譚樂俊，林林，梅桂雪，林永強(qiáng)（山東省食品藥品檢驗研究院 國家藥監(jiān)局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評價重點實驗室 山東省中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評價工程實驗室，中藥配方顆粒共性技術(shù)山東省工程研究中心，濟(jì)南 250101）

鮮人參為五加科植物人參Panax ginsengC. A.Mey.的新鮮根和根莖，多于秋季采挖，洗凈或經(jīng)保鮮處理。栽培的俗稱“園參”，播種在山林野生狀態(tài)下自然生長的為“林下山參”，習(xí)稱“籽參”[1]。人參入藥歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[2]，鮮人參性平，主要具有補氣強(qiáng)身、益智安神、延年益壽的功效[3]。

2012年，人參被原衛(wèi)生部列入新資源食品后，市場需求激增。為了更好地保護(hù)人參資源以滿足市場需求，我國形成了以東北地區(qū)（主要為吉林長白山地區(qū)）為主的種植區(qū)[4]。人參生長周期較長，一般從播種至成熟收獲需6～8年，大面積的種植極易造成病蟲害相互傳染，參農(nóng)在缺乏專業(yè)技術(shù)指導(dǎo)的情況下，為了確保人參的質(zhì)量和產(chǎn)量，一般多傾向于使用廣譜、高毒、速效的殺蟲殺菌劑。如此亂用藥、高頻率用藥、過量用藥和誤用藥的行為必然引起農(nóng)藥殘留問題，這個問題不僅成為我國人參走向國際市場的主要限制因素[5-7]，也嚴(yán)重威脅到了人們的身體健康。

目前，對人參中農(nóng)藥殘留的檢測常集中于用于食療與美容的人參鮮品的農(nóng)藥殘留[8-9]，缺乏系統(tǒng)研究及安全評價。因此，為了保障鮮人參及其產(chǎn)品的食用、美容和臨床用藥安全，使我國人參盡快走向國際市場，本研究選擇QuEChERS樣品前處理方法，優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件，利用GCMS/MS和LC-MS/MS的高選擇性，建立同時測定鮮人參中63種農(nóng)藥殘留的方法，并采用此方法對34批鮮人參樣品進(jìn)行測定，對其農(nóng)藥殘留情況進(jìn)行系統(tǒng)評估，以期為鮮人參藥材的農(nóng)殘檢測和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

GCMS-TQ8050NX氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC8050-三重四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；Sartorius CP225D電子天平（德國 Sartorius）。

磷酸三苯酯（固標(biāo)，批號：G172525，德國Dr.E公司，0.102 μg·mL-1），禁用農(nóng)藥混合對照品（液標(biāo)，批號：610020-202001，中國食品藥品檢驗研究院，質(zhì)量濃度見表1），硝基苯（批號：GSB05-1845-2008）、六氯苯（批號：GSB05-1846-2008）、七氯（批號：GSB05-2316-2008）、反式-環(huán)氧七氯（批號：GSB05-2317-2008）、順式-環(huán)氧七氯（批號：SB05-291-2015）、氧氯丹（批號：SB05-290-2015）、順式氯丹（批號：SB05-064-2008）、反式氯丹（批號：SB05-065-2008）（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1）。甲醇、乙腈為色譜純，水為Millipore制備的純化水，其他試劑均為分析純。

34批樣品中S1～S14購買于生產(chǎn)廠家A（簡稱A），S15～S34購買于生產(chǎn)廠家B（簡稱B），經(jīng)鑒定，均為吉林產(chǎn)五加科植物人參Panax ginsengC. A. Mey.的新鮮根和根莖，4～5年生，-80℃冰箱保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 GC-MS/MS法 安捷倫DB-17MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度：250℃；恒壓模式，柱前壓力為146 kPa；程序升溫：初始溫度60℃，保留1 min，以30℃·min-1升至120℃，再以10℃·min-1升溫至160℃，再以2℃·min-1升溫至180℃，再以0.5℃·min-1升溫至190℃，再以2℃·min-1升溫至230℃，最后以15℃·min-1的速率升溫至300℃，保持6 min。三重四極桿檢測器；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度：250℃。質(zhì)譜傳輸接口溫度250℃。質(zhì)譜檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

2.1.2 LC-MS/MS法 安捷倫Poroshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，2.7 μm），流動相：以0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）為流動相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）（95∶5）為流動相B，梯度洗脫（0～3 min，33%B；3～15 min，33%→100%B；15～18 min，100%B）；流速為0.3 mL·min-1，柱溫為40℃。以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為電噴霧（ESI）離子源，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜采用電噴霧負(fù)離子模式（ESI-），其余化合物均采用電噴霧正離子模式（ESI+）正離子掃描模式，質(zhì)譜檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。63種農(nóng)藥保留時間、MRM條件具體參數(shù)見表1。

表1 63種農(nóng)藥保留時間、MRM條件參數(shù)Tab 1 Retention time and mass parameters of 63 pesticides

續(xù)表1

2.2 樣品前處理（QuEChERS法）

取供試品勻漿3 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次·min-1）5 min，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次·min-1）3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心（4000 r·min-1）5 min，取上清液9 mL，置預(yù)先裝有QuEChERS凈化材料的分散固相萃取凈化管[無水硫酸鎂600 mg，N-丙基乙二胺200 mg]中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次·min-1）5 min使凈化完全，離心（4000 r·min-1）5 min使凈化完全，離心（4000 r·min-1）5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至2.0 mL，渦旋混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。精密吸取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密量取禁用農(nóng)藥混合對照品1 mL，五氯硝基苯、六氯苯、七氯、反式環(huán)氧七氯、順式環(huán)氧七氯、氧氯丹、順式氯丹和反式氯丹各100 μL，置同一20 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取磷酸三苯酯對照品適量，置100 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.102 μg·mL-1的磷酸三苯酯溶液。

2.3.3 空白基質(zhì)溶液的制備 取未檢出上述63種農(nóng)藥的鮮人參樣品（S21）作為空白基質(zhì)，同供試品溶液的制備方法制成空白基質(zhì)溶液。

2.3.4 隨行回收對照溶液的制備 取鮮人參空白基質(zhì)勻漿（S21）3 g（6份），精密稱定，精密加入對照品溶液0.3 mL，揮至近干，同供試品溶液的制備方法制備隨行回收對照品溶液。

2.3.5 基質(zhì)混合對照品溶液的制備 分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0 mL（6份），置氮吹儀上，40℃水浴濃縮至約0.6 mL，分別加入63種農(nóng)藥混合對照品溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀釋至l.0 mL，渦旋混勻，即得系列（C1～C6）基質(zhì)混合對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取上述鮮人參空白基質(zhì)溶液和基質(zhì)混合對照品溶液（C2）各1 mL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL（LC-MS/MS精密加入水0.3 mL），取續(xù)濾液，按“2.1”項下條件分別進(jìn)樣，結(jié)果表明空白基質(zhì)溶液無干擾。

2.4.2 線性關(guān)系、檢測限和定量限 為減少基質(zhì)效應(yīng)，試驗時采用鮮人參空白樣品作為基質(zhì)，取“2.3.5”項下63種農(nóng)藥系列濃度的基質(zhì)混合對照品溶液，按“2.1”項下條件進(jìn)樣，以相對響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，相對質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得線性回歸方程，結(jié)果顯示63種農(nóng)藥在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995。取信噪比約為10的溶液濃度作為定量限，信噪比約為3的溶液濃度作為檢測限，結(jié)果見表2。

2.4.3 穩(wěn)定性、回收率和精密度試驗 按照“2.3.5”項下基質(zhì)混合對照品溶液的制備方法，得到63種農(nóng)藥基質(zhì)混合對照品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項下條件測定6次，結(jié)果待測成分峰面積無顯著變化，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

按照“2.3.5”項下基質(zhì)混合對照品溶液的制備方法，得到63種農(nóng)藥基質(zhì)混合對照品溶液，按“2.1”項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果精密度的RSD值在0.34%～2.9%，儀器精密度滿足試驗要求，如圖1為鮮人參空白基質(zhì)中63種農(nóng)藥混合對照的MRM總離子流色譜圖。具體結(jié)果見表2。

圖1 鮮人參空白基質(zhì)中63種農(nóng)藥MRM總離子流色譜圖Fig 1 MRM total ions chromatogram of 63 pesticides in fresh ginseng

按照“2.3.4”項下隨行回收對照品溶液的制備方法，得到63種農(nóng)藥隨行回收對照品溶液。按“2.1”項下條件進(jìn)樣，計算得加標(biāo)回收率在81.2%～118.8%，說明采用QuEChERS前處理操作不僅簡單快速，而且準(zhǔn)確度好，符合檢測要求。具體結(jié)果見表2。

表2 63種農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢測限、回收率及精密度Tab 2 Regression equation，linearity，limit of detection，recovery and instrument precision of the 63 pesticides

續(xù)表2

2.5 樣品檢測結(jié)果

根據(jù)以上建立的方法對34批鮮人參樣品進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示所檢測63種農(nóng)藥中，檢出了4種，分別為六氯苯、五氯硝基苯、α-六六六和β-六六六（見表3）。有22批樣品檢出五氯硝基苯，測定結(jié)果在0.01～43.3 mg·kg-1，檢出率64.7%，14批超過定量限0.1 mg·kg-1，不合格率41.2%。有14批檢出六氯苯，測定結(jié)果在0.01～1.93 mg·kg-1，檢出率41.2%，5批超過定量限0.1 mg·kg-1，不合格率14.7%。有3批檢出六六六，2批檢出α-六六六，測定結(jié)果為0.012～0.016 mg·kg-1；2批檢出β-六六六，測定結(jié)果均為0.01 mg·kg-1，未超過定量限0.1 mg·kg-1，六六六檢出率8.8%。綜上，34批次鮮人參樣品的總體檢出率為64.7%，不合格率達(dá)到41.2%。

表3 鮮人參樣品農(nóng)藥殘留檢出結(jié)果Tab 3 Determination of pesticides residues in fresh ginseng samples

3 討論

3.1 目標(biāo)化合物的選擇

人參為多年生草本植物，在生長過程中病蟲害時有發(fā)生，人參育苗及種植過程中常會使用有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類等農(nóng)藥，綜合參考相關(guān)文獻(xiàn)，最終確定以鮮人參中63種農(nóng)藥殘留為目標(biāo)分析化合物[7-10]。

3.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過測定農(nóng)藥對照品溶液，以全掃描的方式得到農(nóng)藥的一級質(zhì)譜圖，得到每種農(nóng)藥的分子離子峰，對每種農(nóng)藥的分子離子峰進(jìn)行離子掃描，得到碎片離子信息，然后優(yōu)化其碰撞電壓等參數(shù)，使每種農(nóng)藥的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大，按照優(yōu)化后的GC-MS/MS和LC-MS/MS質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)樣分析。

3.3 檢測結(jié)果分析

隨著鮮人參在臨床入藥、食療和美容方面需求的日益增加，其安全性和質(zhì)量問題越來越受到人們的關(guān)注。為了滿足其日益增長的市場需求，種植戶在人參種植過程中經(jīng)常盲目濫用農(nóng)藥。農(nóng)藥噴灑后，約80%會進(jìn)入環(huán)境中，進(jìn)而在水、土壤等環(huán)境介質(zhì)中傳播，并隨著食物鏈的傳遞在生物體內(nèi)累積，從而使整個生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞[11]。有機(jī)氯類農(nóng)藥的降解半衰期長，理化性質(zhì)穩(wěn)定，能在土壤和生物體內(nèi)貯存，再加上人參生長周期長，農(nóng)藥極易在其生長過程中富集，故經(jīng)常檢出此類農(nóng)藥，屬高殘留農(nóng)藥[12-13]。

本文在34批次鮮人參樣品中檢出農(nóng)藥均為有機(jī)氯類。五氯硝基苯，不合格批次均為A公司提供，14批次均被檢出且均超限，其中9批超過定量限10倍以上，3批超過定量限100倍以上，最高檢出批次超出定量限432倍。購買于B公司的S15～S34，20批次五氯硝基苯檢出率為40%，但不合格率為0%。六氯苯5批超過定量限的批次均購買于A公司，且3批超過定量限10倍以上，最高檢出批次超出定量限18倍。購買于A公司的S15～S34中，20批次六氯苯檢出率為5%，不合格率為0%。檢出農(nóng)藥六六六的3批次也均購買于A公司。分析結(jié)果可知，兩種農(nóng)藥的殘留除了直接來自不規(guī)范使用農(nóng)藥，還間接地來自土壤。34批鮮人參購買于兩個廠家，雖生長年限相近，產(chǎn)地均為吉林，但可能因其采收產(chǎn)區(qū)不同，產(chǎn)區(qū)的藥農(nóng)用藥的規(guī)范性不同，土壤等環(huán)境介質(zhì)不同，不同廠家人參的農(nóng)藥殘留量存在一定差異。

3.4 檢出農(nóng)藥分析

有機(jī)氯類農(nóng)藥有類雌激素和致癌、致畸、致誘變作用[14]，容易通過食物鏈傳遞到人體，大量堆積于肝、腎、脾等組織中，嚴(yán)重危害人體健康。我國政府于1983年已決定停產(chǎn)，并于1984年停止使用此類農(nóng)藥[15]。人參中登記的農(nóng)藥主要包括惡霉靈、枯草芽孢桿菌丙環(huán)唑、嘧菌酯、異菌脲、苯醚甲環(huán)唑、代森錳鋅、多抗霉素、王銅乙霉·多菌靈、嘧菌環(huán)胺、哈茨木霉菌、咯菌腈、枯草亞寶多菌靈、噻蟲·咯·霜靈和霜脲·錳鋅[16]。五氯硝基苯和六氯苯雖不是禁用農(nóng)藥，但也不包括在登記使用農(nóng)藥范圍內(nèi)，兩種農(nóng)藥的高殘留不僅影響其質(zhì)量，威脅人的健康，也影響其在國際市場的競爭力。

本研究應(yīng)用QuEChERS樣品前處理方法，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，利用MS/MS的高選擇性，建立了同時測定鮮人參中63種農(nóng)藥殘留的方法。該方法簡單、準(zhǔn)確、靈敏度高，不僅對保障人們安全食用鮮人參具有積極意義，也為其農(nóng)殘的檢測和防控措施提供參考。