劉瑩/天津市動物疫病預防控制中心 300402
隱孢子蟲(Cryptosporidium sp)是Tyzzer 于上世紀初(1907 年)在實驗小鼠的胃腸道內首先發(fā)現(xiàn)的能引起人和多種動物腹瀉的寄生原蟲。隱孢子蟲病是隱孢子蟲感染引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染病。隱孢子蟲病潛伏期長,一年四季均可發(fā)生,無有效阻斷措施和治療措施,一旦感染往往難以治愈,只有淘汰根除。該病主要感染初生犢牛、哺乳犢牛和斷奶犢牛,部分泌乳牛也可感染。該病在天津地區(qū)關注度較低,因此,規(guī)模牛場全面的檢測的報道不多。經(jīng)調研初步了解,本地區(qū)犢牛腹瀉比較普遍,漸進性消耗較大,嚴重影響后期奶牛的產(chǎn)奶量。嚴重的導致犢牛死亡,危害嚴重?;诖耍谔旖蚴幸?guī)?;鲩_展了該病流行率測量的橫斷面研究,為科學防控該病提供數(shù)據(jù)基礎。
1.1 目標群天津市內存欄量1000 頭以上的部分規(guī)模奶牛場。
1.2 抽樣策略
1.3 調查對象研究類型是基于問卷調查和電話回訪的橫斷面調查研究。選取天津市的4 個區(qū),每區(qū)選一個牛場進行橫斷面抽樣調查。
1.4 抽樣策略與樣本量的計算樣本量計算公式為n=pq/(d/Zα)2,q=1-p,設允許誤差d=0.1p,Zα 為顯著性檢驗的統(tǒng)計量,當顯著性水平α=0.05 時,Zα=1.96。根據(jù)文獻設定我市奶牛場隱孢子蟲感染率P 為28%,應采樣本量約1000 份。
式中:n 為樣本量;z 為置信區(qū)間相關的標準誤差;p 為總體的估計差異性;q 為100-p;e 為相對誤差。
1.5 病例定義隱孢子蟲病陽性個體:經(jīng)實驗室隱孢子蟲抗原ELISA 檢測結果為陽性的牛只。
1.6 檢測方法使用隱孢子蟲糞便抗原ELISA 方法進行檢測,該方法的敏感性(Se=95%)和特異性(Sp=96%)。出于經(jīng)費考慮,實際檢測過程中制作一份檢測樣品,結果代表樣本結果,樣品檢測沒有重復。
2.1 儀器設備微量可移動移液器及配套槍頭;恒溫培養(yǎng)箱;4℃冰箱;-20℃冰箱;計時器;記號筆;振蕩器;酶標儀(含波長450mm 的濾光片);去離子水或蒸餾水;洗板機。
2.2 試劑及樣品制備洗滌工作液使用前,濃縮的洗滌液進行室溫平衡(20℃~25℃),并混勻,(若有沉淀,最好在37℃很穩(wěn)培養(yǎng)箱中加熱5~10min,直至沉淀完全溶解),蒸餾水進行10 倍稀釋,混勻。稀釋液可4℃存放4 周。
企業(yè)應把培訓工作納入整體規(guī)劃中,企業(yè)領導者應在戰(zhàn)略上高度重視員工培訓,“把培訓工作當作一項長期的基礎工作來抓,并將培訓情況作為每個員工工作考核的重要內容”[3]。
樣品處理:在2mL EP 管中加入2g 糞便樣品,做好樣品標記。加入1mL 樣品稀釋液,對稀釋后的糞便樣品逐份進行震蕩混勻處理。靜置樣品,取上清液待檢測。
2.3 實驗步驟
(1)所有試劑在使用前進行室溫平衡,使用渦旋振蕩器對所有的試劑進行混勻;
(2)去除密封的抗原包背板,沿包裝袋缺口處死開;
(3)取出所需量的微孔板固定與板架上,其余板條放入密封袋內保存。)記錄樣品位置。按照要求加入陽性對照,100μL/孔,陰性對照,100μL/孔,稀釋好的樣品,100μL/孔。每孔加入,100μL/孔 1 號酶結合物。用移液槍緩慢混勻孔中液體;
(4)蓋上封板膜,室溫孵育30min;
(5)洗板:小心去掉封板摸。洗板機進行3 遍洗板;
(7)每孔加入100μL 底物溶液,封板摸封死,室溫避光孵育15min;
(8)終止液,50μL/孔,震蕩混勻,在酶標儀450nm 讀數(shù),記錄樣品及陰性、陽性對照的吸光光度。
2.4 結果判定陰性對照OD<0.2,陽性對照OD>0.2 時試驗成立。
表1 隱孢子蟲糞便樣品ELISA 檢測結果判定標準
2.5 問卷調查設計針對養(yǎng)殖場/戶的結構性問卷,內容包括牛場的生產(chǎn)管理、地理信息、歷史疫情、傳播相關風險因素等。田間調查和問卷填寫由經(jīng)培訓的獸醫(yī)人員統(tǒng)一進行。
應用Excel 進行數(shù)據(jù)匯總,應用Spss 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
4.1 樣本量選取天津市試驗高水平較高的分布與不同區(qū)的四個規(guī)模牛場。四個場分別位于寶坻區(qū)、靜海區(qū)、寧河區(qū)、濱海新區(qū)。并于抽樣前2 周電話確定抽樣框共4 家。共采集1000 份樣品。由于經(jīng)費有限,處理并檢測樣品1000 份。
4.2 個體流行率隱孢子蟲是一種重要的人畜共患寄生性原蟲。隱孢子蟲感染各階段奶牛,是引起犢牛腹瀉的重要誘因。小牛臨床感染的特征是淡黃色腹瀉伴脫水、厭食和酸中毒。食欲減退、消瘦,易繼發(fā)細菌感染而死亡。
檢測樣本1000 份,陽性樣本123 份,個體表觀流行率12.3%。根據(jù)個體診斷實驗的敏感性(Se=95%) 和特異性(Sp=96%),計算個體真實流行率為9.1%(CL95%,7.3%~10.9%)。
圖1 真實流行率圖示
圖2 各場樣品隱孢子蟲檢測陽性率
表2 各場樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率
圖3 各場哺乳犢牛陽性率
表3 各場哺乳犢牛樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率
圖4 各場斷奶犢牛陽性率
表4 各場斷奶犢牛樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率
圖5 各場哺乳犢牛陽性率
表5 各場樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率
4.3 空間分布抽樣的4 個區(qū)的規(guī)?;瘓鋈繛殛栃詧鳇c。因經(jīng)費和抽樣點數(shù)不足,另有其他區(qū)縣未涉及。因此,本項目未涉及的區(qū)縣也無法排除陽性場點的存在。因此,本次初步調查無空間分布證據(jù)。
圖6 陽性場群的空間分布
被調查的四個規(guī)?;B(yǎng)殖場,經(jīng)檢測全部為隱孢子蟲陽性場。其中,A 場的陽性率最高,D 場的陽性率最低。
4.4 群間分布檢測結果可見,哺乳犢牛的陽性率為22.33%,陽性率最高。其次為泌乳牛9.66%,斷奶犢牛4.63%,青年牛和干奶牛的檢測陽性率為0 。
圖7 不同階段牛陽性率
表6 不同牛群樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率
本次規(guī)?;膛鲭[孢子蟲病初步調查,采取分層隨機抽樣的方法,抽取四個區(qū)的4 個規(guī)?;膛?,共采集、處理、檢測樣品1000 份。被檢測場均有奶牛隱孢子蟲陽性樣本。可以推測隱孢子蟲在我市規(guī)?;膛鲋幸呀?jīng)具有一定的污染面。推測牛群隱孢子蟲感染比較普遍,場群流行率比較高。
根據(jù)個體表觀流行率12.3%,診斷實驗的敏感性(Se=95%)和特異性(Sp=96%),規(guī)?;膛龅碾[孢子蟲的陽性率為9.1%(CL95%,7.3%~10.9%)。其中,哺乳犢牛的檢測陽性率最高22.33%,真實流行率為20.1%(CL95%,16.3%~23.9%)。
根據(jù)初步調查結果可見,隱孢子蟲在規(guī)?;龅母腥颈容^普遍,調查品種均為荷斯坦牛,各年齡段均可發(fā)病,其中以犢牛感染率相對較高,其次為斷乳牛。
結果提示A 場的哺乳犢牛陽性率遠高于其他三個規(guī)模場。根據(jù)問卷調查結果,發(fā)現(xiàn)A 場于采樣前2 個月引進一批待產(chǎn)奶牛,來源復雜。生產(chǎn)犢牛造成隱孢子蟲陽性率顯著高于其他規(guī)模場哺乳犢牛群體。因此,盲目引種混群是A 場犢牛腹瀉嚴重,且隱孢子蟲感染率高的主要原因。