宋洪艷，趙 航，嚴 霞，史曉鳳，馬 君

中國海洋大學光學光電子實驗室，山東 青島 266100

引 言

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)是指聯(lián)苯上的氫被氯取代形成的一類有機化合物,一度被廣泛應用于各種工業(yè)領(lǐng)域。PCBs極難降解，具有致癌、高脂溶性特點，容易在海產(chǎn)品中富集,且能夠通過大氣和水體長距離遷移,因此殘留在環(huán)境中的PCBs會對人類健康和整個生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成持續(xù)威脅[1]。所以有必要開發(fā)快速監(jiān)測和定量的檢測方法。

目前檢測海洋中PCBs的傳統(tǒng)方法主要有高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用[2]。樣品預處理復雜、實驗周期長、成本高等缺點限制了其現(xiàn)場的應用。表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一種新興的化學分析技術(shù)。該方法因其極高的靈敏度、“指紋”特性和受水體影響小等優(yōu)勢在原位探測痕量污染物和結(jié)構(gòu)分析等方面引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。如用β環(huán)糊精來修飾基底探測PCBs，靈敏度可以達到10-7mol·L-1[5]。利用修飾目標物的方法實現(xiàn)間接檢測[6]。

但是對于分子在增強基底上的吸附特性遲遲沒有統(tǒng)一的定論。研究人員最常利用密度泛函理論(density functional theory，DFT)研究分子在金屬納米材料表面的吸附特性[7-8]。如PCB52的一側(cè)苯環(huán)可以嵌入環(huán)糊精的空腔且形成穩(wěn)定的吸附構(gòu)型[9]。DFT方法用于對比研究PCB52吸附在不同銀原子簇上的拉曼光譜、吸附構(gòu)象和增強因子，得出拉曼增強源自于Cl—Ag鍵的電子轉(zhuǎn)移共振放大[10]。實際海水中PCBs種類繁多，結(jié)構(gòu)極其相似，其自身在增強基底上的吸附差異最終會影響SERS峰的峰強和峰形，給定性定量分析造成巨大的困難。金納米顆粒作為經(jīng)典SERS增強基底，在與PCBs分子的吸附規(guī)律以及吸附差異方面鮮有人研究。所以探究不同結(jié)構(gòu)的PCBs分子在金表面的吸附特性規(guī)律對海洋環(huán)境現(xiàn)場檢測和定性定量分析具有重要的理論意義，有望推廣應用于海洋中廣泛存在的芳烴污染物上。

本文以金溶膠作為SERS增強基底，對海洋中常見的結(jié)構(gòu)相似的4,4’-二氯聯(lián)苯(PCB15)、2,4,4’-三氯聯(lián)苯(PCB28)、2,2’,4,4’-四氯聯(lián)苯(PCB47)和3,3’,4,4’-四氯聯(lián)苯(PCB77)進行了SERS探測及其吸附特性研究。通過對比分子結(jié)構(gòu)并分析特征峰位的差異，并輔以DFT計算，探究PCBs的SERS光譜規(guī)律。然后建立PCBs-Au吸附模型探究分子結(jié)構(gòu)對吸附形態(tài)的影響。最后對系列濃度PCBs進行光譜探測，分析吸附差異給SERS定量帶來的影響，為未來現(xiàn)場快速定量檢測海洋環(huán)境中的PCBs提供研究基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

氯化金四水合物(含金量47.8%)，檸檬酸三鈉(99.0%)，氯化鈉(99.0%)，甲醇(分析純)均從國藥集團化學試劑公司(上海)購買。4,4’-二氯聯(lián)苯(PCB15，99.9%)、2,2’,4,4’-四氯聯(lián)苯(PCB47，99.0%)和3,3’,4,4’-四氯聯(lián)苯(PCB77，99.0%)購于Dr.Ehrenstorfer公司(德國)，2,4,4’-三氯聯(lián)苯(PCB28，99.8%)購于Sigma-Aldrich生命科學公司(美國)。

1.2 金納米溶膠的制備

金納米溶膠在Frens方法的基礎(chǔ)上修改制備[11]。將30 mL，濃度為1.6 mmol·L-1的氯金酸溶液加熱至沸騰，在攪拌下(600 r·min-1)一次性加入10 mL，濃度為5.4 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液，持續(xù)加熱攪拌10 min，溶液顏色會從最初的藍紫色變?yōu)樽霞t色。然后降低轉(zhuǎn)速至360 r·min-1，溫度設定為140 ℃，50 min后停止加熱攪拌，自然冷卻至室溫后4 ℃避光保存。用紫外-可見分光光度計(CHK-26813，Jinkai)測試溶膠吸光度，用掃描電子顯微鏡(S4800，Hitachi)表征納米粒子形貌，設定加速電壓為20 kV，發(fā)射電流為8.2 μA。

1.3 光譜采集與處理

本文中提供的所有拉曼光譜實驗數(shù)據(jù)，均以中心波長為785 nm的半導體激光器(ADR-1805，Sfolt)作為光源，“Y”形探頭(RPB，InPhotonics)收集散射信號。采用便攜式拉曼光譜儀SEED3000(Oceanhood，4 cm-1)采集光譜數(shù)據(jù)。通過對固體直接采集獲得常規(guī)拉曼光譜，到樣功率100 mW，積分時間5 s。SERS光譜檢測時取一定量的PCBs溶液與濃度為5 mol·L-1的NaCl溶液混合，目的是調(diào)整待測液鹽度模擬海洋環(huán)境。然后再與金溶膠混合(v/v=2∶3)進行SERS檢測。到樣功率200 mW，積分時間10 s。

1.4 DFT計算

在優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)和計算真空拉曼時選擇B3LYP/6-31+G(d)進行計算。在優(yōu)化PCBs-Au體系和計算相應頻率時，對Au原子的計算采用基組lanl2dz，其余原子的計算依舊采用6-31+G(d)基組。計算最終可以得到分子的拉曼頻率，并選用矯正因子0.974 8進行了全譜矯正。

振動基頻的歸屬采用勢能分布(potential energy distribution，PED)計算方法。該方法對具體的分子首先選取適當?shù)膬?nèi)坐標,按照分子所屬的點群進行簡正振動的對稱分類，構(gòu)造每個對稱類的對稱坐標,并且求出變換矩陣U。把這些必要的數(shù)據(jù)輸入PED程序之后，最終得到振動基頻的貢獻大小，體現(xiàn)在光譜中就是某一個特征峰是多個振動模式耦合而成，每一個振動模式所占比用貢獻度(單位：%)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCBs結(jié)構(gòu)差異在拉曼光譜中的體現(xiàn)

本文在對四種PCBs固體進行檢測的同時，計算了各自的空間結(jié)構(gòu)和振動模式。分析了結(jié)構(gòu)差異在拉曼光譜中的體現(xiàn)，為更好的區(qū)分檢測PCBs奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如圖1所示(具體峰位和振動歸屬見表1)，四種物質(zhì)的取代氯依次增加，其中PCB15與PCB28為對稱和非對稱取代，PCB47與PCB77為對稱取代，區(qū)別在于是否處于橋鍵鄰位，基本能夠代表低氯聯(lián)苯物質(zhì)特性。四種多氯聯(lián)苯共性特征峰，包括橋鍵伸縮振動，出現(xiàn)在1 290 cm-1位置附近，代表苯環(huán)伸縮振動的1 595 cm-1振動峰位置基本相同，典型的環(huán)呼吸振動分布于1 000 cm-1附近。

圖1 四種PCBs的計算和實測拉曼光譜Fig.1 The calculated and experimental Raman spectra of PCBs

表1 四種PCBs的計算、實測拉曼和計算、實測PCBs-Au峰位及振動歸屬Table 1 Calculated,experimental normal Raman of PCBs and PCBs-Au vibrational frequencies and vibration assignment

續(xù)表1

同時由于氯原子數(shù)量以及取代位置的不同，在拉曼譜上也體現(xiàn)出了較明顯的差異。有兩個取代Cl的PCB15的軸對稱結(jié)構(gòu)使其拉曼振動模式成對、對稱出現(xiàn)并最終耦合表現(xiàn)為一個振動峰，所以在拉慢光譜中PCB15特征峰數(shù)量比其他三種聯(lián)苯明顯更少。而PCB28相較于PCB15在橋鍵的鄰位上多出一個Cl原子，分子對稱性的破壞使振動態(tài)之間的耦合度減小，拉曼峰更為復雜。例如，在400和554 cm-1出現(xiàn)了表示HCCC面外彎曲和環(huán)扭曲的振動峰，1 145，1 182，1 238和1 373 cm-1處出現(xiàn)了HCC面內(nèi)彎曲振動峰。并且在1600 cm-1附近出現(xiàn)劈裂，表明PCB28兩個苯環(huán)出現(xiàn)不對稱伸縮。PCB47相較于PCB15在橋鍵的兩側(cè)鄰位各多出一個取代氯，并且同側(cè)苯環(huán)上這兩個Cl原子不相鄰，致使C—Cl鍵和C—H鍵振動進一步多樣化，在400～900和1 100～1 500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)不僅出現(xiàn)面內(nèi)伸縮振動(400和684 cm-1)，還有面內(nèi)、面外彎曲振動(829，1 491和481 cm-1)。PCB77同樣是四個取代氯，但是其位置與PCB47不同，從鄰位換成了間位，兩個C—Cl鍵的靠近使其伸縮振動變得更加明顯，如437，560，672和859 cm-1位置。

隨著取代氯數(shù)量的增加，C—Cl鍵和C—H鍵振動逐漸增強；C—Cl鍵位置距離越遠，C—H，C—Cl以及苯環(huán)振動越復雜，這為從光譜角度區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的多氯聯(lián)苯提供了理論依據(jù)。

2.2 PCBs分子在金表面的吸附能力

研究發(fā)現(xiàn)SERS特征峰位和形狀變化與其在基底表面的吸附狀態(tài)有關(guān)，研究分子吸附特性有助于明確SERS作用機理，定量分析更準確。

四種PCBs的SERS光譜漂移最為明顯的是橋鍵振動峰和環(huán)伸縮振動峰(圖2)。如PCB28的橋鍵特征峰從1 288 cm-1紅移至1 264 cm-1，環(huán)伸縮峰位從1 596 cm-1紅移至1 569 cm-1，這是由于分子吸附在金基底上后，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移所致[10]。但是PCB47的橋鍵振動峰從1 289 cm-1藍移至1 319 cm-1，是因為PCB47橋鍵上的電子云密度增加使鍵級降低導致[12]。

圖2 PCBs的計算和實測SERS光譜(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.2 The calculated and experimental SERS spectra of PCBs(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

為進一步研究結(jié)構(gòu)差異對吸附特性造成的影響，我們建立了PCBs-Au模型體系。由于分子與基底的相互作用僅與表面少數(shù)幾個原子有關(guān)，綜合考慮計算精度和時間耗費，模型中采用Au原子簇來模擬金納米球表面。為了更好地理解四種PCBs與金原子簇的不同結(jié)合行為，對四種PCBs-Au復合物各自的結(jié)合能進行了比較。結(jié)合能計算公式如式(1)

ΔE=EPCBs-Au-(EPCBs+EAu)

(1)

式(1)中，EPCBs，EAu和EPCBs-Au分別表示PCBs，Au簇和PCBs-Au復合物的能量。計算結(jié)果顯示它們的結(jié)合能分別為-6.46 kcal·mol-1(PCB15)，-3.01 kcal·mol-1(PCB28)，-0.31 kcal·mol-1(PCB47)和-1.95 kcal·mol-1(PCB77)。結(jié)合能的絕對值越大意味著分子與基底結(jié)合能力越強，顯然最容易吸附在金表面的是PCB15，然后依次是PCB28和PCB77，最難吸附的是PCB47。這將直接影響在SERS檢測過程中靈敏度以及線性規(guī)律范圍，后續(xù)會進一步討論。

2.3 PCBs分子在金表面的吸附形態(tài)

四種多氯聯(lián)苯吸附行為的差異還需歸結(jié)到其各自結(jié)構(gòu)上來。對四種吸附模型的拉曼振動頻率進行計算，結(jié)果如圖2所示。計算與實測SERS光譜能夠較好的吻合。四種多氯聯(lián)苯在1 300和1 600 cm-1位置附近的峰與實測共性特征峰基本重疊，表示環(huán)伸縮的峰均發(fā)生了紅移，證明PCBs通過π軌道吸附。吸附模型顯示Au簇位于PCBs一側(cè)苯環(huán)C—C頂部的橋接位置，并產(chǎn)生不同數(shù)量的理論吸附構(gòu)形(圖3)。分子吸附時靠近基底的苯環(huán)與金表面呈現(xiàn)固定的角度(PCB15-Au：76.64°，PCB28-Au：77.77°，PCB47-Au：75.71°，PCB77-Au：76.52°)，金簇邊緣反應特性導致此構(gòu)型比苯分子平行于金簇表面堆疊的構(gòu)型更穩(wěn)定[13]。這些角度雖有差異但總體相近，說明Cl取代的差異對于分子吸附時的方向影響有限。因為PCB15分子結(jié)構(gòu)具有高度軸對稱性，所以類似的具有相同結(jié)合能的理論結(jié)合位點還有三個。PCB28的結(jié)合位點減少到3個。PCB47與PCB77分子在PCB28結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上橋鍵鄰位或間位再次增加了一個Cl原子，所以均只剩下兩個結(jié)合位點。

圖3 PCBs在金表面的吸附形態(tài)(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.3 Adsorption configuration of PCBs on gold surface(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

進一步通過四種物質(zhì)吸附前后苯環(huán)二面角大小以及變化量(表2)的對比來分析吸附行為與空間位阻的內(nèi)在規(guī)律。體積較大的氯原子進行取代會使其自由旋轉(zhuǎn)受到限制，鄰位的氯原子會增大旋轉(zhuǎn)的空間位阻效應，最終體現(xiàn)在聯(lián)苯二面角上。自由狀態(tài)下，PCB15二面角為39.96°，與此相近的還有PCB77(39.79°)。PCB28的二面角增大到57.57°。PCB47的二面角最大為98.06°，接近垂直。這與位阻效應理論得出的結(jié)果相符，PCB15和PCB77的位阻程度較小，其次是PCB28，位阻程度最大的是PCB47。在吸附后，二面角均有不同程度的減小，變化最小的是PCB77(減小了1.98°)，變化最大的是PCB47(減小了22.38°)，幾乎相差11倍，原因是PCB47較大的空間位阻會使分子剛性化，這一特性會增加吸附難度，間接解釋了PCB47的結(jié)合能最低，結(jié)合能力最弱的結(jié)論。據(jù)此證明吸附行為會導致位阻效應減小，進而表現(xiàn)為苯環(huán)二面角度降低趨勢。真空下分子位阻效應越大，吸附行為對二面角的改變量就越多，同時也意味著吸附困難增大，這與結(jié)合能的計算結(jié)果吻合。

表2 PCBs吸附前后苯環(huán)二面角以及對應的變化量Table 2 The dihedral Angle of benzene ring before and after adsorption of PCBs and the corresponding changes

通過對結(jié)合能、吸附形態(tài)、空間位阻、二面角等方面的分析，結(jié)果表明：取代氯的增加和取代位置的差異會影響PCBs分子吸附在金基底上的位點，取代氯越多且越分散，分子吸附在金表面的能力就越弱，可能存在的吸附形態(tài)就越少。同時吸附也會受分子苯環(huán)二面角的影響，這一現(xiàn)象在鄰位取代的聯(lián)苯分子上尤為明顯。鄰位取代氯的增多使位阻效應依次增加，分子逐漸剛性化最終難以與金表面結(jié)合。而大部分的SERS信號是由吸附在“熱點”區(qū)的少量分子產(chǎn)生的，“熱點”區(qū)域有限，推測吸附能力強的分子具有較高的檢出濃度。

2.4 吸附特性對光譜定量分析的影響

如上文所述，多氯聯(lián)苯吸附特性會影響其在SERS檢測過程中的表現(xiàn)，為了直觀比較吸附特性對PCBs的定量檢測的影響程度，本文對海洋模擬液不同濃度的PCBs進行了SERS光譜檢測與定量分析。

圖4為不同濃度的PCBs溶液典型SERS光譜，圖5為SERS峰強與濃度的定量關(guān)系曲線。雖然化學吸附導致SERS峰位與拉曼峰相比有十幾個波數(shù)的漂移，但仍能夠通過振動分析與峰位歸屬進行匹配(詳見表1)。

圖4 梯度濃度的PCBs溶液典型SERS光譜(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.4 Typical SERS spectra of PCBs solution with different concentration(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

圖5 特征峰強隨PCBs濃度變化關(guān)系(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.5 The relationship between Raman intensity and PCBs solution concentration(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

當PCB15濃度低至1 nmol·L-1時，仍能清晰地分辨出1 087和1 579 cm-1兩個特征峰，對這兩個峰的強度和濃度關(guān)系進行擬合。結(jié)果表明在濃度為1～16 nmol·L-1范圍內(nèi)，峰強隨濃度的增加快速遞增，峰強與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2分別達0.998和0.999。當濃度在16～30 nmol·L-1范圍，譜峰強度增長減緩，30 nmol·L-1之后特征峰強趨于平穩(wěn)，說明PCB15在此濃度范圍中接近飽和吸附。PCB28，PCB47和PCB77的最低檢出濃度分別為2，4和8 nmol·L-1，三者對應的線性濃度范圍分別為2～32，4～50和8～50 nmol·L-1，擬合相關(guān)系數(shù)均在0.985以上。與PCB15相比，檢出濃度升高，線性范圍也增大，四種多氯聯(lián)苯檢測數(shù)據(jù)明顯表示出與吸附行為相關(guān)的特性。由于PCB15與金表面的結(jié)合能力較強，即使被測液濃度低至1 nmol·L-1也能清晰地被探測到。同時在30 nmol·L-1濃度左右?guī)缀踹_到飽和，也間接說明了相同濃度下PCB15在金表面的吸附能力是四者中最高的。由此印證了吸附位點受限制，在由聯(lián)苯作為主體框架結(jié)構(gòu)前提下，氯原子數(shù)越多越難吸附在金表面，越難達到吸附飽和的結(jié)論。

為證明實驗結(jié)果的合理性和準確性，用加標回收進行驗證，計算公式如式(2)

(2)

式(2)中，P為回收率，c1為測定濃度，c2為標準濃度，每個濃度的加標回收測試重復4次然后取平均，具體結(jié)果列于表3，此方法的回收率在87.9%～107.9%范圍內(nèi)，說明此方法對于PCBs的定性定量檢測的準確性較好，滿足現(xiàn)場分析的需求。

表3 PCBs的加標回收測試結(jié)果Table 3 Test values of labeled recovery test of PCBs

3 結(jié) 論

利用SERS技術(shù)結(jié)合DFT計算，首先探討了四種PCBs結(jié)構(gòu)差異在拉曼光譜中的體現(xiàn)，實驗結(jié)果表明，四種PCBs的共性特征峰來自于環(huán)呼吸振動(CCC彎曲)、橋鍵伸縮振動和苯環(huán)伸縮振動，隨著Cl原子數(shù)目增加，C—Cl鍵和C—H鍵的振動逐漸增強，C—Cl鍵越分散，其振動越復雜。然后建立了PCBs-Au吸附模型，分析分子在金表面的吸附特性。確立了物質(zhì)的吸附能力由高到低依次為PCB15和PCB28，然后是PCB77，最低是PCB47，Cl原子的增加減少分子在金表面的吸附構(gòu)型。位阻效應大的分子會阻礙其與基底的結(jié)合。最后探究了海洋環(huán)境下吸附特性對SERS定量分析的影響。各自的吸附能力決定了其飽和濃度和檢出濃度，吸附能力最強的PCBs率先達到飽和且檢出濃度最低。