任帥 王中秋

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)放射科，南京 210029

【提要】 外泌體是一種包含RNA、DNA片段及蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)的納米級(jí)微囊泡，由多泡體與胞膜融合后分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。外泌體內(nèi)的微小RNA(miRNA)主要參與干細(xì)胞的分化、血細(xì)胞的生成、器官的形成、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等。外泌體miRNA因其較高的穩(wěn)定性和易于檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是具有潛力的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。本文就外泌體miRNA在胰腺癌診斷中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

胰腺癌早期診斷困難、手術(shù)切除率低且惡性程度高，患者預(yù)后差，5年生存率低于5%[1-2]。在胰腺癌發(fā)病初期明確診斷可顯著改善患者的預(yù)后、提高其生存質(zhì)量，因此如何進(jìn)行早期精準(zhǔn)診斷成為胰腺癌研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。外泌體是一種包含RNA、DNA及蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)的納米級(jí)囊泡[3-4]，在人體內(nèi)各種體液中分布廣泛[5]，任何細(xì)胞均可以分泌外泌體。由于外泌體內(nèi)的微小RNA(microRNA,miRNA)具有穩(wěn)定性較好且易于檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是具有潛力的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)[6-7]。本文就外泌體miRNA在胰腺癌診斷中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

一、外泌體源性miRNA概念及生物學(xué)特征

外泌體是一種由多泡體與胞膜融合后分泌到細(xì)胞外環(huán)境中的納米級(jí)囊泡[3-4]，直徑30～150 nm，密度為1.10～1.21 g/ml，具有來(lái)源細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜，含有多種miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分[8]。外泌體的生成可以簡(jiǎn)單地概括為細(xì)胞內(nèi)吞產(chǎn)生的小囊泡融合形成核內(nèi)體，胞質(zhì)內(nèi)的生物活性分子進(jìn)入核內(nèi)體后形成多泡體；多泡體與胞膜融合并釋放到胞外，最終形成外泌體[9-10]。

外泌體內(nèi)包含多種長(zhǎng)鏈及短鏈RNA，統(tǒng)稱為外泌體源性RNA。其中，miRNA是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，亦稱為外泌體源性miRNA。據(jù)報(bào)道共有4 934種miRNA存在于不同來(lái)源的細(xì)胞或組織外泌體中[11]。外泌體源性miRNA是臨床上有巨大潛力的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，與蛋白質(zhì)相比，外泌體源性miRNA更加穩(wěn)定，可通過(guò)包裹在囊泡結(jié)構(gòu)內(nèi)而逃脫核糖核酸酶的消化；可在一定程度上反映出供體細(xì)胞內(nèi)的分子變化，同時(shí)又可作為分泌性信號(hào)因子進(jìn)而影響到受體細(xì)胞的變化[12]。腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的miRNA會(huì)被包載在外泌體內(nèi)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移及耐藥性等，因此可作為腫瘤診斷的新型標(biāo)志物。

與其他來(lái)源的miRNA相比，外泌體源性miRNA作為診斷標(biāo)志物具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)易于檢出，唾液、血液、尿液、乳汁和腦脊液在內(nèi)的體液中檢測(cè)到的miRNA大多數(shù)來(lái)源于外泌體[13]。(2)可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，而部分復(fù)合物存在于外泌體內(nèi)，從而在循環(huán)過(guò)程中逃脫核糖核酸酶的降解以保持miRNA的活性與穩(wěn)定性[14]。外泌體內(nèi)含有豐富的miRNA，且大部分與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體蛋白結(jié)合而存在于外泌體內(nèi)。Yan等[15]報(bào)道，結(jié)直腸癌患者血清中分離出的外泌體miRNA生物穩(wěn)定性更好。

二、外泌體源性miRNA的分離與檢測(cè)

外泌體的分離有多種方法，如離心法、超濾法、免疫親和法、聚乙二醇(PEG)-base沉淀法等[16-21]。離心法可分為超速離心法和密度梯度超速離心法，前者是目前提取外泌體最常用的方法，被視作外泌體分離的"金標(biāo)準(zhǔn)"，其優(yōu)勢(shì)是單次提取量高，但缺點(diǎn)是耗時(shí)、設(shè)備昂貴且回收率較低，多次離心操作容易破壞外泌體囊泡的完整性[16-17]。當(dāng)對(duì)外泌體的濃度有較高要求時(shí)，可采用密度梯度超速離心，然而其步驟復(fù)雜、涉及工作量較大，所需時(shí)間較長(zhǎng)，不適合于臨床上大樣本的外泌體分離。超濾法是利用不同截留相對(duì)分子質(zhì)量的超濾膜對(duì)樣品進(jìn)行選擇性分離，從而獲得外泌體，其分離效率取決于樣品中懸浮物的大小和分子量。超濾法的優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)便、效率較高，對(duì)外泌體的生物活性影響較小，其缺點(diǎn)是有可能阻塞濾孔，影響膜的壽命，導(dǎo)致分離效率的下降，且同樣存在純度不高的問(wèn)題[17-18]。外泌體富含特定的膜蛋白，如CD9、CD63、ALIX等，免疫親和法正是通過(guò)對(duì)外泌體特有的蛋白進(jìn)行標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。其優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單，可分離得到較高純度的外泌體，且外泌體的完整形態(tài)不受影響，但缺點(diǎn)是效率低，只能分離具有陽(yáng)性標(biāo)記的外泌體，且外泌體內(nèi)含物如RNA、DNA片段或蛋白質(zhì)等的生物活性容易受到pH值或鹽溶液濃度的干擾，不利于下游實(shí)驗(yàn)開(kāi)展[21]。聚乙二醇-base沉淀法的原理是通過(guò)與游離水分子的結(jié)合，從而使溶解度小的外泌體析出；其缺點(diǎn)是外泌體純度較低、回收率低，因雜蛋白的存在而容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等[16,19]。

目前，針對(duì)外泌體miRNA的研究主要是基于外泌體miRNA的總濃度、定量PCR以及miRNA芯片技術(shù)，更多關(guān)注提取到的miRNA的表達(dá)和定量。目前的研究工作主要集中在miRNA的表達(dá)譜分析，對(duì)后續(xù)生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證較少，在診療方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用更少。上述針對(duì)外泌體miRNA的檢測(cè)方法面臨外泌體miRNA含量低、樣本消耗量高以及需要RNA提取等挑戰(zhàn)，精確度與純度往往影響后期檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性[22]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始聚焦于太赫茲(THz)光譜在核酸構(gòu)象和功能研究中的應(yīng)用，但因檢測(cè)靈敏度低限制了其潛在生物傳感應(yīng)用[23-24]。最近的一項(xiàng)研究應(yīng)用鏈置換擴(kuò)增技術(shù)和金屬納米粒子的信號(hào)增強(qiáng)，制備了一種偏振無(wú)關(guān)的THz超材料生物傳感器，結(jié)果表明，其具有較高靈敏度的miRNA檢測(cè)能力[25]。因此，基于新型THz超材料的生物傳感器在miRNA的檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用前景。

三、外泌體源性miRNA在胰腺癌診斷中的研究

胰腺癌早期無(wú)癥狀，手術(shù)切除率低且惡性度極高，患者預(yù)后差。盡管CA19-9被廣泛用于臨床上胰腺癌的篩查，但其表達(dá)水平在某些胰腺良性病變中也會(huì)升高[26]，導(dǎo)致其診斷的靈敏度下降。多項(xiàng)研究表明，外泌體miRNA在胰腺癌的診斷、鑒別診斷、治療反應(yīng)及預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮重要作用[27-30]。一項(xiàng)關(guān)于癌癥相關(guān)的外泌體研究結(jié)果顯示，較非癌細(xì)胞，癌細(xì)胞可釋放更多的外泌體直接到達(dá)腫瘤微環(huán)境或循環(huán)系統(tǒng)[31]，表明外泌體及其內(nèi)含物miRNA可作為潛在的篩查生物標(biāo)志物，為胰腺癌的早期篩查提供幫助[32]。Xu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，早期胰腺癌患者血清外泌體中的miR-196a和miR-1246表達(dá)水平明顯升高。Madhavan等[33]研究了循環(huán)外泌體內(nèi)的miRNA與蛋白質(zhì)聯(lián)合檢測(cè)在胰腺癌組與非癌組鑒別中的價(jià)值，二者聯(lián)合后的診斷靈敏度與特異度分別為100%和80%。Lai等[34]運(yùn)用RT-qPCR法對(duì)29例胰腺癌和11例慢性胰腺炎患者血漿中的外泌體miRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與慢性胰腺炎比較，胰腺癌患者外泌體內(nèi)miR-21、miR-30c、miR-10b及miR-181a的表達(dá)水平明顯升高，而let-7a的表達(dá)水平下降。Que等[35]對(duì)胰腺癌組(早期胰腺癌9例、晚期胰腺癌13例)與對(duì)照組(慢性胰腺炎與壺腹癌各6例、胰腺良性病變7例、健康者8例)患者的血清外泌體miRNA進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，外泌體來(lái)源的miR-21與miR-17-5p在胰腺癌組患者血清表達(dá)水平明顯升高，且miR-17-5p在晚期胰腺癌患者的表達(dá)水平明顯升高。Goto等[36]研究發(fā)現(xiàn)，與22例健康對(duì)照者比較，32例胰腺癌、29例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)患者血清外泌體內(nèi)的miR-191、miR-21、miR-451a表達(dá)水平明顯升高，提示血清miR-191、miR-21、miR-451a可作為胰腺癌或IPMN的早期診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物。另有多項(xiàng)研究表明，與健康對(duì)照者相比，胰腺癌患者血清或血漿外泌體內(nèi)的多個(gè)miRNA表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，miR-1231表達(dá)水平明顯下調(diào)[37]，miR-196a、miR-1246、miR-21、miR-483-3p、miR-200b、miR-10b表達(dá)水平明顯上調(diào)[28,38-41]。

綜上所述，外泌體miRNA在胰腺癌的早期診斷及鑒別診斷中具有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。借助外泌體miRNA對(duì)胰腺癌的生物學(xué)行為進(jìn)行評(píng)價(jià)，有助于盡快地幫助醫(yī)師制定臨床治療方案，對(duì)于改善患者預(yù)后、提高患者生存質(zhì)量具有重要價(jià)值。

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