楊 雯,石 妍
(1.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,內蒙古 呼和浩特 010000;2.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,內蒙古 包頭 014000)
肉蓯蓉,始載于《神農本草經》,在歷代補益性中藥處方中出現率占第1位[1]。現在普遍認為我國肉蓯蓉屬植物有4種和1變種,分別為肉蓯蓉(又名荒漠肉蓯蓉)Cistanche deserticola Y.C.Ma、管花肉蓯蓉C.tubulosa(Schenk)Wight、鹽生肉蓯蓉C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck、沙蓯蓉 C.sinensis G.Beck 及白花鹽蓯蓉 C.salsa var.albiofora P.F.Tu et Z.C.Lou,var.nov[2]。目前市場上流通的藥材肉蓯蓉主要來源于荒漠肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉和沙蓯蓉這4種肉蓯蓉屬植物,其中,荒漠肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉和沙蓯蓉為我區(qū)地產品種。由于對肉蓯蓉的開發(fā)較早,人們對于荒漠肉蓯蓉的認識較深,應用也更為廣泛,而對鹽生肉蓯蓉和沙蓯蓉的研究并不深入。蓯蓉類藥材的化學成分包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、多糖類、生物堿類、揮發(fā)油類等多種活性成分[3-6]。其中,苯乙醇苷類是主要化學成分,具有補腎壯陽、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、增強記憶力之功效[7-12]。故本課題將對苯乙醇苷類活性成分進行測定分析,為今后肉蓯蓉類藥材的評價提供參考依據。
島津LC-20A型高效液相色譜儀;KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AE100型萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);ME5型百萬分之一天平(德國賽多利斯公司)。
對照品毛蕊花糖苷(111530-201713,中國食品藥品檢定研究院)、松果菊苷(111670-201706,中國食品藥品檢定研究院)。
色譜乙腈(SIGMA-ALDRICH)、色譜甲醇(SIGMA-ALDRICH)、甲醇、甲酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)、實驗用水為純化水。
實驗共收集到13批鹽生肉蓯蓉藥材,具體情況見表1所示。
表1 鹽生肉蓯蓉藥材采收情況表
色譜條件如下[13-16],色譜柱:AlltimaC18柱(250×4.6mm5μm),流動相:甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫程序見表2,流速:1.0mL·min-1,柱溫:35℃,檢測波長:330nm;進樣量:10μL。HPLC色譜圖見圖1,光譜圖見圖2。
鹽生肉蓯蓉混合對照品
松果菊苷光譜圖
表2 流動相洗脫程序
精密稱取干燥的鹽生肉蓯蓉粉末(65目)約1.0g,加入70%甲醇溶液50mL,稱量,浸泡30min后,超聲提取30min后,放冷后加70%甲醇補足減失的重量,濾過,取續(xù)濾液以0.45μm微孔濾膜濾過,即得。
分別精密稱取松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品適量,采用30%的甲醇溶解,分別制成每1mL含0.50mg、0.40mg的對照品溶液,即得混合對照品溶液,保存于4℃冰箱中,備用。
2.4.1 線性范圍
精密吸取上述混合對照品溶液1.0μL、2.0μL、6.0μL、10.0μL、15.0μL、20.0μL、25.0μL進行測定,所得結果見表3,表明對照品在各自進樣范圍內呈良好的線性關系。
表3 回歸方程及線性范圍
2.4.2 精密度試驗
精密吸取同一混合對照品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,測定松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積積分值,計算RSD分別為0.19%、0.26%。結果表明儀器精密度良好。數據見表4。
表4 精密度試驗數據
2.4.3 穩(wěn)定性試驗
精密吸取同一供試品溶液(Y5樣品)10μL,于制備后0h、2h、4h、8h、12h分別進樣測定松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積積分值,計算RSD分別為0.32%、0.47%,結果表明供試品溶液在12h內穩(wěn)定。數據見表5。
表5 穩(wěn)定性試驗數據
2.4.4 重復性試驗
精密稱取同一供試品(Y5樣品)6份,按照上述方法進行供試品溶液的制備,并按上述色譜條件分別進樣10μL。測定計算松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的平均值(n=6)分別為1.47%、0.87%,RSD分別為0.53%、0.93%。結果表明方法重復性較好。數據見表6。
表6 重復性試驗數據
2.4.5 加樣回收試驗
取同一供試品(Y5),平行取樣精密稱定6份置于錐形瓶中,各約0.25g,分別將適量對照品溶液加入各錐形瓶中,按上述方法制備供試品溶液,按外標法計算松果菊苷、毛蕊花糖苷的平均回收率依次為99.9%、98.8%,RSD依次為0.39%、1.11%(n=6),表明該方法測定結果準確。試驗數據見表7。
表7 加樣回收試驗
2.4.6 耐用性試驗
取同一供試品溶液(Y3),采用不同色譜柱,按上述色譜條件進行測定,計算鹽生肉蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷的平均含量,RSD均小于3%,表明該方法對于不同色譜柱的耐用性良好,試驗數據見表8。
表8 不同色譜柱測得鹽生肉蓯蓉3號樣中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量
取13批鹽生肉蓯蓉,制備成供試品溶液后進行測定,結果分別見表9。
表9 鹽生肉蓯蓉含量測定結果(n=2)
本實驗對提取溶劑進行考察:分別考察了以30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇為提取溶劑制備供試品溶液,結果顯示當以70%甲醇溶液進行提取時,鹽生肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量達到最大值。故選擇70%甲醇溶液作為提取溶劑。對提取時間進行考察:本實驗分別考察了超聲時間15min、30min、45min、60min對待測成分的提取效果,測定結果顯示當超聲提取時間為30min時,鹽生肉蓯蓉中苯乙醇苷類含量達最高,并且在45min以后含量下降,故選擇超聲時間為30min。對超聲功率進行考察:考察了250W、400W、500W對待測組分的影響,結果表明各功率下提取效率基本一致,故參照2015版藥典肉蓯蓉項下供試品溶液制備的超聲條件:功率250W、頻率40kHz。
本實驗考察了4種流動相,分別為甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水,結果顯示,采用甲醇-0.1%甲酸水流動相系統(tǒng),各峰的基線平穩(wěn)、峰形好,且各待測成分的分離度符合要求,因此,最終采用甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)作為流動相系統(tǒng)。同時,本實驗也考察了不同型號色譜柱Shim-pack C18(250mm×4.6mm,5μm)、Agilentzobarx C18(250mm×4.6mm,5μm)、Alltima C18(250mm×4.6mm,5μm)對測定結果的影響,結果表明采用不同色譜柱對實驗結果沒有影響,耐用性良好。