吳 旭，徐 明，潘 洋

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是胃粘膜層和粘膜下層因胃腸防御因素與進攻因素的生物學狀態(tài)失衡從而發(fā)生病理學改變［1］，以上腹部周期性、節(jié)律性疼痛，伴有反酸、噯氣、上腹部有局限性壓痛為主要臨床表現(xiàn)的消化系統(tǒng)疾?。?］。西醫(yī)常選用質(zhì)子泵抑制劑、胃酸中和劑、胃粘膜保護劑、抗生素等治療胃潰瘍，患者長期使用會有諸多不良反應(yīng)，且病情容易反復［3］。中醫(yī)雖沒有胃潰瘍這一病癥，但從臨床表現(xiàn)來看可將其歸屬于“胃痛”“胃癰”等范疇，在整體思想和辨證論治的引導下運用中醫(yī)療法，療效可觀，并能大大提高患者的生活質(zhì)量。

清熱瀉火之法是中醫(yī)藥治療胃潰瘍的主要方法之一，經(jīng)典名方——瀉心湯具有苦寒直折、清瀉胃火之功。瀉心湯出于《金匱要略》，又名三黃瀉心湯，由黃連、黃芩、大黃3 味中藥構(gòu)成。黃連味苦性寒，歸心、肝、膽、脾、胃經(jīng)，功能為清熱燥濕、瀉火解毒；黃芩味苦性寒，歸肺、膽、脾、大腸，功能為清熱燥濕、瀉火解毒，止血；大黃，味苦性寒，歸脾、胃、大腸、心包經(jīng)，功能為瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒。三藥合用，苦寒直折，清瀉火熱之邪。瀉心湯在中醫(yī)臨床中應(yīng)用頗為廣泛，現(xiàn)代研究認為其具有抗炎、抑菌、抗幽門螺桿菌、保護胃粘膜、抑制腫瘤生長等多種藥理學作用［4-8］，可用于治療消化性潰瘍、幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、胃癌等多種消化系統(tǒng)疾病。有學者用瀉心湯結(jié)合溫針灸治療胃潰瘍患者30 例，臨床總有效率為93.33%［9］。有學者用瀉心湯結(jié)合針刺治療消化性潰瘍患者53 例，結(jié)果顯示，患者臨床癥狀顯著改善，血清中IL-6、TNF-α 和TGF-β1 較治療前明顯降低［10］。有學者將102 例幽門螺桿菌陽性慢性胃炎隨機分成治療組和觀察組，每組各51 例，治療組予瀉心湯和抗生素，觀察組予抗生素，結(jié)果顯示，治療組總有效率明顯高于對照組［11］。有學者在體外試驗中發(fā)現(xiàn)，瀉心湯可以顯著抑制胃癌細胞的增殖［8］。

從中醫(yī)學角度分析，胃潰瘍的發(fā)病可認為是濕熱之邪壅聚于胃，久而不去，蘊而化熱，熱盛肉腐，釀發(fā)癰瘍而成，且需清熱燥濕、瀉火解毒而治之。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，以“成分-靶點-通路”相互作用關(guān)系為引導思路，從多層次、多方向、多角度對瀉心湯治療胃潰瘍的作用機制進行分析，希望通過“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)使中醫(yī)藥治療胃潰瘍的作用機制得以具體化、精準化、可視化，為進一步探討瀉心湯治療胃潰瘍作用機理奠定基礎(chǔ)。

1 研究過程與方法

1.1 瀉心湯有效成分的篩選

瀉心湯的組成為黃連、黃芩、大黃。在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中檢索3 味中藥的化學成分?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）是指口服藥物后，入血且可被機體吸收及利用的藥量與給藥量的比率；類藥性（drug-likeness，DL）是指化合物與已知藥物的相似性。當二者值越大時，則代表化合物對人體越有科學研究價值。本文參照了以往網(wǎng)絡(luò)藥理學研究準則，將OB≥30%、DL≥0.18 作為有效成分的納入標準。

1.2 有效成分作用靶點的篩選

在TCMSP 平臺上查找有效成分的作用靶點，利用UniProt數(shù)據(jù)庫查詢靶點所對應(yīng)的人類基因組名稱。

1.3 胃潰瘍靶點基因的收集

以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取胃潰瘍的相關(guān)靶點基因。

1.4 瀉心湯與胃潰瘍共同靶點基因的獲取

在在線韋恩圖平臺中輸入上文獲得的有效成分靶點基因和胃潰瘍靶點基因，以獲取瀉心湯與胃潰瘍的共同靶點基因，并繪制韋恩圖。使用Cytoscape 3.7.1 軟件繪制“中藥-有效成分-交集靶點基因”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

在String 平臺中上傳上文獲得的“瀉心湯與胃潰瘍共同靶點基因”，物種設(shè)置選擇“Homo sapiens”，其他參數(shù)項為默認值，分析蛋白質(zhì)的相互作用，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，下載 TSV 文件。使用Cytoscape 3.7.1 對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，取度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、緊密度中心性（closeness centrality，CC）的上四分位數(shù)，篩選出瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點基因。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析

在Metascape 數(shù)據(jù)庫中輸入上文獲得的“瀉心湯與胃潰瘍共同靶點基因”，在“物種設(shè)置”項選擇“H.sapiens”，設(shè)定P＜0.01 后，進行生物學過程（gene ontology）和代謝通路（KEGG pathway analysis）富集分析，利用在線網(wǎng)絡(luò)作圖工具Bioinformatics 繪制富集圖。

1.7 構(gòu)建“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

將藥物及其有效成分、關(guān)鍵靶點基因、KEGG 富集通路（Count 值排名前20）導入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構(gòu)建“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瀉心湯有效成分及作用靶點篩選結(jié)果

以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中查詢到瀉心湯有效成分共63 個，其中黃連14 個，黃芩36個，大黃16 個（黃連與黃芩有2 個相同有效成分，大黃與黃芩有1 個相同有效成分），部分有效成分信息見表1。

表1 瀉心湯有效成分基本信息（部分）

續(xù)表1

將瀉心湯的63個有效成分導入TCMSP數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲得900 個作用靶點，其中黃連285個，黃芩506 個，大黃109 個。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中查詢靶點對應(yīng)的人類基因名稱，然后進行基因名標準化處理。

2.2 胃潰瘍與瀉心湯共同靶點基因的獲取結(jié)果

以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中查詢到胃潰瘍相關(guān)靶點基因5 066 個，以得分≥5 為篩選條件進行篩選后得到960 個。瀉心湯的靶點基因去重后有228 個。在在線韋恩圖平臺上輸入胃潰瘍的重要靶點基因（得分≥5）和瀉心湯的去重靶點基因后得到109 個交集靶點基因，見圖1。將中藥、與交集靶點有直接作用關(guān)系的有效成分、交集靶點基因?qū)隒ytoscape 3.7.1 軟件中制作“中藥-有效成分-交集靶點基因”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖1 瀉心湯與胃潰瘍交集靶點基因韋恩圖

圖2 “中藥-有效成分-交集靶點基因”網(wǎng)絡(luò)

圖2 所示的網(wǎng)絡(luò)中共有155 個節(jié)點、400 條連線，圓形表示中藥，六邊形表示有效成分（A1、A2 為黃連和黃芩共有成分，B 為大黃和黃芩共有成分），菱形表示交集靶點基因。其中節(jié)點越大，連線越密，則說明重要性越高，有效成分中HL10（槲皮素）、HQ2（漢黃芩素）、HQ4（黃芩素）、HQ1（刺槐素）、DH13（蘆薈大黃素）的節(jié)點較大，連線較密，分別對應(yīng)度值為96、29、19、14、14。

2.3 瀉心湯治療胃潰瘍的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）結(jié)果

將上文獲得的109 個交集靶點基因上傳至String 平臺進行蛋白相互作用分析，創(chuàng)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3，下載TSV 文件。在Cytoscape 3.7.1 軟件中對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行可視化，取度中心性（DC）、介度中心性（BC）、緊密度中心性（CC）的上四分位數(shù)，篩選出瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點基因，見圖4。

圖3 瀉心湯治療胃潰瘍的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 瀉心湯治療胃潰瘍關(guān)鍵靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 所示的網(wǎng)絡(luò)中包含25 個節(jié)點和598 條連線，故這25 個節(jié)點可能是瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點基因。其中節(jié)點越大，顏色越深，連線越密越粗，則說明地位越重要。AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA 的節(jié)點較大，顏色較深，連線較密較粗，度值分別為94、94、88、87、87，所以瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點基因可能為AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA。

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集結(jié)果

將瀉心湯和胃潰瘍的交集靶點基因上傳至Metascape 數(shù)據(jù)庫中進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.01，獲得1 803 個GO 條目，其中生物過程（biological processes，BP）1 598 個，主要包括對無機物的應(yīng)答、細胞凋亡的正調(diào)控、對激素的應(yīng)答、細胞增殖的負調(diào)控、細胞粘附的調(diào)控；細胞組成（cellular components，CC）64 個，主要包括膜筏、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合物；分子功能（molecular functions，MF）141 個，主要包括激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體化活性，相關(guān)條目見圖5；KEGG 富集通路176 條，主要包括癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路。取Count 值排名前20 的KEGG 富集通路，將其導入Bioinformatics 網(wǎng)站中制作高級氣泡圖，見圖6。

圖5 瀉心湯治療胃潰瘍的GO 功能富集圖

圖6 瀉心湯治療胃潰瘍的KEGG 富集通路氣泡圖

2.5 “中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將黃連、黃芩、大黃、與關(guān)鍵靶點有直接作用關(guān)系的有效成分、上文獲得的25 個關(guān)鍵靶點基因、Count 值排名前 20 的 KEGG 富集通路導入Cytoscape 3.7.1 軟件中制作“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。

圖7 “中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

圖7 所示的網(wǎng)絡(luò)中，圓形表示中藥，六邊形表示有效成分（A1、A2 為黃連和黃芩共有成分，B為大黃和黃芩共有成分），菱形表示交集靶點基因，V 形表示通路。該網(wǎng)絡(luò)可反映出瀉心湯通過“多成分、多靶點、多通路”的調(diào)控特點對胃潰瘍發(fā)揮治療作用。

3 結(jié)論與討論

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、“中藥-有效成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)圖得出，瀉心湯治療胃潰瘍的重要有效成分為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、蘆薈大黃素。槲皮素具有抗炎、抗氧化、抑制胃酸分泌等多重藥理學功能，還可以通過抑制機體IL-6、TNF-α、VEGF 等炎癥因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗炎作用［12］。胃潰瘍發(fā)生后胃粘膜表現(xiàn)出炎癥應(yīng)激反應(yīng)［13-15］，所以槲皮素可以通過其抗炎作用減輕胃粘膜的炎癥應(yīng)激反應(yīng)。槲皮素對胃酸的排泌也能產(chǎn)生良好的抑制作用［16-17］，所以槲皮素也能夠利用其抑酸的功能減少胃酸對潰瘍面的破壞從而促使消化道黏膜的修復。幽門螺桿菌感染是胃潰瘍發(fā)生的重要原因之一［18］，槲皮素還可以抑制幽門螺桿菌在機體中的生長［17,19-20］。漢黃芩素、黃芩素也具有較好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多重藥理學功能，能夠抑制機體TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2 等多種炎癥因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用［21-24］。漢黃芩素可以下調(diào)JAK1/2 的表達減少STAT3 的磷酸化進而加快胃癌細胞的凋亡［25］。有試驗研究結(jié)果表明黃芩素能夠上調(diào)胃癌MGC-803 細胞中caspase-3、PARP 水平，下調(diào)PARP 水平進而促進胃癌細胞的凋亡［26］。所以漢黃芩素、黃芩素能夠抑制機體炎癥因子的生成，降低胃粘膜炎癥反應(yīng)，從而對胃潰瘍產(chǎn)生治療效應(yīng)。此外，胃潰瘍?yōu)槲赴┣盃顟B(tài)，漢黃芩素、黃芩素又能促進胃癌細胞的凋亡，可以預防胃潰瘍進一步朝向胃癌發(fā)展，所以瀉心湯治療胃潰瘍能體現(xiàn)出中醫(yī)學“治未病”的理論思想。刺槐素使Fas 和FasL、Bax 和p53 的表達上調(diào)，Bcl-2和Bad 的表達下調(diào)，通過活化Fas 通路抑制了胃癌AGS 細胞的增殖并誘導其凋亡［27］。刺槐素還具有良好的鎮(zhèn)痛作用。有研究報道，在小鼠的扭體試驗中發(fā)現(xiàn)ED50的刺槐素鎮(zhèn)痛作用明顯強于ED50雙氯芬酸鈉［28］，所以瀉心湯治療胃潰瘍時除了有抗炎、抗腫瘤的效果外，還具有對癥止痛的作用。胃粘膜被胃酸、胃蛋白酶自身破壞是胃潰瘍發(fā)病的主要原因［29-31］，蘆薈大黃素可以抑制胃酸的分泌［32-33］，與胃蛋白酶結(jié)合形成復合物后改變其構(gòu)象［34-35］，減少胃酸、胃蛋白酶對胃粘膜的侵蝕。

由蛋白相互作用（PPI）結(jié)果、瀉心湯治療胃潰瘍關(guān)鍵靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)可知，瀉心湯治療胃潰瘍核心靶點為AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA。AKT1 是AKT 家族中的一個亞型，是參與機體炎癥反應(yīng)的靶點基因［36-37］。AKT1 可以通過促進CD4+T細胞向Th17 細胞的轉(zhuǎn)化，進而調(diào)控促炎癥因子IL-17 的表達［38］。有試驗研究報道，AKT1 表達上調(diào)后可以促進巨噬細胞向M2 型極化，減輕機體組織的炎癥反應(yīng)［39］，所以可以通過瀉心湯來調(diào)控AKT1 降低促炎癥因子的產(chǎn)生，減輕胃粘膜的炎癥應(yīng)激反應(yīng)，達到治療胃潰瘍的目的。正常的TP53可以促進機體胃粘膜及組織的修復，但突變后基因異常表達，其原有的抑癌功能缺失，誘導胃粘膜細胞凋亡，增加胃潰瘍向胃癌發(fā)展的風險［40］。有相關(guān)文獻報道，胃潰瘍模型大鼠TP53 有明顯的升高，胃粘膜的損傷程度與TP53 突變型基因的表達呈正相關(guān)［41］。瀉心湯可能是通過下調(diào)TP53 突變型基因的表達，減輕胃粘膜的損傷，促進胃粘膜的修復而對胃潰瘍起到治療作用。IL6、TNF 均為炎癥因子編碼基因。有相關(guān)研究報道，胃潰瘍患者相較于健康人，血清中TNF-α、IL-6 水平明顯偏高［42-43］。TNF-α 可促進急性蛋白的生成，活化中性粒細胞，炎癥組織內(nèi)血小板凝聚，血氧降低，對胃粘膜造成持續(xù)性傷害［44］。因此可以推測，使用瀉心湯可以下調(diào)IL6、TNF 基因的表達，減少炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥對胃粘膜組織的損傷。VEGFA 是血管內(nèi)皮生長因子A 的編碼基因，表達上調(diào)后可以活化血管內(nèi)皮細胞，誘導新的血管形成［45］，還可以抑制TNF、IL6 的生成，從而降低機體炎癥反應(yīng)［46］。

通過GO 功能富集分析可知，生物過程富集程度較高的是對無機物的應(yīng)答、細胞凋亡的正調(diào)控、對激素的應(yīng)答、細胞增殖的負調(diào)控、細胞粘附的調(diào)控；細胞組成富集程度較高的是膜筏、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合物；分子功能富集程度較高的是激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體化活性。通過KEGG 通路富集分析得出，富集程度較高的通路為癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路。PI3K-Akt 信號通路激活后可以調(diào)控胃粘膜上皮細胞的生長、增殖［47］。有研究證實MAPK 信號通路與胃潰瘍的發(fā)生密切相關(guān)，該通路的EGFR/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路中的任何一個分子表達異常都將會導致胃潰瘍的發(fā)生［48］。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究方法，對瀉心湯的多成分、多靶點與胃潰瘍之間的網(wǎng)狀關(guān)系進行了研究，認為瀉心湯通過槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、蘆薈大黃素等有效成分調(diào)控AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA 等核心靶點，以及癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等主要通路，發(fā)揮抗炎、抑酸、抗幽門螺桿菌、保護胃粘膜、防癌抑癌等作用，對胃潰瘍起到治療目的。

4 結(jié)語

網(wǎng)絡(luò)藥理學屬于生物信息學的分支，可以利用公共數(shù)據(jù)庫平臺、計算機軟件和數(shù)據(jù)分析技術(shù)尋找醫(yī)學生物信息，構(gòu)建并分析藥物與疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。本文以經(jīng)典名方——瀉心湯與疾病胃潰瘍作為研究對象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件篩選并分析瀉心湯治療胃潰瘍所涉及的有效成分、靶點、通路，通過GO 功能富集分析，構(gòu)建“有效成分-交集靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，將它們之間的相互作用關(guān)系進行可視化，找出瀉心湯治療胃潰瘍的核心成分、核心靶點、主要通路，為進一步研究瀉心湯治療胃潰瘍作用機制提供了參考。