于淼，黃海林，張遠(yuǎn)起

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血管甲狀腺乳腺外科，廣東 湛江 524000

0 引言

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)乳腺癌女性大約226萬(wàn)例，占全部新發(fā)癌癥病例的11.7%，超過(guò)肺癌成為全球最常見的惡性腫瘤。乳腺癌已經(jīng)成為女性惡性腫瘤的主要死亡原因，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康[1]。新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）在局部晚期不能手術(shù)的乳腺癌中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。新輔助化療不僅可以使局部晚期和無(wú)法手術(shù)的乳腺腫瘤轉(zhuǎn)化為可手術(shù)的腫瘤，也可讓部分腫瘤降低分期，進(jìn)而可以行保乳手術(shù)[2]。既往的研究表明，獲得病理完全緩解（pCR）的患者新輔助化療后的總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）顯著延長(zhǎng)[3]。因此對(duì)于新輔助化療的療效及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估對(duì)于乳腺癌的治療顯得至關(guān)重要。而通過(guò)免疫組化（IHC）檢測(cè)出的Ki-67作為乳腺癌細(xì)胞增殖指標(biāo)一直被認(rèn)為是預(yù)后指標(biāo)，Ki-67即抗原Ki-67，是一種10號(hào)染色體上mKi-67基因編碼蛋白，在細(xì)胞分裂活躍期內(nèi)含量顯著增加[4]，在乳腺癌的治療及預(yù)后的評(píng)估中有著不可忽視的作用。目前已有不少人研究Ki-67在乳腺癌新輔助化療中的應(yīng)用，Ki-67也存在著分析有效性的質(zhì)疑，但其對(duì)乳腺癌治療的決策有著重要的價(jià)值，一直是近幾年的研究熱點(diǎn)。本文擬對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 Ki-67基本情況

Ki-67蛋白最初由359kDa的單克隆抗體Ki-67定義，該抗體是于1991年由Gerdes[5]首次從霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株l248的細(xì)胞核免疫小鼠獲得的。Ki-67這個(gè)名字最初是根據(jù)它的起源城市(基爾)和96個(gè)井板上的原始克隆數(shù)(即第67個(gè)克隆)來(lái)定義的。Ki-67是一種核DNA結(jié)合蛋白，在所有脊椎動(dòng)物中都有表達(dá)，是一種廣泛使用的增殖標(biāo)記物，廣泛用于腫瘤分級(jí)[6]。既往研究報(bào)告顯示，Ki-67存在于細(xì)胞周期的G1、S和G2期，而不是在靜止或靜止的細(xì)胞g0期，這提示其在許多癌癥中作為細(xì)胞增殖標(biāo)志物的作用[7]。通過(guò)免疫組化(IHC)分析，確定Ki-67標(biāo)記指數(shù)和陽(yáng)性頻率百分率，可提示患者的預(yù)后。Ki-67指數(shù)高，一般表現(xiàn)為臨床條件預(yù)后差[8]。

1.1 Ki-67生物結(jié)構(gòu)

Ki-67是一種非組蛋白核和核仁蛋白，由mKi-67基因編碼，定位于人類染色體10q26.2，總外顯子數(shù)16。Ki-67基因由兩種不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體組成，它們是由mRNA前體的選擇性剪接產(chǎn)生的，根據(jù)有無(wú)7外顯子,分子量分別為320kDa和359kDa[9-11]。對(duì)其進(jìn)行分子克隆，得到16個(gè)Ki重復(fù)序列，長(zhǎng)度為122個(gè)氨基酸，由一個(gè)6842bp的外顯子編碼。每個(gè)重復(fù)序列由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸等高度保守的氨基酸殘基組成，這些氨基酸殘基可能具有功能性。每個(gè)重復(fù)序列都含有由66bp元素編碼的高度保守的基序，以及大量的PEST位點(diǎn)，這些位點(diǎn)富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，對(duì)蛋白酶活性敏感。Ki-67基序是Ki-67抗體(如MIB-1)識(shí)別的表位，通常用于處理人體組織。由于這種性質(zhì)，抑制劑研究證實(shí)Ki-67的生物半衰期小于1h[9,12]。

1.2 Ki-67的功能及表達(dá)調(diào)控

在G1期Ki-67主要集中的核周區(qū)域。在間期，Ki-67主要集中于核仁的致密纖維成分[13-15]。在有絲分裂過(guò)程中，核分解呈彌漫性染色，這表明它與染色質(zhì)有關(guān)。當(dāng)發(fā)生染色體凝聚時(shí)，Ki-67與其他核仁蛋白如核磷蛋白（B23）、核仁素和核周圍蛋白一起出現(xiàn)在染色體周圍層。染色體周圍層在染色體周圍起保護(hù)層或膜的作用，在核仁集合時(shí)起平臺(tái)作用[16-17]。Ki-67的一個(gè)顯著特征是將粒狀核仁成分定位于有絲分裂的染色體上，因此在子細(xì)胞之間的核仁分離中發(fā)揮重要作用[18]。研究人員認(rèn)為，Ki-67作為一種表面活性劑，可以使染色體運(yùn)動(dòng)，并與有絲分裂紡錘體相互作用，從而防止核膜解體后染色體坍縮成染色質(zhì)團(tuán)塊[19]。研究表明Ki-67在rRNA轉(zhuǎn)錄中有作用，這些核糖體發(fā)生過(guò)程中的特征可能解釋了細(xì)胞增殖與Ki-67表達(dá)之間的聯(lián)系[20]。最近的報(bào)道表明Ki-67與細(xì)胞增殖沒(méi)有直接關(guān)系，但它可能通過(guò)組蛋白甲基化復(fù)合物參與異染色質(zhì)的壓實(shí)和組織，這可能是維持異染色質(zhì)所必需的。

在細(xì)胞周期中，首先是通過(guò)比較人腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜來(lái)確定其增殖特征的[21]。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，Ki-67水平從G1期晚期至S期升高，在有絲分裂時(shí)達(dá)到峰值，在有絲分裂結(jié)束時(shí)急劇下降[22-23]。正常情況下，CDK4/6與細(xì)胞周期蛋白D形成復(fù)合物，并在G1期啟動(dòng)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）家族的磷酸化，并以低磷酸化形式存在。進(jìn)而釋放與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（E2F）相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程所需的E2F應(yīng)答基因的表達(dá)。在G1期晚期，Rb的磷酸化，進(jìn)一步激活E2F介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。然后通過(guò)G1/S期邊界的限制點(diǎn)，開始S期[24]。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期S期時(shí)，Rb高度磷酸化并在整個(gè)細(xì)胞周期中保持這種狀態(tài)。磷酸化Rb通過(guò)與E2F形成復(fù)合物，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[25]。由于許多癌癥中Rb表達(dá)缺失，且Ki-67蛋白可與E2F蛋白結(jié)合。E2F過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Ki-67mRNA積累，導(dǎo)致Ki-67可能低表達(dá)或高表達(dá)。Ki-67表達(dá)的高低可作為陽(yáng)性評(píng)分，以確定Ki-67標(biāo)記指數(shù)，是因?yàn)樵贕0期或靜止細(xì)胞中只能檢測(cè)到極低水平的Ki-67水平，而在衰老細(xì)胞中，不存在Ki-67[26]。Ki-67水平的調(diào)節(jié)機(jī)制也可能是由腫瘤抑制因子p53控制的。HeLa細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示p53以劑量依賴的方式抑制Ki-67表達(dá)[6]，P53可通過(guò)與Ki-67啟動(dòng)子中P53結(jié)合基序和Sp1結(jié)合位點(diǎn)的相互作用介導(dǎo)Ki-67的轉(zhuǎn)錄抑制。

2 Ki-67在乳腺癌中的應(yīng)用

通過(guò)IHC檢測(cè)出的Ki-67作為乳腺癌細(xì)胞增殖指標(biāo)一直被認(rèn)為是預(yù)后指標(biāo)，在乳腺癌的治療及預(yù)后的評(píng)估中有著不可忽視的作用。既往研究表明，高增殖與低增殖的癌癥預(yù)后較差，分析有效性、臨界值的截取等問(wèn)題阻礙了這些措施的廣泛采用[27-29]。

2.1 Ki-67的分析有效性

Ki-67不能作為一種診斷分析方法實(shí)施的關(guān)鍵因素是因缺乏分析有效性。對(duì)于包括Ki-67在內(nèi)的任何腫瘤生物標(biāo)志物檢測(cè)，都有許多因素可能會(huì)影響結(jié)果，包括標(biāo)本的收集處理與分析報(bào)告，以及最終確保分析評(píng)估的準(zhǔn)確性。有研究為解決實(shí)驗(yàn)室之間缺乏一致性，對(duì)Ki-67進(jìn)行了可重復(fù)性研究。他們讓8個(gè)實(shí)驗(yàn)室收集100例乳腺癌病例，采用1mm核心組織芯片，均采用抗體MIB-1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室單獨(dú)對(duì)Ki-67腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色百分比評(píng)分。用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）對(duì)重復(fù)性進(jìn)行量化，結(jié)果顯示Ki-67評(píng)分內(nèi)部一致，ICC為0.94，但實(shí)驗(yàn)室間差異ICC為0.59，其結(jié)果差異較大，該研究認(rèn)為影響實(shí)驗(yàn)室間差異的因素包括腫瘤區(qū)域的選擇、計(jì)數(shù)方法和染色陽(yáng)性的主觀評(píng)價(jià)[30]。于是他們又引入了在線校準(zhǔn)練習(xí)和標(biāo)準(zhǔn)化核計(jì)數(shù)方法以提高可重復(fù)性。觀察者之間的差異ICC為0.92，符合預(yù)先設(shè)定的成功標(biāo)準(zhǔn)[31]。以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了Ki-67的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)分是可行的，但是受主觀評(píng)價(jià)的影響，其結(jié)果在臨床中仍有差異，故在傳統(tǒng)視覺分析的方法外，出現(xiàn)了自動(dòng)數(shù)字圖像評(píng)分系統(tǒng)（DIA）。有研究將相同的30個(gè)乳腺腫瘤的預(yù)染切片送到14個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行掃描和自動(dòng)評(píng)估Ki-67指數(shù)。通過(guò)10個(gè)自動(dòng)評(píng)估軟件得出，自動(dòng)數(shù)字圖像評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估的平均Ki-67與嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化病理學(xué)家視覺評(píng)估所得Ki-67結(jié)果具有較高的一致性[32]。為了證實(shí)DIA是一個(gè)可行的方案，有研究用三種圖像分析測(cè)試Ki-67的可重復(fù)性，通過(guò)對(duì)140例乳腺癌患者的研究，其ICC為0.93表明其具有良好的可重復(fù)性，并且在三個(gè)平臺(tái)之間其可重復(fù)性也具有較高一致性[33]。也有研究人員使用自行開發(fā)的DIA與標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)家評(píng)估進(jìn)行對(duì)比，最后結(jié)果依舊是DIA與視覺評(píng)估具有良好的相關(guān)性[34]。這些研究證明了DIA是一種便捷、準(zhǔn)確性高的測(cè)量方法，是未來(lái)評(píng)估Ki-67的趨勢(shì)。

2.2 Ki-67的臨界值

Ki-67在乳腺癌中的臨界值一直具有較大的爭(zhēng)議。乳腺癌常見的分子亞型有l(wèi)uminalA型、luminalB型、HER-2過(guò)表達(dá)型和三陰性乳腺癌。Ki-67標(biāo)記物能夠區(qū)分乳腺癌的兩種分子亞型：luminalA和luminalB腫瘤。Cheang等[35]首先證明了Ki-67在13.25%為臨界值時(shí)區(qū)分luminalA和luminalB時(shí)具有72%的敏感性和77%的特異性，能較準(zhǔn)確地區(qū)分兩種亞型。2011年St.Gallen建議將區(qū)別luminalA型與B型的臨界值定為14%，又在2013年，該截止值被修訂為20%，并建議可選擇使用基于各自實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的臨界值[36]。因目前并未有明確的臨界值，故許多研究也在持續(xù)尋找最佳臨界值。Thangarajah等人定義Ki-67＜10%為低表達(dá)，10%～20%定義為中表達(dá)，Ki-67＞30%為高表達(dá)，通過(guò)對(duì)802個(gè)患者進(jìn)行分析得出，在DFS的log-rank分析中，Ki-67指數(shù)低和中患者的DFS優(yōu)于Ki-67指數(shù)高的患者[37]。有研究包括1951例原發(fā)性乳腺癌患者，根據(jù)染色百分比，將Ki-67指數(shù)進(jìn)一步分為＜14%、15%～24%、25%～44%、＞45%四組，其結(jié)果是Ki-67的沒(méi)有獨(dú)立預(yù)后意義[38-39]。Kany?lmaz[39]等根據(jù)Ki-67水平建立了三個(gè)類別：低(＜10%)、中級(jí)(10%～25%)和高(＞25%)，結(jié)果顯示Ki-67水平和腫瘤分級(jí)之間存在顯著相關(guān)性。低級(jí)別腫瘤Ki-67低表達(dá)相關(guān)，高級(jí)別腫瘤Ki-67高表達(dá)相關(guān)，并且Ki-67對(duì)預(yù)后的影響僅在DFS中得到證實(shí)，可能需要更長(zhǎng)的隨訪時(shí)間來(lái)觀察其對(duì)OS的影響。Kamranzadeh[40]等的研究證實(shí)了Ki-67與乳腺癌分期有關(guān)，提示Ki-67在侵襲性較強(qiáng)的腫瘤中水平較高，但同樣證實(shí)了Ki-67不能作為侵襲性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，且Ki-67與激素受體、HER2等一些預(yù)后因素之間沒(méi)有顯著的關(guān)系，Ki-67與3年、5年DFS、5年OS無(wú)顯著差異。Aman[41]等按照2011年St.Gallen建議將Ki-67分為≤15%組，16%～30%組，＞30%組，該研究發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)。腫瘤分級(jí)越高，Ki-67越高，他們認(rèn)為免疫組化檢測(cè)Ki-67與ER、PR和HER2結(jié)合，給出乳腺癌分子亞型，其預(yù)后和治療具有重要意義。尤其對(duì)于年輕女性三陰性乳腺癌（TNBC）患者Ki-67的高價(jià)值，需要進(jìn)行徹底的研究。邵志敏團(tuán)隊(duì)[42]對(duì)TNBC中Ki-67的最佳臨界值有進(jìn)一步的研究，通過(guò)對(duì)1800例早期侵襲性TNBC患者的分析，得出Ki-67與預(yù)后最相關(guān)的臨界值值為30%，此時(shí)OS和DFS具有早期獨(dú)立預(yù)后和預(yù)測(cè)潛力，Ki-67＞30%與預(yù)后較差顯著相關(guān)。以上諸多研究中Ki-67臨界值在10%～45%之間，可見對(duì)于最佳臨界值仍有較大的爭(zhēng)議，雖然存在爭(zhēng)議但是其對(duì)乳腺癌的治療及預(yù)后依舊有著重要的指導(dǎo)意義。

3 Ki-67在乳腺癌新輔助化療中的作用

新輔助化療（NAC）是目前局部晚期乳腺癌（LABC）和早期乳腺癌（EBC）的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。NAC的主要目的是將不能切除的腫瘤轉(zhuǎn)化為可手術(shù)的腫瘤，以及將腫瘤的分期降低，以行保乳手術(shù)而不是乳房切除術(shù)。在新輔助化療中Ki-67指數(shù)在治療前后，對(duì)乳腺癌的療效評(píng)估以及預(yù)后都具有一定的指導(dǎo)作用，但仍不能在臨床工作中起決定性作用。

3.1 新輔助化療前Ki-67指數(shù)

已有許多研究表明，在新輔助化療前Ki-67指數(shù)就已經(jīng)提示了乳腺癌化療的療效及預(yù)后的結(jié)果。Jain P[43]等為確定乳腺癌患者Ki-67水平與乳腺癌pCR相關(guān)性，單因素分析表明，較高的Ki-67指數(shù)＞35%與較好的pCR率相關(guān)。多因素分析顯示，Ki-67指數(shù)＞35%是pCR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。該研究表明Ki-67高與pCR呈正相關(guān)。Wajid[44]等通過(guò)對(duì)80例乳腺癌患者進(jìn)行分析，同樣采用35%作為Ki-67的臨界值，Ki-67高表達(dá)患者中，其中63%出現(xiàn)pCR，26%出現(xiàn)部分病理緩解，11%出現(xiàn)疾病進(jìn)展。相反，Ki-67低表達(dá)患者中，17%出現(xiàn)pCR，58%出現(xiàn)部分病理緩解，25%出現(xiàn)病情進(jìn)展。該研究也證實(shí)了Ki-67高與pCR呈正相關(guān)。既往研究中，Gluz O[45]等在新輔助治療試驗(yàn)中，早期乳腺癌易獲得pCR，較高的Ki-67表達(dá)與化療敏感性相關(guān)。也有研究表示Ki-67＞20%的腫瘤患者，證實(shí)NAC治療效果更好[46]。通過(guò)以上研究我們大致可以得出較高的Ki-67相比于較低的患者更易獲得pCR且對(duì)NAC有更高的敏感性。

3.2 新輔助化療后Ki-67指數(shù)

在新輔助治療結(jié)束時(shí)，仍會(huì)有部分病人不能達(dá)到pCR，在殘留腫瘤中的Ki-67與長(zhǎng)期預(yù)后有很強(qiáng)的相關(guān)性。Minckwitz[47]等為研究Ki-67在新輔助化療后殘留病變中的價(jià)值，在GeparTrio研究的參與者隨機(jī)接受新輔助化療后用IHC測(cè)定Ki-67水平。治療后Ki-67水平較高的患者復(fù)發(fā)率和死亡率高于中低水平的患者。Ki-67水平低的患者與pCR組結(jié)果相似。治療后Ki-67水平比治療前Ki-67水平或治療前后Ki-67水平的變化提供了更多的預(yù)后信息。該研究認(rèn)為較高的Ki-67會(huì)到來(lái)較差的預(yù)后，建議可更改后續(xù)的治療方案。Luigi Rossi[48]等發(fā)現(xiàn)NAC可以改變?nèi)橄傧侔┗颊逰i-67的表達(dá)狀態(tài)，中位Ki-67值在化療前活檢為20.9%，在化療后為18%，在病理反應(yīng)患者化療后，Ki-67表達(dá)水平顯著降低。該研究認(rèn)為即使部分患者沒(méi)有獲得pCR，在NAC后Ki-67降低的患者最有可能受益。Pistelli[49]等將Ki-67變化在未達(dá)到pCR的患者，根據(jù)Ki-67分為高降低(＞20%)、低降低組(1%～20%)和無(wú)變化組。Ki-67的變化與DFS和OS有顯著的相關(guān)性。與Ki-67降低與不降低患者相比，Ki-67降低程度高(＞20%)患者的生存率較高。在該研究中，Ki-67在未達(dá)到pCR患者的改變顯示了在接受NAC治療中顯著的預(yù)后作用。Ding[50]等研究表明NAC治療后Ki-67表達(dá)增加的患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比Ki-67表達(dá)穩(wěn)定的患者高2.05倍。Ki-67表達(dá)增加20%的患者與Ki-67表達(dá)穩(wěn)定或下降的患者相比，DFS更差。Ki-67表達(dá)穩(wěn)定組與Ki-67表達(dá)降低組預(yù)后相同。Ki-67表達(dá)增加20%與DFS顯著惡化相關(guān)。Ki-67表達(dá)升高的患者的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)比Ki-67表達(dá)穩(wěn)定的患者高1.91倍。Ki-67表達(dá)低的患者與病理完全緩解的患者預(yù)后相似。NAC后Ki-67高表達(dá)的患者DFS和OS較短。導(dǎo)致NAC后Ki-67表達(dá)的增加的原因可能是化療主要?dú)⑺乐鲃?dòng)增殖的腫瘤細(xì)胞，間接促進(jìn)G0期殘留腫瘤細(xì)胞主動(dòng)代謝或再次進(jìn)入分裂周期。在這種情況下，Ki-67可以在腫瘤細(xì)胞中重新表達(dá)。另一方面，Ki-67高表達(dá)可能也與化療耐藥相關(guān)。以上研究表明新輔助化療前，及化療前后Ki-67對(duì)于乳腺癌患者獲得pCR以及未獲得pCR患者的預(yù)后進(jìn)行了評(píng)估，我們可根據(jù)其指導(dǎo)意義對(duì)部分患者的治療方案予以及時(shí)調(diào)整，以便達(dá)到最佳治療效果。

綜上所述，Ki-67是與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，是一種重要的腫瘤標(biāo)志物，可根據(jù)其在乳腺癌新輔助化療前后變化來(lái)評(píng)估療效及預(yù)后。Ki-67臨界值一直存在爭(zhēng)議，傳統(tǒng)人工Ki-67視覺評(píng)分雖然可有較高可重復(fù)性，但仍存在主觀差異，不同實(shí)驗(yàn)室之間Ki-67指數(shù)對(duì)比性差異較大，而自動(dòng)數(shù)字圖像評(píng)分系統(tǒng)（DIA）的出現(xiàn)有利于解決Ki-67的分析有效性問(wèn)題，隨著更多研究的跟進(jìn)，該系統(tǒng)在未來(lái)可能值得廣泛推廣，從而提高Ki-67分析有效性。多項(xiàng)研究表明高Ki-67預(yù)示著其對(duì)新輔助化療敏感，可能取得較好的療效，同時(shí)對(duì)新輔助化療后pCR有預(yù)測(cè)作用，新輔助化療前的Ki-67值以及Ki-67值的變化也可能是乳腺癌患者OS和DFS的預(yù)后因素。這些研究可為提高乳腺癌病理完全緩解及疾病的預(yù)后提供參考，并為調(diào)整治療策略給出依據(jù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)乳腺癌的精準(zhǔn)治療。