楊 驍，楊 欣，張曉龍

(1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院科研中心實驗室，陜西 西安 710004;2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院風濕免疫科，陜西 西安 710004;3.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津 300060)

可移動性是造血干祖細胞的關(guān)鍵特征之一，在此基礎(chǔ)上發(fā)展建立的造血干祖細胞移植技術(shù)，已成為難治性血液病、免疫缺陷等疾病的有效治療手段[1]。造血干祖細胞歸巢是指造血干祖細胞通過外周血循環(huán)，經(jīng)一系列復雜的分子間相互作用，進入骨髓造血微環(huán)境(niche)并定位的過程[2]。提升造血干祖細胞的歸巢效率，是突破造血干祖細胞移植技術(shù)瓶頸的重要突破方向。巨噬細胞是niche的重要組成部分，參與niche的形成與穩(wěn)態(tài)調(diào)控，同時其功能對niche中造血干祖細胞自我更新和分化潛能的維持亦具有重要意義[3-5]。然而，目前巨噬細胞在造血干祖細胞歸巢過程中的作用仍未獲得闡明。在本研究中，我們采用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體的方法，建立去除巨噬細胞的小鼠實驗?zāi)Ｐ?，通過小鼠造血干祖細胞的歸巢實驗，探討巨噬細胞在造血干祖細胞歸巢中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級C57BL/6J雄性小鼠，40只，6～8周齡，體重20～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京) 2016-0006]，于西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心[SYXK(陜) 2015-0002]SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。所有動物實驗經(jīng)過西安交通大學動物實驗倫理委員會批準，動物福利倫理批件號：XJTULAC2018-2225。本研究動物實驗依據(jù)優(yōu)化、減少、替代3R原則進行實驗設(shè)計。

1.2主要試劑 小鼠cKit(CD117)、CD11b、F4/80流式抗體(1∶200，Biolegend，美國)，PBS緩沖液(Gibco，美國)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(Sigma-Aldrich，美國)，牛血清蛋白BSA(MP，美國)，cKit磁珠分選試劑盒、磁珠MS分離柱(Miltenyi Biotec，德國)，空白脂質(zhì)體、氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(Formu Max Scientific，美國)，CSFE、RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，美國)，cDNA合成試劑盒(Thermo，美國)，SYBR Green熒光定量盒(Takara，日本)，引物序列合成(北京六合華大基因科技股份有限公司)，CXCL12、SCF ELISA試劑盒(Sigma-Aldrich，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1磁珠分選獲得小鼠骨髓cKit+造血干祖細胞 取2只C57小鼠，脫頸處死，用75%酒精浸泡消毒后，于超凈臺內(nèi)解剖小鼠，剝離肌肉組織，取出四肢股骨、后肢脛骨和髂骨，用PBS-EDTA緩沖液反復灌洗出骨髓細胞。將收集的骨髓細胞用200 目尼龍膜過濾后計數(shù)，1 400 r/min、4 ℃條件下離心10 min，重懸后取2×108個骨髓細胞，以每107細胞加入20 μL cKit磁珠微球，溫和混勻，冰上靜置15 min。每107細胞用5 mL PBS-EDTA緩沖液洗一遍，1 400 r/min、4 ℃條件下離心10 min，吸盡上清。每108細胞用500 mL PBS-EDTA緩沖液。將MS柱子安裝在磁鐵架上(Miltenyi Biotec，德國)，加入3 mL PBS-EDTA緩沖液，重力作用自然流盡。將細胞懸液加入到柱子中，待細胞懸液流凈后，將分離柱中磁性吸附的細胞收集于15 mL離心管中。離心后重懸，取部分細胞(1×106個)標記cKit-Pe-Cy7流式抗體，流式細胞術(shù)檢測磁珠分選后目的細胞純度，所使用流式細胞儀為ARIA II(BD，美國)，具體步驟參見文獻[6]。剩余細胞(2～3×107個)經(jīng)CSFE后染色用于后續(xù)實驗。

1.3.2CFSE染色標記目的細胞 取2×107個上述實驗獲得的cKIT+細胞，用含有0.1% BSA的PBS緩沖液重懸小鼠骨髓cKit+細胞，至終濃度為2×106/mL，加入CFSE原液至終濃度為10 μmol/L。在37 ℃恒溫孵箱(Thermo，美國)孵育10 min。加入5倍體積的預冷培養(yǎng)液，冰上孵育5 min，1 400 r/min低溫離心5 min。PBS緩沖液重懸后，流式細胞術(shù)分析CSFE陽性細胞比例。

1.3.3氯膦酸二鈉脂質(zhì)體去除小鼠骨髓巨噬細胞 低溫儲存的氯磷酸脂質(zhì)體不能馬上使用，需要恢復到室溫才能進行注射尾靜脈注射。取16只C57小鼠，分為氯膦酸二鈉脂質(zhì)體注射組和空白脂質(zhì)體注射對照組，每組各8只。兩組小鼠分別注射100 μL氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(clodronate liposome)或空白脂質(zhì)體，在注射后的24 h或48 h分別處死小鼠，收集骨髓細胞，取部分細胞標記CD11b-PE-Cy7和F4/80-APC抗體，通過流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞去除效率。

1.3.4小鼠骨髓造血干祖細胞歸巢效率的檢測 取C57小鼠作為受體小鼠，按上述實驗方法再次建立10只去除巨噬細胞小鼠模型以供歸巢實驗使用。在注射脂質(zhì)體后的第30小時，將CSFE標記的小鼠造血干祖細胞，經(jīng)PBS重懸后，以每組2×106/只進行尾靜脈注射。受體小鼠分為兩組，分別為對照組(注射空白脂質(zhì)體)和實驗組(注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體去除巨噬細胞)，在移植后第16小時，處死實驗小鼠，每只小鼠使用10 mL預冷PBS液反復灌洗骨腔，收集對照組(4只)和實驗組(5只)小鼠股骨骨髓細胞，采用流式細胞術(shù)檢測CSFE陽性細胞比例；將收集的骨髓細胞提取總RNA，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time RT polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法檢測骨髓微環(huán)境CXCL12、SCF和人血管內(nèi)皮細胞黏附分子1(vascular adhesion molecule 1,VCAM1)mRNA表達水平的變化；收集骨髓灌洗PBS液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)方法檢測去除巨噬細胞后骨髓CXCL12、SCF表達水平的變化。本實驗所采用的供體細胞和受體小鼠均來源于同種C57小鼠。

1.3.5qRT-PCR檢測 將收集的骨髓細胞提取總RNA，采用Nanodrop微量分光光度計(Thermo，美國)測定提取RNA含量與質(zhì)量(1.8

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primers for qRT-PCR

1.3.6ELISA檢測 按試劑盒說明書操作。分別收集對照組和實驗組骨髓PBS灌洗液，置于4 ℃離心機，1 200 g離心20 min，分裝后置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將標準品稀釋為濃度? μg/L的儲液，按梯度稀釋配制標準品；分別設(shè)定空白對照孔、標準樣品孔和待測樣品孔。每孔加入50 μL ELISA Diluent，依次加入100 μL樣品稀釋液，100 μL濃度梯度稀釋后的標準品，100 μL待測樣品，溫和混勻。覆上薄膜，室溫孵育2 h；移除孔內(nèi)液體，每個孔中加入300 μL的洗滌液，沖洗5 次。配制生物素酶標記的檢測抗體工作液，渦旋混勻，每孔加100 μL，封上薄膜，溫和混勻，室溫孵育1 h；移走反應(yīng)孔內(nèi)液體，洗板3 次，甩干后在吸水濾紙上輕拍直至孔內(nèi)液體拍干；在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB底物試劑100 μL，溫和混勻，室溫避光孵育30 min；每孔加入50 μL終止液來終止反應(yīng)，保持終止液加入順序與底物溶液加入順序一致。將96孔板放入酶標儀內(nèi)，于450 nm波長處測量各孔OD值；繪制標準曲線，計算待測樣品的濃度。

1.4統(tǒng)計學方法 應(yīng)用FlowJo軟件對流式數(shù)據(jù)進行分析，使用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料比較采用非配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1制備CSFE標記的cKit+小鼠造血干祖細胞 經(jīng)PBS-EDTA緩沖液灌注沖洗，收集C57小鼠股骨、脛骨、髂骨中的骨髓細胞[7]。隨后行cKit免疫磁珠標記，經(jīng)免疫磁珠分選柱分離后，獲得cKit+目的細胞。將獲得的目的細胞行cKit-PE-Cy7抗體染色標記，通過流式細胞術(shù)方法檢測磁珠分選效率，結(jié)果顯示：目的細胞中，91.6%的細胞為cKit陽性細胞。隨后采用CSFE對磁珠分選獲得的目的細胞進行標記，通過流式細胞術(shù)方法檢測CSFE的標記效率，結(jié)果顯示：目的細胞中97.5%為CSFE陽性細胞。以上結(jié)果表明，已成功制備了CSFE標記的cKit陽性小鼠造血干祖細胞，見圖1。

圖1 磁珠分選cKit陽性細胞純度及CSFE標記效率

2.2建立去除骨髓巨噬細胞小鼠模型 采用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體方法去除小鼠骨髓巨噬細胞。經(jīng)小鼠尾靜脈，注射100 μL氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(Clod組)或空白脂質(zhì)體(Con組)，在注射后第24小時和第48小時，處死實驗小鼠，收集小鼠股骨骨髓細胞，使用CD11b-PE-Cy7和F4/80-APC流式抗體染色標記小鼠骨髓巨噬細胞，通過流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，實驗組巨噬細胞占總細胞比例在第24小時和第48小時低于對照組，實驗組巨噬細胞絕對數(shù)在注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體后的第24小時和第48小時低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 氯膦酸二鈉脂質(zhì)體去除骨髓巨噬細胞效率

表2 氯膦酸二鈉脂質(zhì)體去除骨髓巨噬細胞效率檢測Table 2 Detection of the efficiency of macrophage depletion by lodronate liposomes

2.3去除小鼠骨髓巨噬細胞抑制小鼠造血干祖細胞的歸巢 取同種C57小鼠作為受體鼠，采用上述實驗方法再次建立去除骨髓巨噬細胞小鼠模型，在實驗組注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(Clod組)或?qū)φ战M(Con組)注射空白脂質(zhì)體后的第30小時，將CSFE標記的cKit+小鼠造血干祖細胞，以每只小鼠移植2×106的細胞量，通過尾靜脈注射的方式移植入C57小鼠體內(nèi)。在移植后第16小時，處死實驗小鼠，收集股骨骨髓細胞，行流式細胞術(shù)，檢測歸巢細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，相較于對照組，實驗組中歸巢的造血干祖細胞數(shù)量占骨髓總細胞數(shù)量百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 小鼠cKit+造血干祖細胞歸巢細胞的比例

2.4巨噬細胞缺失導致骨髓微環(huán)境CXCL12和SCF1含量降低 收集2.3部分實驗組與對照組中小鼠骨髓，通過qRT-PCR方法，檢測去除小鼠CD11b+F4/80+巨噬細胞后，骨髓微環(huán)境中CXCL12、SCF1、VCAM1分子的表達。實時定量PCR結(jié)果顯示，實驗組CXCL12分子表達要顯著性低于對照組，實驗組SCF1分子表達顯著性低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而實驗組VCAM1分子表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；ELISA結(jié)果顯示，實驗組CXCL12蛋白表達顯著性低于對照組，實驗組SCF蛋白表達顯著性低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 檢測小鼠cKit+造血干祖細胞歸巢細胞的比例Table 3 Detection of the proportion of homing of cKit+hematopoietic stem/progenitor cells

表4 去除巨噬細胞后骨髓微環(huán)境中CXCl2、SCF和VCAM1的分子與蛋白表達水平變化Table 4 Changes in molecular and protein expression levels of CXCL12, SCF and VCAM1 in macrophage-depleted bone marrow niche

3 討 論

巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中一類具有吞噬防御功能的細胞群體，對于維持機體內(nèi)環(huán)境免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用[8]。已有研究表明，巨噬細胞可以通過直接或者間接的方式調(diào)控造血干祖細胞功能，以維持造血干祖細胞的自我更新、分化和動員，及病理狀態(tài)下的凋亡[9]。同時，骨髓、脾臟、肝臟微環(huán)境中的巨噬細胞對白血病的發(fā)生、發(fā)展亦具有重要作用[6,10-11]。然而巨噬細胞在造血干祖細胞歸巢中的作用仍未見報道。本研究結(jié)果顯示，在氯膦酸二鈉脂質(zhì)體去除巨噬細胞的小鼠模型中，cKit+造血干祖細胞歸巢細胞數(shù)量顯著性低于正常對照組，提示巨噬細胞在造血干祖細胞的歸巢過程中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞可能通過多重機制調(diào)控造血干祖細胞的歸巢過程。目前，注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體是學界公認且常用的清除體內(nèi)巨噬細胞的方法，具有實驗操作簡單、實驗結(jié)果重復度高等顯著優(yōu)勢。然而，由于氯膦酸二鈉脂質(zhì)體去除的巨噬細胞大部分為具有吞噬功能的成熟巨噬細胞[12]。而骨髓中一部分吞噬功能低下的單核/巨噬細胞亞群是否在造血干祖細胞中發(fā)揮同樣的作用，還需要未來更為深入的研究加以闡明。

已有文獻表明，骨髓中CD68+和CD169+的巨噬細胞主要定位于nestin+間充質(zhì)干細胞周圍，通過促進間充質(zhì)干細胞分泌CXCL12，以維持niche中造血干祖細胞的數(shù)量穩(wěn)定[13-14]。同時，外源性SCF移植前作用臍帶血CD34+干細胞后，可以顯著提高其歸巢效率[15]。而VCAM1分子主要表達于血管內(nèi)皮細胞表面，與其配體VLA4介導了選擇蛋白非依賴性滾動穿過內(nèi)皮的過程，其介導的VLA4/VCAM1信號識別模式與CXCL12/CXCR4信號相互代償，引導造血干祖細胞歸巢[16]。本研究檢測了去除巨噬細胞后骨髓微環(huán)境細胞CXCL12、SCF和VCAM1分子mRNA水平和蛋白水平表達的變化，結(jié)果表明，去除巨噬細胞可導致骨髓微環(huán)境CXCL12和SCF分子mRNA水平和蛋白水平的表達顯著降低，而對VCAM1分子mRNA水平和蛋白水平的表達并無影響。該結(jié)果提示骨髓中巨噬細胞可能通過調(diào)控CXCL12/CXCR4與SCF/CD117信號模式來調(diào)控造血干祖細胞歸巢。經(jīng)ImmGEN數(shù)據(jù)庫查證，相較于其他免疫細胞和niche細胞，骨髓巨噬細胞自身CXCL12和SCF分子表達量較低，在造血干祖細胞歸巢過程中，骨髓巨噬細胞通過何種途徑來調(diào)控CXCL12和SCF信號，還有待進一步研究。

造血干祖細胞移植是治療多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤最為有效的治療手段之一，而造血干祖細胞的歸巢效率是決定造血干祖細胞移植成功與否的關(guān)鍵。目前大部分的研究結(jié)論都是基于動物實驗與體外實驗，特別是一些基于細胞層面的研究，然而這些理論是否能夠在人體造血干祖細胞歸巢過程中發(fā)揮轉(zhuǎn)化應(yīng)用的價值，還需要大量的實驗論證。隨著對造血干祖細胞歸巢機制的不斷深入研究，能夠?qū)iche細胞間調(diào)控機制有著更為深刻的理解，進而為提高造血干祖細胞移植成功率提供更為廣闊的思路。