仕治達 陶國振 伍玲園 盛連兵 董芳地 楊慧軍 邱毅

男性不育癥中無精子癥約占5%～10%[1-2]。 來自美國的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，無精子癥中60%為非阻塞性無精子癥(non-obstructive azoospermia,NOA)[3]。隨著卵細胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的廣泛使用，顯微切開睪丸取精術(shù) (Microdissection testicular sperm extraction,M-TESE)也愈發(fā)成為NOA的主要取精方式，并使許多男性NOA不育患者使用M-TESE結(jié)合ICSI-IVF生育了自己生物學(xué)子女。最近研究報道[4-5]，通過 M-TESE 可顯著提高NOA 患者手術(shù)獲精概率。目前山東地區(qū)顯微取精病例報道較少，本文就這方面病例報告如下。

資料與方法

1.臨床資料：2018 年1～12月在山東省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心接受M-TESE的NOA 患者共 11例,11例男性不育癥患者年齡22～37歲，平均年齡(32.4±4.5)歲；不育年限2～10年，平均(5.2±3.1)年，其中睪丸發(fā)育不良5例，克氏綜合征2例，Y染色體AZFc、d缺失1例(sy254、sy255、sy145、sy152)，睪丸炎(病毒性腮腺炎并雙側(cè)睪丸炎)并微結(jié)石1例，隱睪術(shù)后1例(雙側(cè)隱睪，15歲手術(shù))，特發(fā)性無精子癥(睪丸大小正常)1例。患者至少3次精液常規(guī)檢查并離心沉淀鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子，性激素水平、精漿生化、睪丸體積測量(模型法及B超)等檢驗檢查提示為非梗阻性無精子癥患者。且排除不射精，逆行射精及未經(jīng)治療的低促性腺激素綜合征。手術(shù)及ICSI方案均獲得山東省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)；所有患者術(shù)前均簽署手術(shù)知情同意書。

2.睪丸B超：B超探查雙側(cè)睪丸、精索及附睪等。使用彩色三維B超診斷系統(tǒng)，7.5MHz探頭探查睪丸、附睪及精索等。睪丸體積(cm3)的計算公式=0.52×長徑(cm)×寬徑(cm)×厚徑(cm)。

3.生殖內(nèi)分泌激素測定：空腹，常規(guī)抽靜脈血2 mL。分離血清，即將血樣置于37℃水浴箱30 min，待測血液完全凝固后再取出，1 500 rpm/min離心15 min分離血清。取300 uL血清上機，采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成激素(luteinizing hormone,LH)、睪酮(testosterone,T)，F(xiàn)SH、LH、T試劑購自BECKMAN COULTER公司。

4.術(shù)前用藥及M-TESE操作：患者術(shù)前常規(guī)治療1～2個生精周期，hCG 2 000 iU加HMG 75 iU，3 d一次肌注，加他莫昔芬50 mg每天兩次。手術(shù)中采用硬膜外麻醉。取陰囊前壁正中切口，逐層切開至睪丸白膜。手術(shù)顯微鏡下放大6倍觀察，在睪丸表面無血管區(qū)沿睪丸赤道軸切開白膜，顯露生精小管。手術(shù)顯微鏡放大6～20倍觀察，逐層、分區(qū)尋找外觀飽滿、粗大、乳白色半透明或不透明的生精小管。用顯微鑷子取出，放入培養(yǎng)液中送胚胎實驗室。在體視鏡下切碎后，于倒置顯微鏡下( × 400)尋找精子，精子獲得率( sperm retrieval rate，SRR=成功取精例數(shù)/總手術(shù)例數(shù))。部分患者(包括M-TESE找到精子的患者及未找到精子的患者)取睪丸組織送病理學(xué)檢查。4-0可吸收線間斷縫合睪丸白膜，還納睪丸并依次縫合陰囊壁。

5.睪丸組織病理學(xué)：M-TESE手術(shù)中剪取睪丸組織，2%戊二醛和3%多聚甲醛的混合物固定，包埋在甲基丙烯酸乙二醇酯(GMA)中，切片，并用蘇木精和曙紅(HE)染色。

6.ICSI-IVF-ET：本中心在建立穩(wěn)定的體外受精胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)基礎(chǔ)上，采用控制性超排卵方案并使用顯微操作系統(tǒng)，對M-TESE獲取精子NOA患者行ICSI術(shù)治療。

7.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件，采用t檢驗分析比較手術(shù)前后性激素變化。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1. 睪丸B超及組織學(xué)觀察：B超睪丸體積平均(8.7±6.9)cm3；1例患者B超睪丸內(nèi)見散在強回聲光團，考慮微小結(jié)石(圖1A)，病理切片見白色微小結(jié)石(圖1B)，曲細精管可見少量精原細胞及較多的精母細胞，中心部可見極少量精子細胞，曲細精管見多灶性鈣化。M-TESE未見精子者睪丸組織切片內(nèi)也未見生精細胞及精子，僅見支持細胞(圖2A)；M-TESE發(fā)現(xiàn)精子者，睪丸組織學(xué)觀察到萎縮的曲細精管，尚有小部分生精細胞(圖2B)。

2. M-TESE結(jié)果：11 例NOA患者，5例患者成功M-TESE取精，SRR=45.5%。病因分類統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)睪丸發(fā)育不良3例，睪丸炎并微結(jié)石1例 ，AZFc、d 區(qū)缺失1例。取精術(shù)后3 d出院，11例患者均未發(fā)生陰囊皮膚感染、血腫、睪丸萎縮、術(shù)后勃起功能下降等并發(fā)癥。M-TESE結(jié)果見表1。

A：睪丸B超，紅色箭頭所指白色強光團為睪丸微結(jié)石；B：睪丸病理，藍色箭頭所指為睪丸微結(jié)石(HE染色，放大10×10)。圖1 睪丸B超及病理結(jié)果

A：睪丸生精功能缺失，曲細精管內(nèi)僅見支持細胞(OSCS)，未見生精細胞及精子；B：部分曲細精管內(nèi)可見少量生精細胞。圖2 睪丸病理(HE染色，高倍10×40)

表1 NOA 患者M-TESE情況

3.M-TESE 獲得精子患者配偶 ICSI-IVF結(jié)果：M-TESE 獲取精子的5例患者中，平均獲卵數(shù)16個，正常受精數(shù)9個，可利用胚胎數(shù)6個。5例患者均使配偶懷孕，1例AZFc、d 區(qū)缺失患者配偶孕3月胚胎停育(未進行胚胎染色體及AZF基因檢測)，1例睪丸發(fā)育不良患者配偶孕1月自然流產(chǎn)(未進行胚胎染色體及基因檢測)，其余3例患者配偶成功生育4名胎兒，胎兒產(chǎn)前診斷均未見異常。見表2。

4.手術(shù)前后生殖內(nèi)分泌激素變化：FSH、LH、T術(shù)后6個月較術(shù)前未見明顯改變，見表3。

獲得精子與未獲得精子患者FSH、LH、T差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表2 NOA 患者M-TESE獲精子ICSI情況及妊娠結(jié)局(n=5)

表3 NOA患者行睪丸顯微取精術(shù)前后體內(nèi)激素水平的變化

討論

目前認為，NOA發(fā)病主要由睪丸生精功能障礙引起的精子發(fā)生缺陷，是男性生殖醫(yī)學(xué)中的常見病和疑難病[6]。近年來，隨著顯微取精技術(shù)的發(fā)展，認為睪丸生精功能具有局灶性和不均一性。在顯微鏡放大下觀察曲細精管的質(zhì)量差異，尋找可用精子；聯(lián)合ICSI-IVF-ET，實現(xiàn)NOA患者孕育具有自己生物學(xué)后代的愿望成為現(xiàn)實。本研究11例無精癥不育患者，M-TESE后5例取出精子，占45.5%，均獲得妊娠，妊娠率100%；2例自然流產(chǎn)；3例成功生育健康嬰兒(4胎)，正常生育率60%。由于獲取精子太少，精子形態(tài)及頂體發(fā)育未進行相關(guān)染色檢查，只是在高倍顯微鏡下判斷。

目前，NOA患者M-TESE模式主要包括兩種：第一，非同步手術(shù)，男方先行顯微取精手術(shù)，發(fā)現(xiàn)精子，冷凍保存，女方取卵日使用解凍的精子，ICSI助孕治療。第二，同步顯微取精備供精，即女方取卵日當(dāng)天，男方行M-TESE，為預(yù)防取精失敗，建議精子庫供精備用。取到精子，聯(lián)合ICSI助孕治療；取不到精子，行供精-體外受精助孕治療。本中心目前開展的是同步顯微取精備供精。目前對于同步或非同步手術(shù)，國內(nèi)外研究結(jié)果存在爭議，2018年Vij等[7]對男性非梗阻性無精子研究認為，新鮮的精子與解凍的精子對體外受精成功率的影響差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

NOA患者在手術(shù)之前，為幫助其做出最有利于自己的治療方案，M-TESE術(shù)前的SRR預(yù)測尤為重要。近期，國外的研究[7-10]報告了NOA患者M-TESE獲精率為40%～65%。國內(nèi)研究[4,11-13]報告NOA患者M-TESE治療的SRR為36%～44.4%，國內(nèi)SRR取精率低的主要原因考慮為患者經(jīng)門診TESE術(shù)后鏡檢及病理未見精子，然后嘗試性行M-TESE尋找可用精子。而國外多數(shù)為診斷為NOA后直接行M-TESE。本研究M-TESE獲精率為45.5%，這些患者術(shù)中見睪丸少量曲細精管發(fā)育較好，睪丸病理組織切片可見少量生精細胞。而M-TESE未獲精者睪丸曲細精管極度萎縮，透明樣變，病理組織切片僅見支持細胞(OSCS)，無生精細胞及精子。

診斷性檢查評估SRR除包括全面的臨床病史、體格檢查，還應(yīng)該包括性激素中總睪酮(T)和促卵泡激素(FSH)、染色體、Y染色體AZF微缺失的檢測，部分患者需要睪丸組織研磨后鏡檢和病理活檢的檢查[14]。Bryson等[15]分析了1 127例NOA患者，根據(jù)睪丸體積大小分為<2 mL、2～10 mL、>10 mL三組，精子獲得率分別為55%、56%和55%。Plotton等[16]發(fā)現(xiàn)睪丸體積≤2 mL與睪丸>10 mL組患者的SRR差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究5例睪丸發(fā)育不良患者，3例取到精子，SRR為45.5%,考慮可能與病例數(shù)較少有關(guān)。Ramasamy等[17]分析了792例NOA患者，按FSH水平分為4組，即<15 U/L、15～30 U/L、31～45 U/L和>45 U/L，其精子獲得率分別為51%、60%、67%和60%。Amer等[18]對比1 395例M-TESE患者，高FSH不能預(yù)測NOA患者的SRR。國內(nèi)外多中心研究證實盡管睪丸體積以及性激素FSH、LH、T水平是預(yù)測睪丸生精功能的重要指標(biāo)，但均不能有效地預(yù)測M-TESE能否找到精子[18]。

NOA患者的明確病因可作為顯微取精的有效預(yù)測指標(biāo)，無論是先天性的Klinefelter綜合征、Y染色體AZF微缺失還是繼發(fā)性的睪丸炎、睪丸扭轉(zhuǎn)。毛加明等[19]研究分析非嵌合型克氏綜合征患者的精子獲得率為39.8%，AZFc缺失患者精子獲得率為62.4%，隱睪導(dǎo)致的NOA，其精子獲得率為64.1%。國內(nèi)外學(xué)者報道[20-21]Klinefelter綜合征患者可以將顯微取精作為首選；Y染色體AZF微缺失患者中，AZFc缺失獲精率較高，但是合并AZFa或AZFb缺失的不建議行M-TESE；睪丸炎、隱睪術(shù)后的NOA患者術(shù)中可見多數(shù)曲細精管小管纖細、透明、無張力，少數(shù)具有生精功能的曲細精管則是粗大、飽滿、富有張力的局灶團，容易顯微鏡下術(shù)中鑒別；特發(fā)性NOA患者睪丸大小正常，術(shù)中生精小管均一，飽滿，張力性好，與具有生精功能正常的曲細精管難以區(qū)別。本研究顯微取精有明確病因的5例，兩例克氏綜合征均未找到精子，考慮與病例較少以及患者睪丸體積太小(1 cm3)相關(guān)。Zhang等[22]研究159例克氏綜合征患者，平均體積未到4 cm3，睪丸體積與獲精率無相關(guān)性。雙側(cè)隱睪術(shù)后患者未找到精子，考慮與患者25歲行睪丸下降手術(shù)有一定相關(guān)性。AZFc、d區(qū)缺失1例以及睪丸炎后嚴(yán)重睪丸微結(jié)石1例M-TESE均獲取到精子。

NOA伴有嚴(yán)重睪丸微石癥行顯微取精手術(shù)目前國內(nèi)未見報道。國內(nèi)外的研究[23-24]報告了睪丸微石癥與不育相關(guān)，是引起精液質(zhì)量下降的原因之一。本研究1例患者，術(shù)前B超示嚴(yán)重睪丸微石癥，行睪丸穿刺細胞學(xué)檢查，鏡檢未見精子，穿刺病理示有極少量精子細胞，曲細精管見多灶性鈣化，M-TESE后獲取精子，ICSI-IVF-ET成功生育健康兒。Richenberg等[25]研究這種病例的發(fā)病機制考慮兩個方面，即一、睪丸炎引起睪丸內(nèi)吞噬細胞無法將生精小管管壁變性、脫落的細胞碎屑吞噬，使其聚集于生精小管，羥基磷灰石沉積于其上引起鈣質(zhì)沉積，膠原纖維樣物質(zhì)聚集、包繞形成微結(jié)石；二、睪丸微結(jié)石造成精液質(zhì)量下降的機制可能是生精小管內(nèi)的微結(jié)石導(dǎo)致其阻塞，影響睪丸血流及生精小管功能，進一步影響精子的產(chǎn)生及活動能力。

睪丸穿刺活檢病理結(jié)果對精子獲得率也有一定的預(yù)測作用。Amer等[8]研究1 395例NOA患者病理分析生精功能降低為100%，精母細胞停滯為60.8%，初級精母細胞停滯率為25.5%，次級精母細胞停滯率為27.9%，管狀硬化為33.8%，唯支持細胞綜合征為29.6%。Abdel等[26]研究M-TESE在生精低下患者中的SRR為81%～100%,在精子成熟障礙患者中為36.4%～75%，在唯支持細胞綜合征患者中的SRR為22.5%～41%。此外，每個NOA患者的伴侶也應(yīng)該進行系統(tǒng)的檢查評估，以準(zhǔn)備使用ICSI進行輔助生殖。

NOA患者在M-TESE手術(shù)之前建議咨詢專業(yè)生殖男科醫(yī)師，以尋求內(nèi)源性睪酮治療原發(fā)性睪丸功能衰竭。一項多中心研究表明，使用氯米芬、hCG、HMG聯(lián)合治療NOA患者，SRR為57%，高于未經(jīng)治療的34%，Hussein等[27]報告使用枸櫞酸氯米芬，通過優(yōu)化睪丸內(nèi)睪酮水平，提高M-TESE取精率。本研究11例患者，術(shù)前用藥方案是hCG 2 000 iU加HMG75 iU，3 d一次肌注，加他莫昔芬50 mg每天兩次，治療1～2個生精周期。Vij等[7]建議hCG 1 000～3 000 iU，每周給藥兩到三次，鼻內(nèi)滴注，3～6個月。 如果在6個月內(nèi)精液未見精子，則增加HMG 75 iU，每周兩次至三次，鼻內(nèi)滴注，3個月，精液未見精子，則再增加HMG 75 iU。如果精液中沒有找到精子，這種給藥方案可以延長至6個月以上。

目前，已經(jīng)有許多的臨床研究報道指出，M-TESE可能會對患者本身造成一定的影響，但是較傳統(tǒng)的穿刺取精，術(shù)后的急性期和長期的并發(fā)癥發(fā)生率低。研究報道M-TESE術(shù)后1 個月的血清睪酮水平較術(shù)前有明顯的下降[21]，術(shù)后6個月有所恢復(fù)，術(shù)后1年基本恢復(fù)到術(shù)前狀態(tài)。本研究患者術(shù)后激素變化未見明顯差異，考慮樣本量較少，同時11例患者均只行單側(cè)M-TESE，對患者性激素影響較少。M-TESE作為臨床剛開始的技術(shù)，相對保守，在今后的治療中，如果一側(cè)睪丸內(nèi)未找到精子，需要進行對側(cè)睪丸M-TESE。

總之，NOA患者行顯微取精以前，建議行診斷性評估及咨詢，明確手術(shù)的風(fēng)險以及取精率的可能性。應(yīng)嚴(yán)格掌握手術(shù)指征并慎重選擇術(shù)式。此外，手術(shù)醫(yī)師需要經(jīng)過顯微操作訓(xùn)練，并配備顯微手術(shù)設(shè)備，同時需要泌尿男科與生殖醫(yī)學(xué)科的多學(xué)科合作。