張小雪，孫維良，張友德，武 超，鄧國志

(1. 安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230601;2. 安徽大學(xué) 濕地生態(tài)保護(hù)與修復(fù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230601;3. 安徽新宇生態(tài)產(chǎn)業(yè)股份有限公司，合肥 230601)

0 引 言

近年來，由細(xì)菌引起的問題越來越多，其中病原微生物污染引起的生物危害一直被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)危害健康的問題[1]，因此抗菌劑及其應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。常用的抗菌劑有臭氧、次氯酸鹽和抗生素等，但這些抗菌劑往往會(huì)造成水資源的二次污染[2]、鹽化以及造成細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性[3]，同時(shí)具有高能耗、高運(yùn)行成本的缺點(diǎn)。因此近些年許多有效的抗菌材料也被開發(fā)出來。由于納米材料具有尺寸小，比表面積大，以及更高的活性等優(yōu)異特性，因此展現(xiàn)出極大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。其中量子點(diǎn)是一種具有獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)且性能穩(wěn)定的半導(dǎo)體納米材料[4]。銀基納米材料具有極其優(yōu)異的殺菌潛力[5]。因此，在環(huán)境凈化中得到了廣泛的應(yīng)用。最近的研究報(bào)告了 Ag2S納米粒子對不同類型的耐藥細(xì)菌(革蘭氏陽性和革蘭陰性菌)的抑制作用[6-7]。

硫化銀(Ag2S)是一種帶隙約為(0.9～1.05 eV)半導(dǎo)體材料[8]，Ksp=6.3×10-50[9]，超低的溶度積常數(shù)使進(jìn)入生物體系中的銀離子的最小釋放量遠(yuǎn)小于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的鎘源量子點(diǎn)[10]。硫化銀(Ag2S)量子點(diǎn)的合成方法有物理法、化學(xué)法，包括水熱合成法、微波加熱法等[8]。Brelle等人在1999年首先報(bào)道了通過半胱氨酸和谷胱甘肽修飾合成直徑約為9 nm的硫化銀納米粒子[11]。2004年有研究者通過十二烷基硫醇和硫代乙酰胺制備單分散的硫化銀納米粒子[12]。2004年，Ikushima 等合成平均粒徑約5.9 nm的Ag2S納米晶，首次以 Ag2S QDs 命名[13]。真菌是公認(rèn)的合成金屬納米顆粒的生物對象，因?yàn)檎婢軌蚍置诔龃罅康拿?，并且容易控制合成過程[14-15]。因此通過微生物綠色合成硫化銀(Ag2S)納米粒子越來越重要。

本文主要研究真菌生物合成硫化銀(Ag2S)量子點(diǎn)并揭示其可能存在的抗菌性。用硝酸銀作為銀源，用亞硫酸鈉作為硫源，在酸性條件下通過酵母菌合成Ag2S納米粒子。通過倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡(SEM)、X射線衍射(XRD)和X射線光電子能譜(XPS)，確定了Ag2S QDs 的合成。此外，通過生物合成的Ag2S QDs研究對革蘭陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌)和革蘭氏陽性菌(芽孢桿菌)的抗菌性。研究結(jié)果為制備Ag2S QDs提供了一條簡單、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的途徑。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

1.1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：5 g/L yeast extract，10 g/L tryptone，5 g/L NaCl，121 ℃ 滅菌 20 min。

R2A培養(yǎng)基：0.5 g/L Tryptone，0.5 g/L酪蛋白氨基酸、0.5 g/L可溶性淀粉、0.5 g/L Yeast Extract、0.05 g/L MgSO4·7H2O、11.80 g/L檸檬酸、13.42 g/L K2HPO4、1.5 mmol/L丙酮酸鈉、10 g/L D-glucose，121 ℃滅菌 20 min。

1.1.2 儀 器

全自動(dòng)冷凍研磨儀，PowerDry LL3000；高速冷凍離心機(jī)，美國 SCILOGEX公司；恒溫氣浴振蕩培養(yǎng)箱，常州國華儀器公司；X 射線光電子能譜儀，美國 ESCALAB 250Xi；X 射線衍射儀，日本 SmartLab 9 kW；掃描電鏡 REGULUS8230；倒置熒光顯微鏡 ScopeA1 ZEISS 德國；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國 LTQ Orbitrap XL；紫外-可見光譜儀，美譜達(dá)UV-1100。

1.2 菌株的培養(yǎng)

本研究中使用的菌株是從大慶油田土壤中獲得。

在無菌操作臺(tái)挑取Meyerozymasp.菌，轉(zhuǎn)入含有500 μL R2A培養(yǎng)基的1.5 mL EP管中，放入30 ℃ 、150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h轉(zhuǎn)入含有50 mL LB的250 mL錐形瓶中，放入30 ℃、 150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h ，如圖1(c)所示，為顯微鏡下觀察到的Meyerozymasp.菌，形態(tài)近似球形。

1.3 Ag2S納米粒子的合成

將Meyerozymasp.菌戳入含有 500 μL R2A培養(yǎng)基后，放入搖床，30 ℃ 、150 r/min，培養(yǎng)12 h，再將500 μL菌液加至含有50 mL R2A培養(yǎng)基的250 mL形瓶中并加入90 μL 50%葡萄糖和50 μL 1.5 mmol/L丙酮酸鈉作為碳源，放入搖床，30 ℃、150 r/min，培養(yǎng)24 h；向錐形瓶中加入1 mmol/L AgNO3和1 mmol/L Na2SO3,放入搖床，30 ℃ 、150 r/min，培養(yǎng)48 h,溶液顏色變?yōu)闇\褐色。通過高速冷凍離心機(jī)8 000 r/min、5 min離心；將離心后的上清液倒出，加入純水進(jìn)行沖洗兩次，將上清液倒出。沉淀用純水重懸后于全自動(dòng)冷凍研磨儀破碎細(xì)胞，8 000 g/min、10 min離心，上清液用1kD透析袋透析后，用0.22 μm濾頭過濾，得到純化后的Ag2S。

1.4 Ag2S納米粒子的材料分析方法

取20 μL合成48 h 后Ag2S樣品于玻片上，通過倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)光情況；取合成48 h后Ag2S樣品 2 mL 離心(1 000 r/min、10 min)棄上清液，用戊二醛和乙醇處理，再利用掃描電鏡(SEM)觀察粒子形貌；冷凍干燥后的粉末用X射線光電子能譜(XPS)分析確定合成的Ag2S納米材料的元素組成和價(jià)態(tài)；X射線衍射儀(XRD)測定合成樣品的晶型。樣品離心后的上清在190～700 nm范圍內(nèi)利用紫外-可見光譜儀(UV-Vis)全波長掃描。

1.5 Ag2S納米粒子的抗菌性

E.coli、Pseudomonasaeruginosa、Bacillus轉(zhuǎn)接入500 μL LB 培養(yǎng)基后，放入搖床，30 ℃ 、150 r/min，培養(yǎng)12 h；將OD600=0.5的菌液用涂布棒均勻地涂抹在LB平板上，放入直徑為5 mm濾紙片，將不同濃度的Ag2S納米材料加入到濾紙片中觀察抑菌圈大小并測量其直徑；通過滴板殺菌研究Ag2S QDs對OD600=0.2的E.coli、Pseudomonasaeruginosa、Bacillus的抗菌活性。

抗菌率=[(A-B)/A]×100

式中：A為對照組平均菌落數(shù)；B為實(shí)驗(yàn)組組平均菌落數(shù)[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag2S QDs的合成及表征

在含有Meyerozymasp.的R2A培養(yǎng)基中加入1 mmol/L AgNO3和1 mmol/L Na2SO3培養(yǎng)48 h后,如圖1(a)和(b)所示，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化推測Ag2S QDs的合成。取10 μL菌液滴入到玻片上制樣，玻片倒置放在載物臺(tái)上，倒置熒光顯微鏡觀察，如圖3(a)、(b)和(c)所示。圖3(a)為在明亮背景中的成像，圖3(b)為在明亮背景中，在40倍鏡下，用紫外熒光激發(fā)塊激發(fā)，可以觀察到部分菌體出現(xiàn)熒光，圖3(c)為關(guān)閉房間內(nèi)的電燈和倒置熒光顯微鏡的白光下的成像，推測有Ag2S QDs的合成。

圖1 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDsFig 1 Biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

圖2 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的UV-Vis圖Fig 2 UV-Vis of the synthesized Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.1.1 紫外-可見光光譜(UV-Vis)分析

金屬納米粒子在UV-Vis上的表面等離子體共振吸收峰的峰位和峰形狀受納米粒子的尺寸、分布范圍以及環(huán)境等方面因素的影響[17]。合成樣品通過紫外可見光譜分析，以純水為空白樣作基線，將樣品稀釋后加入到比色皿中進(jìn)行全波長掃描，Uv-vis結(jié)果顯示，如圖2所示，在410 nm處出現(xiàn)表面等離子體共振吸收峰，表明Ag2S QDs的合成。已有文獻(xiàn)證實(shí)[18]。同時(shí)該表面等離子體共振激子峰的半高寬比較大，表明合成納米粒子的尺寸分布范圍較廣[19]。

2.1.2 掃描電鏡SEM分析

如圖4所示，為反應(yīng)后樣品的掃描電鏡(SEM)，圖4(a)為帶有菌體和材料的樣品，可以觀察到納米粒子附著在細(xì)胞表面，近似球形的Meyerozymasp.細(xì)胞發(fā)生輕微變形，表明了Ag2S QDs在細(xì)胞表面合成。圖4(b)為合成Ag2S QDs的掃描電鏡(SEM)，觀察到合成納米粒子為球形，出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖3 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs 倒置熒光顯微鏡圖(×40)Fig 3 The inverted fluorescence microscopy of the biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp. (×40)

圖4 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs 掃描電鏡(SEM)Fig 4 SEM of the biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.1.3 XRD、XPS分析

通過X射線衍射圖譜確定合成的Ag2S QDs的晶型。如圖5(a)所示由Meyerozyma sp.嘗試合成的Ag2S QDs X射線衍射圖譜與對照。樣品在26.3°、28.9°、31.5°、46.2°、54.1°、57.1°、67.9°出現(xiàn)明顯的衍射峰，與標(biāo)準(zhǔn)PDF(14-0072)卡片中( 1 1 0) ，( -1 1 2) ，(-1 2 3)，( 0 4 1) ，(1 1 4)， (2 3 2)晶面衍射峰對應(yīng),確定其晶型為單斜α-Ag2S。根據(jù)XPS圖譜分析Meyerozymasp.合成Ag2S QDs的元素價(jià)態(tài)，如圖5(b)、(c)和(d)所示，通過XPS圖譜可以確定合成納米材料包含C、N、O、Ag、S元素。對于Ag 3d在373.9和368 eV處大的峰相對應(yīng)于Ag3d 3/2和Ag3d 5/2，表明了Ag+的存在[20]。對于S 2p在163.7和161.9 eV處的峰相對應(yīng)于S 2p 和S 2p 1/2，表明了S2-的存在，結(jié)果與NIST XPS數(shù)據(jù)庫相對應(yīng)。進(jìn)一步證明了Ag2S QDs的合成。

圖5 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的X射線衍射圖譜和XPS圖譜Fig 5 XRD and XPS patterns of the synthesized Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.2 Ag2S QDs抗菌性測試

2.2.1 紙片擴(kuò)散法

通過紙片擴(kuò)散法，測試Meyerozymasp.合成Ag2S QDs對革蘭陰性菌和革蘭氏陽性菌的抗菌性。如圖6和表1所示，隨著加入Ag2S QDs的濃度從10 mg/L增加到50 mg/L，抑菌圈的直徑逐漸增大。表明隨著抗菌材料濃度的增加，抗菌效果越好，其中大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌圈比芽孢桿菌的抑菌圈直徑大，表明Ag2S QDs對革蘭陰性菌的抗菌性更強(qiáng)。這可能與細(xì)菌獨(dú)特的結(jié)構(gòu)有關(guān)，革蘭氏陽性菌的肽聚糖層一般較革蘭陰性菌厚，由于金屬納米顆粒難以穿透細(xì)胞細(xì)菌胞質(zhì)[21]，從而使其對金屬抗菌劑的敏感性降低。

2.2.2 滴板殺菌

通過96孔板測定Ag2S QDs對細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC)為7.5 mg/L使用滴板殺菌的方式測定Ag2S QDs對致病菌的抗菌率。如圖6(b)、(c)和(d)所示，Ag2S QDs濃度為7.5 mg/L時(shí)，在2 h內(nèi)對OD600=0.2的大腸桿菌、芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌性測試。圖6(b)對銅綠假單胞菌的抗菌率在10 min時(shí)約為98%，30 min時(shí)抗菌率達(dá)到100%。圖6(c)對芽孢桿菌在2 h內(nèi)抗菌率約為99.9%。圖6(d)對大腸桿菌10 min時(shí)抗菌率達(dá)到90%，30 min時(shí)抗菌率為99.99%，90 min時(shí)抗菌率可達(dá)到100%。

表1 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的抑菌圈直徑

圖6 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的抑菌圈及抗菌性Fig 6 Inhibition zone and antimicrobial activity of Ag2S QDs synthesized by Meyerozyma sp.

2.2.3 Ag2S QDs抗菌機(jī)理

通過掃描電鏡SEM分析Ag2S QDs的抗菌機(jī)理。有研究表明其殺菌效果可能與納米粒子表面自由基的形成有關(guān)。這些自由基與細(xì)菌膜脂相互作用，導(dǎo)致膜功能受損[8]。如圖7所示，圖7(a)、(b)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的銅綠假單胞菌，可以清晰地觀察到，銅綠假單胞菌的細(xì)胞為桿狀，處理前表面光滑，無褶皺。經(jīng)過Ag2S QDs處理后，銅綠假單胞菌的細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺。圖7(c)、(d)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的芽孢桿菌，形狀為桿狀。處理前芽孢桿菌細(xì)胞完整，Ag2S QDs處理后，芽孢桿菌的細(xì)胞表面輕微變形。圖7(e)、(f)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的大腸桿菌，形狀為桿狀。處理前大腸桿菌細(xì)胞完整且表面光滑，Ag2S QDs處理后，大腸桿菌的細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯破損、凹陷、變形，與報(bào)道相似[22-23]。通過SEM掃描電鏡分析，推測Ag2S QDs對細(xì)菌細(xì)胞的作用可能是吸附在細(xì)胞表面后使細(xì)胞膜發(fā)生破損，同時(shí)小粒徑的Ag2S QDs可能穿透細(xì)菌膜，破壞DNA和蛋白質(zhì)，從而對細(xì)胞造成損壞，進(jìn)而導(dǎo)致了細(xì)胞死亡[24]。

圖7 掃描電鏡圖：(a)、(b)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的銅綠假單胞菌；(c)、(d)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的芽孢桿菌；(e)、(f)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的大腸桿菌Fig 7 Scanning electron microscopy

3 結(jié) 論

利用從大慶油田土壤中篩出的耐重金屬真菌，季也蒙畢赤酵母Meyerozymasp.，還原硝酸銀和亞硫酸鈉合成具有單斜α-Ag2S晶型硫化銀(Ag2S)量子點(diǎn)，并借助X射線光電子能譜分析(XPS)、X射線衍射(XRD)、倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡等手段對合成的硫化銀(Ag2S)量子點(diǎn)進(jìn)行表征，同時(shí)通過紙片擴(kuò)散法和滴板殺菌研究了合成的硫化銀(Ag2S)量子點(diǎn)的抗菌性。得到的結(jié)果表明，通過Meyerozymasp.菌合成納米粒子，對革蘭陰性菌包括Escherichiacoli和Pseudomonasaeruginosa以及革蘭氏陽性菌Bacillus均有顯著的抗菌性，并隨著材料濃度的增加，抗菌性逐漸增強(qiáng)。對銅綠假單胞菌、大腸桿菌分別在30和90 min時(shí)抗菌率達(dá)到100%，對芽孢桿菌在2 h內(nèi)抗菌率約為99.9%。根據(jù)對處理后的Escherichiacoli、Pseudomonasaeruginosa和Bacillus的掃描電鏡分析，推測造成細(xì)菌死亡的原因可能是由于Ag2S吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜表面，造成膜的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究為硫化銀(Ag2S)量子點(diǎn)的合成提供了一條簡單環(huán)保的途徑，由于其熒光和抗菌特性，可用于熒光探針及抗菌劑等方面的應(yīng)用。