諶蒙蒙 董靜 孫琦 黃麥玲 丁則昱 史雨婷 賈紅彥 杜博平 魏榮榮 邢愛英 張宗德 潘麗萍

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病，是最嚴(yán)重的結(jié)核病類型[1]。由于TBM患者的臨床癥狀特異性差，并缺乏有效的檢測技術(shù)，使得TBM的早期診斷較為困難。目前，臨床上使用的腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)涂片抗酸染色的分枝桿菌陽性率較低，僅為10%～20%；而MTB培養(yǎng)的敏感度也有限，且一般需要6～8周；盡管世界衛(wèi)生組織推薦了GeneXpert MTB/RIF檢測技術(shù)，但其敏感度仍低于60%[2]。因此，迫切需要開發(fā)新的檢測技術(shù)以早期診斷TBM，而尋找新的生物標(biāo)志物則成為目前研究的重要方向。

微小核糖核酸(miRNA)是一類由18～25個核苷酸組成的高度保守的非編碼單鏈RNA分子，主要從轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，在細(xì)胞分化、增殖、器官發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[3]。近年來，miRNA作為新的生物標(biāo)志物已應(yīng)用于多種疾病的診斷中，如癌癥、糖尿病和乙型病毒性肝炎等疾病[4-6]。而在結(jié)核病的研究領(lǐng)域，雖然也發(fā)現(xiàn)miRNA的差異表達(dá)可以反映機(jī)體感染時的結(jié)核病進(jìn)展情況，但在TBM中的相關(guān)研究還較少，特別是針對CSF的相關(guān)研究更為有限[7]。筆者通過表達(dá)譜篩選、分析、驗證TBM與病毒性腦膜炎(viral meningitis，VM)患者CSF中差異表達(dá)的miRNA，旨在發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，為后期TBM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供參考。

對象和方法

一、研究對象

參照入組標(biāo)準(zhǔn)選取2017年12月至2019年9月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院治療的28例TBM患者和27例VM患者；其中，TBM組中男性17例(60.7%)、女性11例(39.3%)，中位年齡[M(Q1，Q3)]為26.5(19.0，47.0)歲；VM組中男性19例(70.4%)、女性8例(29.6%)，中位年齡為45.0(26.0，55.0)歲；兩組患者性別分布和年齡的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.567，P=0.452；Z=-1.643，P=0.100)。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(YJS-2021-007號)。

將前期收集的8例TBM患者和5例VM患者作為基因芯片樣本進(jìn)行全基因組miRNA微陣列分析，其中，TBM組中男性5例、女性3例，中位年齡為27.0(22.5,45.0)歲；VM組中男性3例、女性2例，中位年齡為26.0(24.0,35.0)歲；兩組患者性別分布和年齡的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確概率法，P=1.000；Z=-0.146，P=0.884)。將全部患者作為驗證樣本進(jìn)行實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)驗證。

二、研究方法

1.入組標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)TBM 組：納入有以下至少一項腦膜炎癥狀和體征者，包括頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、發(fā)熱、盜汗、乏力、消瘦、腦膜刺激征、顱內(nèi)壓增高、局灶性神經(jīng)功能障礙、意識改變，以及CSF抗酸染色或MTB培養(yǎng)或PCR或GeneXpert MTB/RIF陽性者。排除化膿性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎、病毒性腦膜腦炎、梅毒性腦膜炎、腦型瘧疾、布魯桿菌性腦膜炎、寄生蟲性或嗜酸細(xì)胞性腦膜炎、腦弓形體病和細(xì)菌性腦膿腫、惡性腫瘤和自身免疫性腦炎。(2)VM 組：納入確認(rèn)病毒病因，或經(jīng)抗病毒治療效果良好，以及排除細(xì)菌、真菌和其他非感染性原因(惡性腫瘤、神經(jīng)結(jié)節(jié)病、自身免疫性疾病)者。

2.樣本采集及miRNA的提?。核蠧SF標(biāo)本均取自患者的常規(guī)診斷檢查過程。先在4 ℃下2000×g離心10 min，再經(jīng)4 ℃下16 000×g離心10 min后，吸取上清液至無菌聚丙烯微管中，分裝后濃度為200 μl/管，在-80 ℃中保存?zhèn)溆谩Ｔ侔凑昭?血漿RNA提取純化試劑盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit，德國Qiagen公司)說明書從CSF標(biāo)本(200 μl)中提取總RNA，并按照說明書在提取時加入5.6×108個拷貝量的外源cel-miR-39-3p(德國Qiagen公司)作為內(nèi)參。

3.微陣列基因芯片檢測及差異性miRNA的篩選：將提取的總RNA樣本送上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行微陣列基因芯片檢測。采用美國安捷倫科技有限公司的miRNA微陣列芯片V21(8×60 k；G4872A-070156)從每份樣本中提取的總RNA(100 ng)作為樣本進(jìn)行標(biāo)記和雜交，使用掃描控制軟件將微陣列圖像信息轉(zhuǎn)換為光點(diǎn)強(qiáng)度值進(jìn)行計算。再將原始樣本數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后得到TBM/VM的差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)，以FC>2或<0.5且P<0.05為條件篩選出差異性miRNA。當(dāng)FC>1時，表示miRNA在TBM組中的表達(dá)較VM組上調(diào)，且FC值越大，表示兩病患者間表達(dá)差異越大；當(dāng)FC<1時，表示miRNA在TBM組中的表達(dá)較VM組下調(diào)，且FC值越小，表示兩病患者間表達(dá)差異越大。通過R語言制作差異表達(dá)的miRNA聚類分析熱圖，以對樣本和基因分別進(jìn)行分級聚類，并可直觀地表現(xiàn)出基因在不同樣本中的表達(dá)情況，紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)。

4.差異性miRNA靶基因預(yù)測及基因本體(gene ontology, GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路分析：通過miRTarBase 8.0數(shù)據(jù)庫(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)預(yù)測差異性miRNA的靶基因。通過David 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路分析，并對KEGG信號通路分析中富集于免疫、炎癥，或神經(jīng)相關(guān)通路的靶基因進(jìn)一步分析。

5.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶基因的篩選：通過STRING 11.5數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)對上述靶基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，以了解基因間有無相互作用，以及平均基因間相互作用的關(guān)系度(即每個靶基因與其余靶基因相互作用程度的平均值，數(shù)值越高表示相互作用的程度越大)。運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再運(yùn)用Cytohubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行運(yùn)算，根據(jù)degree水平篩選出前10個基因作為差異表達(dá)基因中的核心靶基因。其中degree是PPI網(wǎng)絡(luò)中評估連接緊密程度的一個參數(shù)，該數(shù)值越高表示連接越緊密，在整個網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白節(jié)點(diǎn)的相互作用程度越強(qiáng)，對整個網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性起著重要的作用。

6.qRT-PCR驗證：按照miScript Ⅱ RT Kit(德國Qiagen公司)說明書將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再根據(jù)miScript SYBR PCR Kit(德國Qiagen公司)說明書進(jìn)行熒光定量檢測，以cel-miR-39-3p作為內(nèi)參，計算2-△Ct值作為各樣本中miRNA的相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、基因芯片篩選出組間差異的miRNA

通過微陣列基因芯片檢測數(shù)據(jù)分析，篩選出TBM患者與VM患者之間存在26個差異性miRNA，分別為11、12、19號和X性染色體上各有3個差異性miRNA，1、3、10和17號染色體上各有2個差異性miRNA，2、5、9、16、20和22號染色體上各有1個差異性miRNA，hsa-miR-4281和hsa-miR-4516是在兩組中表達(dá)差異最大的miRNA(FC>20)，具體數(shù)據(jù)見表1(由上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行微陣列基因芯片檢測并提供最終結(jié)果)。其中，14個miRNA表達(dá)量上調(diào)，12個miRNA表達(dá)量下調(diào)，依此繪制差異性miRNA聚類分析熱圖(圖1)。

二、miRNA的預(yù)測靶基因及GO富集分析和KEGG信號通路分析

通過miRTarBase 8.0數(shù)據(jù)庫篩選出26個差異性miRNA對應(yīng)的靶基因，共3217個，但在該數(shù)據(jù)庫中能夠進(jìn)行熒光素酶報告實驗、蛋白免疫印跡(Western blot)或qRT-PCR驗證的只有6個miRNA靶基因，分別為hsa-miR-21-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-4496、hsa-miR-4516及hsa-miR-7515，其中hsa-miR-21-5p是經(jīng)過實驗驗證最多的miRNA靶基因。

進(jìn)一步對預(yù)測出的靶基因進(jìn)行GO富集生物信息學(xué)分析。其中，生物學(xué)過程分析顯示，靶基因主要富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控和蛋白質(zhì)的泛素化作用等過程中(圖2)；細(xì)胞組成分析顯示，靶基因主要富集于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞溶質(zhì)等物質(zhì)中(圖3)；分子功能分析顯示，靶基因主要富集于蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合和三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合等(圖4)；KEGG信號通路分析顯示，這些靶基因主要參與癌癥相關(guān)通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等，且有190個靶基因富集于免疫反應(yīng)、炎癥或神經(jīng)營養(yǎng)素相關(guān)通路(圖5)。

三、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

經(jīng)初步PPI網(wǎng)絡(luò)分析上述190個靶基因顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)富集具有明顯的交互作用(P<1×10-16)，平均基因間相互作用關(guān)系度為28.9。進(jìn)一步構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，共計包含了其中的174個基因，組成了2633對相互作用關(guān)系(圖6)，經(jīng)Cytohubba插件運(yùn)算，將degree水平前10個基因作為核心靶基因，分別是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、腫瘤蛋白p53(TP53)、MYC基因、表皮生長因子受體(EGFR)、PTEN基因、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3(FOXO3)，其degree值分別為128、116、97、96、88、88、88、78、76和73，并構(gòu)建出核心靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，顯示了這10個核心靶基因組成的45對相互作用關(guān)系(圖7)。

四、hsa-miR-21-5p的驗證及診斷價值

對基因芯片檢測樣本的hsa-miR-21-5p相對表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)TBM患者h(yuǎn)sa-miR-21-5p的表達(dá)水平[15.890(3.423，25.581)]較VM患者[0.807(0.614，0.955)]明顯上調(diào)(Z=-2.355，P=0.019)，F(xiàn)C(TBM/VM)在基因芯片和qRT-PCR中分別是4.817和4.660，兩種檢測方法結(jié)果基本一致。

進(jìn)一步對28例TBM和27例VM患者的hsa-miR-21-5p進(jìn)行qRT-PCR結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-21-5p在TBM患者的相對表達(dá)量為4.825(2.433，21.362)，明顯高于VM患者[0.204(0.112，0.711)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-5.000，P=0.000)，且ROC曲線區(qū)分TBM與VM患者的AUC為0.893(0.806～0.980)，敏感度為85.7%，特異度為88.9%(圖8)。

圖8 hsa-miR-21-5p區(qū)分結(jié)核性腦膜炎和病毒性腦膜炎的受試者工作特征曲線

討 論

當(dāng)前，TBM的臨床診斷仍然具有明顯的挑戰(zhàn)性，尤其是存在TBM與其他感染性腦膜炎鑒別困難，如細(xì)菌性腦膜炎、真菌性腦膜炎(主要是隱球菌性腦膜炎)和VM。細(xì)菌性腦膜炎在成年患者中的發(fā)病率較低，且抗生素應(yīng)用效果良好。隱球菌性腦膜炎多發(fā)生在HIV感染者群體，且有較好的檢測方法[9]。因此，TBM與這兩種疾病的鑒別診斷并不復(fù)雜。但是，由于TBM和VM患者的CSF具有較多相似的特征，如CSF外觀清晰、典型病原體培養(yǎng)陰性、白細(xì)胞計數(shù)正常和以單核細(xì)胞為主的細(xì)胞增多等，導(dǎo)致TBM與VM的鑒別診斷更加困難，迫切需要新的鑒別診斷指標(biāo)[10]。由于miRNA具有高度保守性、組織特異性、反復(fù)凍融且不易降解的穩(wěn)定性和易于檢測等特征[11-13]，已被認(rèn)為是很有前景的候選生物標(biāo)志物。基于此，本研究探索有助于區(qū)別TBM與VM可能的miRNA檢測生物標(biāo)志物。

目前，僅發(fā)現(xiàn)少量集中于TBM特異性miRNA的篩選和驗證的研究[14-18]。這些研究大多是研究TBM患者CSF外泌體或外周血中特定miRNA與對照組之間的表達(dá)差異，或以血漿為研究對象開展miRNA特異表達(dá)譜分析研究，或僅篩選了TBM患者與健康對照組之間CSF中有差異的miRNA，但目前臨床上主要存在TBM與其他感染性腦膜炎的鑒別困難，尤其是與VM更難以區(qū)分。因此，以往驗證的部分miRNA雖然在TBM患者中的表達(dá)水平明顯高于或低于健康對照，但這些miRNA在臨床中的實際應(yīng)用會相對有限。另外，相比于血漿和外周血，CSF是TBM病灶部位的直接相關(guān)體液，且不同體液中miRNA的表達(dá)譜存在一定的差異，認(rèn)為直接檢測TBM患者CSF中的miRNA表達(dá)水平變化可能對疾病診斷更具有意義[19]，故本研究結(jié)果對鑒別TBM和VM具有較好的臨床應(yīng)用價值。

本研究通過基因芯片技術(shù)對TBM和VM患者CSF樣本進(jìn)行全基因組miRNA微陣列分析，篩選出26個差異性表達(dá)的miRNA，其中有14個miRNA表達(dá)上調(diào)，12個miRNA表達(dá)下調(diào)，揭示了TBM與VM之間miRNA表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在TBM患者中表達(dá)顯著上調(diào)，為TBM與VM的鑒別診斷提供了一個新的潛在的生物標(biāo)志物。GO富集分析顯示，這些miRNA的靶基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控和蛋白質(zhì)的泛素化作用等生物過程相關(guān)。細(xì)胞凋亡是機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)的重要過程，通過阻止細(xì)胞內(nèi)MTB的釋放、限制其傳播以達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，TBM患者的細(xì)胞凋亡過程受到了抑制，可能會導(dǎo)致MTB的免疫逃逸，進(jìn)而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。在MTB感染過程中，蛋白質(zhì)泛素化顯示出了雙重作用，表現(xiàn)為MTB與宿主泛素結(jié)合以抑制宿主的固有免疫，而泛素化現(xiàn)象又可以被宿主利用來針對MTB進(jìn)行異源吞噬[21]。KEGG信號通路分析顯示，這些靶基因主要富集于癌癥相關(guān)通路、PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路等，且有190個靶基因富集于免疫反應(yīng)、炎癥或神經(jīng)營養(yǎng)素相關(guān)通路。

眾所周知，TBM疾病的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷密切相關(guān)。筆者通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步篩選出前10個核心靶基因，分別是AKT1、TP53、MYC、EGFR、PTEN、MAPK1、STAT3、VEGFA、MAPK14和FOXO3，提示這些靶基因可能在TBM疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。其中，PTEN、STAT3和FOXO3已經(jīng)顯示出在結(jié)核免疫反應(yīng)中產(chǎn)生一定的作用，如PTEN可能通過抑制PI3K/Akt/核因子κB(NF-κB)通路降低NF-κB的活性，抑制促炎細(xì)胞因子的釋放[22]，也可能通過抑制PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑下調(diào)自噬，提高細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存活率[23]。而STAT3可調(diào)節(jié)輔助性T 細(xì)胞17(Th17)的發(fā)育和功能，從而產(chǎn)生抗結(jié)核細(xì)胞免疫反應(yīng)[24]；而且，STAT3的下調(diào)可以抑制維生素D受體(VDR)相關(guān)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路下游的多條抗分枝桿菌通路及白細(xì)胞介素32(IL-32)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和自噬機(jī)制[25]。最后，F(xiàn)OXO3通過參與調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的多種免疫功能來達(dá)到抗結(jié)核作用[26]。Lu等[27]發(fā)現(xiàn)FOXO3中rs12212067基因的G等位基因可能影響FOXO3的表達(dá)，從而影響活動性肺結(jié)核患者的結(jié)核病進(jìn)展。另外，MAPK1與PI3K/Akt信號通路有關(guān)，該通路在免疫系統(tǒng)反應(yīng)中具有不同的調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能[28]。VEGF是最重要和有效的血管生成刺激物，與缺血、創(chuàng)傷、腫瘤和感染相關(guān)的腦水腫的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[29]。Misra等[30]發(fā)現(xiàn)腦梗塞與TBM患者CSF中VEGF濃度的相對增加有關(guān)。其他AKT1、TP53、MYC主要與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在結(jié)核病中的作用有待進(jìn)一步研究。

近年來，miR-21在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)核病、肺炎和其他肺部疾病中得到了廣泛的研究[31]。Kathirvel等[32]發(fā)現(xiàn)，miR-21在活動性結(jié)核病患兒血漿中的表達(dá)水平明顯高于健康對照組。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)，初治肺結(jié)核患者血清中miR-21-5p表達(dá)水平較健康對照組明顯升高，且治愈肺結(jié)核患者較初治肺結(jié)核患者的miR-21-5p水平明顯降低。因此，可以認(rèn)為miR-21在結(jié)核病中高表達(dá)。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)，在TBM患者CSF中miR-21-5p的表達(dá)水平明顯高于VM患者。Wu等[34]證明miR-21通過抑制IL-12表達(dá)來抑制宿主Th1對MTB的應(yīng)答，并與B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)相互作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。Zhao等[35]證明miR-21-5p可通過靶向MTB感染的巨噬細(xì)胞中的Bcl-2和Toll樣受體4(TLR4)抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和MTB存活，抑制IL-1b、IL-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌。這提示miR-21-5p在MTB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過qRT-PCR進(jìn)一步分析了miR-21-5p在TBM與VM中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p具有一定區(qū)分TBM與VM患者的能力，其診斷TBM的AUC為0.893(0.806～0.980)，敏感度為85.7%，特異度為88.9%，提示miR-21-5p具有作為TBM鑒別診斷生物標(biāo)志物的潛在價值。

本研究也存在一定局限。首先，由于TBM較低的確診率限制了本研究招募的患者數(shù)量，研究結(jié)論需更大樣本量的進(jìn)一步驗證。其次，研究通過基因芯片分析篩選出TBM與VM患者間存在的26個差異性miRNA，與既往發(fā)現(xiàn)的差異性miRNA重疊較少，可能是研究樣本不同，或是所選取的對照人群不同所導(dǎo)致，但qRT-PCR驗證與基因芯片篩選所獲得的miR-21-5p在兩病間的表達(dá)趨勢和FC值基本一致，可說明基因芯片結(jié)果的可靠性。再者，進(jìn)一步的驗證研究僅選擇了目前在多種疾病中較充分研究的miR-21-5p開展，并不能否定其他miRNA的潛在性能，其他miRNA的診斷價值仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究揭示了TBM與VM之間miRNA表達(dá)譜的差異性，并進(jìn)一步驗證了miR-21-5p在TBM中的診斷價值。這些結(jié)果不僅為鑒別TBM和VM提供了一個新的潛在的生物標(biāo)志物，也為更好地了解TBM的發(fā)病機(jī)制提供了幫助。