李東碩 王彬 陸宇 徐建

貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)能夠抑制結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成酶，有著重要的滅菌活性，是縮短結(jié)核病療程和治療耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵新藥[1]。2018年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將Bdq列為治療耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)或利福平耐藥結(jié)核病(RR-TB)的A組藥物[2]。Bdq的臨床耐藥株很快出現(xiàn)[3-4]，迫切需要對其耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究，以便在臨床大規(guī)模使用該藥品時，能夠合理用藥，降低耐藥率的發(fā)生。

盡管編碼ATP合成酶的atpE基因突變與Bdq耐藥相關(guān)，但在Bdq治療的臨床患者中分離的很少。臨床上首先發(fā)現(xiàn)且報道最多的是Rv0678基因突變[3-5]。筆者前期研究也在中國MDR-TB患者中分離到了Bdq和氯法齊明的原發(fā)耐藥株，發(fā)現(xiàn)MTB的Rv0678突變會導(dǎo)致其對Bdq與氯法齊明的交叉耐藥[6]。Rv0678基因是MmpS5-MmpL5系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，Rv0678基因突變會引起外排泵基因mmpS5及mmpL5的過表達(dá)。

MmpL5是多重跨膜的膜蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)尚無解析，MmpS5-MmpL5的功能尚不清楚。膜蛋白的表達(dá)與純化一直是研究膜蛋白功能的技術(shù)難題。筆者前期在大腸桿菌中多次嘗試表達(dá)但結(jié)果仍不理想。考慮到恥垢分枝桿菌基因組與MTB高度同源，恥垢分枝桿菌屬快生長分枝桿菌且具有無致病性及傳染性等優(yōu)點，筆者采用恥垢分枝桿菌作為模式菌研究，對pMV261載體進(jìn)行改造，在載體上插入用于調(diào)控乙酰胺酶表達(dá)的可誘導(dǎo)型啟動子，構(gòu)建了MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)體系，并對其功能進(jìn)行了研究，以期為后續(xù)蛋白純化并研究Bdq的轉(zhuǎn)運機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實驗菌株

MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294)和恥垢分枝桿菌MycobacteriumsmegmatisMC2155(ATCC 700084)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市耐藥結(jié)核病重點實驗室保存并提供。

二、實驗藥物

Bdq(上海瀚香生物科技公司；批號：20200518；純度≥98%)、異煙肼(美國Sigma公司；批號：MKBV9475V；純度≥99%)。

三、 儀器與試劑

1.儀器：Nuaire701二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)、Infinite 200多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 公司)、GENEPRO多功能基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技股份有限公司)、Amersham Imager 600蛋白成像儀(美國GE公司)、Max-Q8000低溫?fù)u床(美國賽默飛世爾科技公司)、DS-11FX超微量分光光度計(美國DeNovix公司)、Tanon-4200全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2.試劑：pMV261質(zhì)粒為本實驗室保存；KpnⅠ(R0142V)、BamHⅠ(R0136V)、EcoRⅠ(R0101V)、HpaⅠ(R0105V)、HindⅢ(R0104V)均購自美國紐英倫生物技術(shù)公司；E.coliDH5α購自寶生物工程(大連)有限公司(批號：R2015V)；pLB零背景快速連接試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(批號：VT205)；ATP檢測試劑盒(S0026)、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(P0018AS)、苯甲基磺酰氟(PMSF；ST506)、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒(P0033)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

四、構(gòu)建帶有組氨酸標(biāo)簽的乙酰胺誘導(dǎo)型載體pMV261s

采用PCR的方法從恥垢分枝桿菌中擴(kuò)增乙酰胺酶基因，引物序列如下：AI-F：5′-ctaggtaccagtgacgcggtctcaagcg-3′(KpnⅠ)，AI-R：5′-ctaggatcc-aaaactacctcgggcatgtgg-3′(BamHⅠ)，下劃線處為酶切位點。PCR反應(yīng)后目的基因與pLB克隆載體連接，目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收與pMV261載體雙酶切后連接。設(shè)計一段在N端含有6×His組氨酸標(biāo)簽的序列，并引入BamHⅠ及HpaⅠ的酶切位點黏性末端，序列如下：261-F：5′-gatcctcaccaccaccaccaccacactagtcagctgcagaattcatatgcatcgatggtt-3′(斜體標(biāo)示序列為6×His組氨酸標(biāo)簽序列)；261-R：5′-aaccatcgatgcatatgaattctgcagctgactagtgtggtgg-tggtggtggtgag-3′，將上述質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ及HpaⅠ雙酶切后，與此序列連接，構(gòu)建帶有組氨酸標(biāo)簽的乙酰胺誘導(dǎo)型載體，命名為pMV261s。

五、目的基因與pMV261s的連接及轉(zhuǎn)化

根據(jù)NCBI中MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的mmpS5及mmpL5的基因序列設(shè)計引物，引物序列如下：mmpS5-F：5′-ccggaattcgatgattggaactctcaagc-3′和mmpL5-F：5′-ccggaattcgatgatcgtgcaaaggac-3′ (EcoRⅠ)；mmpL5-R：5′-ccggttaactcagaccaaggcgaagg-3′(HpaⅠ)；構(gòu)建mmpS5-mmpL5全長基因，前引物為mmpS5-F，后引物直接為mmpL5-R。PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，pLB載體過夜連接提取目的基因。EcoRⅠ及HpaⅠ雙酶切的目的基因與pMV261s載體連接，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至E.coliDH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆并測序驗證。

將測序驗證正確的含mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的質(zhì)粒及空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)條件為電壓2500 V、電容25 μF，電阻1000 Ω，電轉(zhuǎn)化杯厚度2 mm。轉(zhuǎn)化后于含10% OADC添加劑的7H9培養(yǎng)基中37 ℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取一定體積涂布在含終濃度為50 μg/ml的卡那霉素的LB平板上，挑取單克隆于7H9+10% OADC+50 μg/ml卡那霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)。

六、MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的表達(dá)

待菌液培養(yǎng)至波長600 nm處吸光度值(A600值)等于0.8，加入終濃度為0.2%的乙酰胺溶液誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)20 h，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心后棄上清，菌沉淀用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，離心棄上清，菌沉淀加入細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和PMSF，懸浮后冰浴10～15 min，高壓破碎儀破碎菌體，4 ℃ 1200×g離心10 min，收集上清液，繼續(xù)14 000×g離心30 min，吸除上清，沉淀加入膜蛋白抽提試劑B，振蕩后冰浴，14 000×g離心5 min，抽提膜蛋白。

七、蛋白免疫印跡分析

提取的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，加入1∶2000的抗組氨酸鼠源IgG單克隆抗體一抗，TBST緩沖液洗去一抗，加入1∶5000的羊抗鼠IgG二抗孵育，TBST緩沖液洗去二抗，加入辣根過氧化物酶顯色劑孵育后，進(jìn)行化學(xué)顯色檢測。

八、生長曲線的測定

為了驗證外源基因表達(dá)對恥垢分枝桿菌生長的影響，測定了空質(zhì)粒、表達(dá)MmpL5及MmpS5-MmpL5的菌株的生長曲線。將這3種細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，調(diào)整A600值一致，之后按1%接種在含0.05%吐溫-80的7H9+10%OADC培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)，每隔5 h測定1次A600值，每個樣品設(shè)置2個生物學(xué)重復(fù)，繪制生長曲線。

九、檢測抗菌藥物對恥垢分枝桿菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)

將3種細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用7H9+10%OADC培養(yǎng)基將菌液稀釋至終濃度為1×105CFU/ml。取96孔黑色培養(yǎng)板，依次將異煙肼及Bdq倍比稀釋。37 ℃培養(yǎng)3 d后，各孔加入20 μl的阿爾瑪藍(lán)和12.5 μl的20%吐溫-80，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，記錄各孔顏色，藍(lán)色表示菌株無生長，紅色表示有菌生長，MIC表示由藍(lán)色變?yōu)榧t色的的最低藥物濃度。

十、恥垢分枝桿菌對溴化乙錠(ethidium bromide，EtBr)的積累實驗

MmpS5-MmpL5蛋白屬于RND超家族外排泵，EtBr常被用作測試藥物外排泵活性的通用型底物。離心收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的3種細(xì)菌，并用PBS重懸洗滌菌體2次，調(diào)節(jié)各菌A600值為0.4，吸取198 μl重懸菌液，加入2 μl濃度為100 μg/ml的EtBr至終濃度為1 μg/ml，混勻，立即用Infinite M200多功能酶標(biāo)儀檢測熒光值，設(shè)置激發(fā)波長為545 nm，發(fā)射波長為590 nm，每隔5 min檢測1次，共檢測60 min，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

十一、恥垢分枝桿菌ATP含量測定

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的3種細(xì)菌，用7H9培養(yǎng)基調(diào)節(jié)A600值為0.4，向菌液中加入終濃度為1/2 MIC(0.125 μg/ml)的Bdq，孵育24 h，離心收集等體積的3種細(xì)菌，離心后棄上清，菌沉淀加入裂解液，振蕩混勻。96孔黑色培養(yǎng)板中加入100 μl裂解菌液和100 μl稀釋后的ATP檢測液，酶標(biāo)儀測定相對光單位(relative light unit，RLU)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定的RLU值計算出各菌液中的ATP含量。

十二、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、帶有組氨酸標(biāo)簽的乙酰胺誘導(dǎo)型載體pMV261s的構(gòu)建

通過改造pMV261穿梭載體，添加乙酰胺酶啟動子基因(pACE)，并添加組氨酸標(biāo)簽便于重組蛋白的驗證及純化，建立帶有組氨酸標(biāo)簽的乙酰胺可誘導(dǎo)型表達(dá)載體pMV261s。對恥垢分枝桿菌乙酰胺酶啟動子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段長度為2618 bp(圖1)，連接pLB克隆載體成pLB-pACE，KpnⅠ及BamHⅠ雙酶切后目的條帶大小正確(圖2)，在乙酰胺酶啟動子基因上有HindⅢ酶切位點，在含組氨酸標(biāo)簽的序列上有EcoRⅠ酶切位點，雙酶切后片段長度為1584 bp(圖3)。由此證明組氨酸標(biāo)簽連接成功，同時測序驗證正確，pMV261s載體構(gòu)建成功。

注 泳道M為DL 5000 DNA Marker；圖1中泳道1和2均為pACE基因；圖2中泳道1為pLB-pACE載體單酶切，泳道2和3均為pLB-pACE載體雙酶切驗證；圖3中泳道1為pMV261s載體單酶切，泳道2和3均為pMV261s載體雙酶切驗證圖1～3 帶有組氨酸標(biāo)簽的乙酰胺誘導(dǎo)型pMV261s載體的構(gòu)建

注 泳道M為DL 5000 DNA Marker；圖4中泳道1和2均為mmpL5基因；泳道3和4均為mmpS5-mmpL5基因。圖5中泳道1為pMV261s-mmpL5載體單酶切；泳道2為pMV261s-mmpL5載體雙酶切。圖6中泳道1為pMV261s-mmpS5-mmpL5單酶切；泳道2為pMV261s-mmpS5-mmpL5雙酶切圖4～6 目的基因與pMV261s載體的連接與驗證

二、pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR方法擴(kuò)增MTB的mmpL5及mmpS5-mmpL5基因，mmpL5片段長度為2895 bp，mmpS5-mmpL5片段長度為3320 bp，目的基因條帶大小正確(圖4)，EcoRⅠ和HpaⅠ雙酶切目的基因及pMV261s表達(dá)載體，雙酶切條帶大小正確(圖5，6)，測序結(jié)果無突變。

三、MmpS5-MmpL5及MmpL5蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)

注 泳道1為pMV261s-mmpS5-mmpL5重組菌株；泳道2為pMV261s-mmpL5重組菌株；泳道3為pMV261s菌株；泳道M為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)圖7 蛋白免疫印跡分析重組恥垢分枝桿菌的MmpS5-MmpL5和MmpL5蛋白

對經(jīng)乙酰胺誘導(dǎo)的pMV261s-mmpL5、pMV261s-mmpS5-mmpL5重組菌株及pMV261s空質(zhì)粒菌株進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，MmpL5蛋白相對分子質(zhì)量為104 800，MmpS5-MmpL5蛋白相對分子質(zhì)量為120 100，加上6×His組氨酸標(biāo)簽組成的重組蛋白，在相對分子質(zhì)量為110 000～130 000處出現(xiàn)目的條帶，而空質(zhì)粒菌株沒有條帶(圖7)，表明MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白在恥垢分枝桿菌中成功表達(dá)。

四、MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的表達(dá)對恥垢分枝桿菌生長無影響

為考察MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的表達(dá)是否影響恥垢分枝桿菌的生長特性，比較3種細(xì)菌的生長曲線，發(fā)現(xiàn)表達(dá)mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的恥垢分枝桿菌與攜帶pMV261s空質(zhì)粒的恥垢分枝桿菌，均在15 h之后進(jìn)入對數(shù)生長期，25 h達(dá)到平臺期，三者生長特性沒有明顯差異(圖8)。

圖8 不同重組的恥垢分枝桿菌的生長曲線

五、Bdq對表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝桿菌的敏感性降低

異煙肼對表達(dá)MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的重組恥垢分枝桿菌及攜帶空質(zhì)粒的恥垢分枝桿菌的MIC均為1 μg/ml，表明異煙肼不是MmpS5-MmpL5蛋白外排系統(tǒng)的底物。Bdq對表達(dá)MmpL5蛋白及帶有空質(zhì)粒的恥垢分枝桿菌的MIC值為0.25 μg/ml，而對表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝桿菌的MIC為2 μg/ml，MIC值提高了8倍。由此證明，MmpL5與MmpS5蛋白共表達(dá)才能發(fā)揮作用，且MmpS5-MmpL5蛋白的表達(dá)導(dǎo)致Bdq的耐藥。

六、表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝桿菌外排能力增強(qiáng)

檢測重組恥垢分枝桿菌對EtBr的積累，發(fā)現(xiàn)表達(dá)MmpL5蛋白與攜帶有pMV261s空質(zhì)粒的恥垢分枝桿菌對EtBr的積累大致相同(△熒光強(qiáng)度值分別為655和642)，而表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝桿菌對EtBr的積累(△熒光強(qiáng)度值為395)較MmpL5組和pMV261s空質(zhì)粒組減少約40%(表1)，說明MmpS5-MmpL5蛋白具有外排能力，而沒有MmpS5的MmpL5蛋白不能形成外排泵。

表1 不同重組的恥垢分枝桿菌對溴化乙錠的積累影響

七、Bdq對表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝桿菌體內(nèi)ATP含量影響較小

使用1/2 MIC濃度的Bdq作用24 h后，比較藥物作用前后菌體內(nèi)ATP含量的變化。Bdq作用前表達(dá)MmpL5蛋白組菌體ATP水平[(0.193±0.028) μmol/L)]、表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白組菌體ATP水平[(0.197±0.018) μmol/L]與攜帶pMV261s質(zhì)粒組菌體ATP水平[(0.181±0.013) μmol/L]相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.539，P=0.609)。Bdq作用后，表達(dá)MmpL5蛋白組菌體ATP水平[(0.056±0.009) μmol/L]與pMV261s空質(zhì)粒組菌體內(nèi)ATP水平[(0.055±0.008) μmol/L]相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=62.914，P=0.929)。藥物作用后，表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的重組恥垢分枝桿菌內(nèi)ATP水平[(0.125±0.010) μmol/L]降低36.49%，而表達(dá)MmpL5蛋白組菌體ATP水平降低71.21%，空質(zhì)粒組菌體ATP水平降低69.49%，表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白組菌體ATP水平明顯高于表達(dá)MmpL5蛋白組和空質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.172，P=0.049)。這提示MmpS5與MmpL5蛋白作為復(fù)合體導(dǎo)致菌體外排Bdq能力增加，使Bdq作用于ATP合成酶的量減少，從而使菌體內(nèi)ATP水平下降較少。

討 論

外排泵能夠?qū)⒕w內(nèi)藥物泵出，外排泵過表達(dá)使得菌體內(nèi)藥物濃度不能有效抑制分枝桿菌生長，是MTB耐藥的重要原因之一。MmpL是分枝桿菌基因組編碼的一組膜蛋白，屬于外排泵RND蛋白超家族，在脂質(zhì)、聚合物和免疫調(diào)節(jié)劑的運輸過程中發(fā)揮重要作用[7]。筆者團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，Bdq和氯法齊明對Rv0678突變的MTB交叉耐藥[6, 8-9]，Rv0678突變導(dǎo)致mmpL5和mmpS5表達(dá)的上調(diào)[5, 10]。近年研究表明，MmpS5-MmpL5系統(tǒng)也可以轉(zhuǎn)運分枝菌素[11]。MTB編碼13種MmpL蛋白，其中，MmpL5蛋白(Rv0676c基因編碼)由964個氨基酸組成，理論相對分子質(zhì)量為104 800，由12個跨膜結(jié)構(gòu)域及2個周質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成[12]。附屬蛋白MmpS5(Rv0677c基因編碼)由142個氨基酸組成，理論相對分子質(zhì)量為15 200。mmpL5在轉(zhuǎn)錄上與mmpS5基因相偶聯(lián)，二者位于同一操縱子內(nèi)，受下游的轉(zhuǎn)錄抑制因子Rv0678的調(diào)控[13]。Andries 等[5]在MTB中單獨過表達(dá)MmpS5蛋白沒有改變Bdq對其的MIC值，提示單一的MmpS5蛋白對藥物外排無影響，因此，本研究中沒有單獨構(gòu)建MmpS5蛋白。

膜蛋白的表達(dá)與純化一直是蛋白研究的技術(shù)難題，筆者課題組前期在BL21plys大腸桿菌及C43大腸桿菌中多次嘗試表達(dá)膜蛋白MmpL5蛋白都未能獲得理想結(jié)果，可能是外源膜蛋白在大腸桿菌中的毒性、錯誤折疊、聚集等導(dǎo)致表達(dá)量低。MTB的MmpL5與恥垢分枝桿菌同源MSMEG_1382的序列相似性為62.96%，表明MmpL5蛋白表達(dá)相應(yīng)的條件在恥垢分枝桿菌可能具備。恥垢分枝桿菌無傳染性和致病性，生長較快、操作較為容易[14]。這些特點都是恥垢分枝桿菌作為表達(dá)宿主菌的優(yōu)勢。乙酰胺酶啟動子是一種強(qiáng)啟動子，在恥垢分枝桿菌中受到嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控, 誘導(dǎo)后高水平表達(dá)[14]。Zhang等[15]利用乙酰胺酶啟動子構(gòu)建了MmpL3表達(dá)載體，成功實現(xiàn)了在恥垢分枝桿菌中表達(dá)和純化。本研究通過改造pMV261穿梭載體，建立了帶有組氨酸標(biāo)簽的乙酰胺誘導(dǎo)型表達(dá)載體pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5，蛋白免疫印跡驗證了蛋白在恥垢分枝桿菌的成功表達(dá)。

本研究通過Bdq對3種重組菌株的藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝桿菌會降低Bdq對其的活性，而僅表達(dá)MmpL5蛋白的重組恥垢分枝桿菌對Bdq的藥物敏感性無影響。這與Yamamoto 等[16]發(fā)現(xiàn)MmpS5促使MmpL5蛋白單聚體組裝成三聚體發(fā)揮功能的結(jié)果一致。EtBr是一種熒光染料，是多數(shù)外排泵的轉(zhuǎn)運底物，通常被用作測試藥物外排泵活性的通用型底物[17]。重組恥垢分枝桿菌對EtBr的積累實驗表明，MmpS5-MmpL5蛋白表達(dá)比MmpL5蛋白單獨表達(dá)和空質(zhì)粒組對EtBr的積累量較少，其外排能力增加。單獨MmpL5蛋白表達(dá)與空質(zhì)粒相比沒有差異，進(jìn)一步說明MmpS5和MmpL5蛋白共表達(dá)形成外排泵，發(fā)揮生物學(xué)功能。貝達(dá)喹啉的作用靶點是ATP合成酶，進(jìn)而導(dǎo)致菌體內(nèi)的ATP合成減少而發(fā)揮抗菌作用。為了考察Bdq通過MmpS5-MmpL5蛋白外排影響菌體內(nèi)ATP水平，筆者在1/2 MIC濃度的Bdq作用下，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝桿菌菌體內(nèi)ATP含量較表達(dá)MmpL5蛋白和攜帶空質(zhì)粒組變化小。結(jié)合MmpS5-MmpL5蛋白共表達(dá)導(dǎo)致的外排能力增強(qiáng)，表明MmpS5-MmpL5蛋白外排系統(tǒng)以Bdq為底物，通過增加Bdq的外排量使菌體內(nèi)Bdq的含量降低，進(jìn)而使Bdq抑制靶點ATP合成酶的量減少，導(dǎo)致菌體內(nèi)ATP水平的變化較少。

綜上所述，筆者構(gòu)建了MTB的膜蛋白MmpL5及外排泵MmpS5-MmpL5在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)體系。功能實驗也表明了MmpS5-MmpL5蛋白共表達(dá)形成外排泵發(fā)揮作用，降低Bdq的藥物敏感性。本研究深化了對Bdq耐藥機(jī)制的理解，而膜蛋白表達(dá)體系的建立為蛋白的純化和進(jìn)一步研究Bdq的轉(zhuǎn)運機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。