)壁清晰、無斑塊形成；模型組斑塊病變最嚴重，斑塊內(nèi)可見大量膽固醇結(jié)晶，泡沫細胞數(shù)量較多，管腔高度狹窄；與模型組比較，GLP-1組主動脈壁黏膜層只有局部薄層粥樣斑塊，泡沫細胞數(shù)目減少，管腔輕度狹窄；而GLP-1阻斷組與GLP-1組相比粥樣斑塊面積和厚度增加，泡沫細胞和淋巴細胞增加（圖1）。

圖1 各組小鼠主動脈HE染色結(jié)果（40×）

2.3 各組小鼠腹腔巨噬細胞泡沫化狀況比較與對照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組小鼠腹腔泡沫細胞形成明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組泡沫細胞形成減少（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻斷組泡沫細胞形成增加（P＜0.05），（圖2～3）。

圖2 各組小鼠腹腔巨噬細胞油紅O染色結(jié)果（200×）

2.4 RT-PCR檢測巨噬細胞中CD36、SR-AmRNA表達與對照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組巨噬細胞中CD36、SR-A mRNA表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組巨噬細胞中CD36、SR-A mRNA表達減少（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻巨噬細胞中CD36、SR-A mRNA表達增加（P＜0.05），（圖4～5）。

圖3 各組巨噬細胞泡沫化比例比較

圖4 三組腹腔巨噬細胞CD36 mRNA相對表達量比較

2.5 Western blot檢測巨噬細胞中CD36、SR-A蛋白相對表達量與對照組比較，模型組、GLP-1組、GLP-1阻斷組巨噬細胞中CD36、SR-A 蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，GLP-1組巨噬細胞中CD36、SR-A 蛋白表達減少（P＜0.05）；與GLP-1組比較，GLP-1阻巨噬細胞中CD36、SR-A 蛋白表達增加（P＜0.05），（圖6～7）。

圖6 腹腔巨噬細胞CD36、SR-A蛋白表達圖

3 討論

動脈粥樣硬化（AS）是一種由動脈管壁上膽固醇累積引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)疾病。巨噬細胞的泡沫化和凋亡不斷累積可加速動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定和破裂，是促進AS發(fā)生發(fā)展的主要因素[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素樣肽1（GLP-1）可有效改善心肌能量代謝和內(nèi)皮細胞功能障礙，從而減少心血管疾病的發(fā)生[5]。本研究旨在觀察GLP-1對巨噬細胞泡沫化形成及AS發(fā)展的影響，為臨床抗AS治療提供新的思路。

圖5 三組腹腔巨噬細胞SR-A mRNA相對表達量比較

圖7 各組細胞CD36、SR-A 蛋白相對表達量比較

載脂蛋白E基因（ApoE）主要參與機體脂蛋白代謝過程，而ApoE-/-小鼠在高脂飲食條件下，可在較短時間內(nèi)形成類似人體的AS病變從而成為常用的AS動物模型[6]。本研究中我們采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，結(jié)果顯示：與對照組比較，其他三組高脂飲食血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均偏高，且GLP-1組TC、TG、HDL-C、LDL-C水平低于模型組、GLP-1阻斷組TC、TG、HDL-C、LDL-C水平高于GLP-1組，提示高脂飲食可引發(fā)外周血中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平升高，而GLP-1可緩解體內(nèi)脂質(zhì)水平的過度升高。外周血中膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)受巨噬細胞等特殊細胞調(diào)節(jié)，因此推測GLP-1可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞來參與體內(nèi)膽固醇代謝。

泡沫細胞與AS發(fā)展關(guān)系密切，而泡沫細胞的產(chǎn)生主要來源于巨噬細胞和平滑肌細胞中LDL的大量涌入及膽固醇的超負荷沉積[7,8]。正常內(nèi)環(huán)境中，巨噬細胞是血漿脂蛋白代謝的主要調(diào)節(jié)因子[9]。在內(nèi)皮細胞的促炎激活反應(yīng)中，巨噬細胞穿透內(nèi)皮屏障并在動脈內(nèi)膜中積累，成為機體中泡沫細胞的重要來源[10,11]。內(nèi)皮下聚集的泡沫細胞不斷形成超負荷脂質(zhì)的動脈粥樣斑塊，在AS發(fā)生發(fā)展的整個階段中都發(fā)揮著重要作用[12]。此外，巨噬細胞的泡沫化主要來自于細胞中出現(xiàn)膽固醇的沉積，具體表現(xiàn)為膽固醇攝取增加和外流減少，而清道夫受體在其中發(fā)揮重要作用[13]。巨噬細胞表面同時表達LDL受體和清道夫受體，其中LDL受體可介導(dǎo)細胞攝取脂質(zhì)，此過程受到細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的反饋調(diào)節(jié)；而CD36、SR-A等清道夫受體所介導(dǎo)的脂質(zhì)攝入過程不受到細胞內(nèi)脂質(zhì)的反饋抑制，在脂質(zhì)攝入過程還可促進自身表達水平的增加，從而加劇游離和酯化膽固醇在巨噬細胞中的沉積[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，其他三組泡沫細胞形成、CD36、SR-A mRNA及蛋白相對表達量明顯增加，且GLP-1組低于模型組、GLP-1阻斷組低于GLP-1組，提示GLP-1可抑制巨噬細胞的泡沫化狀況，推測原因可能是GLP-1能通過調(diào)節(jié)清道夫受體CD36、SR-A表達從而影響巨噬細胞的泡沫化過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動劑對高血脂癥小鼠有抗AS作用，且巨噬細胞在主動脈壁的浸潤受到明顯影響[17]。二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑可抑制DPP-4對GLP-1的降解，有學(xué)者采用DPP-4抑制劑注射ApoE-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的CD36、SR-A和清道夫受體LOX-1的表達量相對模型組明顯下調(diào)，提示GLP-1表達增加可抑制CD36、SR-A表達[18]。GLP-1類藥物已成為新一代降糖藥物，糖尿病合并AS不僅增加血糖管理難度，還會對患者生命健康造成不利影響。本研究表明GLP-1通過影響巨噬細胞泡沫化從而影響AS進程，也為DM患者并發(fā)AS的綜合防治提供參考。