趙兵令 汪令 王紅志 王露 李華聲 宋玉卓,3 馮金民 車曉菲*

1.河北維爾利動物藥業(yè)有限公司 050000

2.河北省中獸藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 050000

3 河北省功能性添加劑技術(shù)創(chuàng)新中心 050000

黃連是毛茛科植物黃連、云連或三角葉黃連的干燥根莖，三者分別稱為“川連或味連”“云連”“雅連”。主產(chǎn)地有四川、湖北、重慶、貴州、云南等地。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被譽為上品，其性寒、味苦，歸心、脾、胃、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用；現(xiàn)代藥理學(xué)表明，對抗菌和抗炎具有“中藥抗生素”的贊譽，并且黃連還有降血糖、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠及對心血管系統(tǒng)的影響。黃連主要有效成分為小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿和藥根堿等生物堿類物質(zhì)。黃連作為常用中藥，其不僅為人類臨床應(yīng)用及健康做出重要貢獻，而且也是畜禽疾病防治的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。比如“白頭翁口服液”“黃連解毒湯”以及“四黃止痢顆?！?，主要功能為清熱解毒，涼血止痢，研究表明其方劑用于治療家禽腸道感染性疾病有很好的效果。然而處方中君藥黃連起主要藥效作用且市場價格較貴。隨著國內(nèi)對黃連的需求量與日俱增，并且黃連對生長環(huán)境要求苛刻、生長年限長、單位面積產(chǎn)量低。在經(jīng)濟利益的誘惑下，黃連被大量過度采挖，導(dǎo)致其野生藥材資源銳減，越來越多的獸藥企業(yè)因節(jié)約成本不投、少投、投劣質(zhì)黃連或黃連須替代黃連，原材料的差異對產(chǎn)品的穩(wěn)定性、臨床效果存在很大隱患。隨著我國畜禽飼用產(chǎn)品限抗、減抗、禁抗政策的頒布實施，中藥替抗已成為目前畜牧行業(yè)的研究熱點，相關(guān)政策指出中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程中所產(chǎn)生的非藥用部位及副產(chǎn)物是開發(fā)替抗類飼用產(chǎn)品潛在的重要原料。目前黃連只以其根莖入藥，非藥用部位須根、莖和葉作為廢料遺棄，造成資源的嚴重浪費，然而關(guān)于黃連不同部位通過薄層色譜法定性鑒別以及高效液相色譜法定量檢測雙重控制質(zhì)量標準的報道鮮有顯示。本文對藥用部位黃連以及非藥用部位4 種主要生物堿活性成分的薄層鑒別、含量進行比較分析，由此為黃連相關(guān)的中藥制劑能否用非藥用部位替代提供參考和理論依據(jù)，并且為黃連非藥用部位合理利用和資源開發(fā)，以期為中藥資源產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效和綠色發(fā)展提供支撐，為飼用抗生素的有效替代提供途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特DK-98-11)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)KQ5200B)；電熱鼓風干燥箱(北京市永光明醫(yī)療器械101～3AS)；電子天平(島津菲律賓廠AUW120D)；硅膠G板，青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)；美國安捷倫Agilent1260-II 高效液相色譜儀。

1.2 試劑鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、巴馬汀、表小檗堿（中國食品藥品檢定研究院，批號110713-201814,110745-201978,110732-201913,110765-202035）；甲醇、乙腈、磷酸均為天津市康科德試劑有限公司產(chǎn)品，色譜純。環(huán)己烷、乙酸乙酯、異丙醇、三乙胺、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉均為科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理黃連3 批樣品均采集于湖北利川，取健康整株黃連分別將每株的根莖、須根、莖和葉進行分離，將上述處理好的材料分別置于55℃～60℃干燥烘箱內(nèi)烘干至恒重，粉碎二號篩，獲得不同部位黃連材料粉末，室溫密封保存待用。

1.3.2 薄層色譜鑒別按照中華人民共和國《獸藥典2020版》分別取黃連各部位粉末0.25g，加甲醇25mL，超聲處理30min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取黃連對照藥材0.25g，同法制成對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、巴馬汀、表小檗堿對照品，加甲醇分別制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (通則 0502)試驗，吸取上述6 種溶液各1μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3 ∶ 3.5 ∶1 ∶1.5 ∶O.5 ∶ 1）為展開劑，置用濃氨試液預(yù)飽和20min 的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈 (365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯4 個以上相同顏色的熒光斑點 ;對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

1.3.3 高效液相色譜檢測按照中華人民共和國《獸藥典2020 版》十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05moI/L 磷酸二氫鉀溶液 (50 :50)(每100mL 中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0)為流動相；檢測波長為345nm，流速1.0mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL。取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含90.5μg的溶液備用。取本品粉末 (過二號篩)約0.2，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100:1)的混合溶液50mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率50W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2mL，置10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得 。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析高效液相色譜檢測檢測結(jié)果用（Means±SE）表示，用SPSS19.0 軟件進行單因素方差分析，P ＜0.05 有意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連不同部位外觀、形狀本實驗樣品采于湖北利川，將健康整株黃連分為黃連葉、黃連莖、黃連跟、黃連須四個部分（如圖1），經(jīng)專業(yè)藥材鑒定師鑒定為毛茛科植物味連，并且其外觀和形狀與劉芳報道相一致。

圖1 黃連不同外觀、形狀

2.2 薄層色譜鑒別如圖2 所示，黃連不同部位四種生物堿均能顯示熒光斑點，而黃連葉表小檗堿熒光斑點較淺，且黃連根四種生物堿熒光斑點最明顯。通過比較黃連不同部位熒光斑點的大小，未呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。

圖2 黃連不同部位薄層鑒別

2.3 高效液相色譜含量測定如圖3 所示，通過高效液相色譜含量測定與黃連根相比，小檗堿含量分別是黃連葉的4.58 倍、黃連莖的4.82 倍、黃連須的4.01 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；巴馬汀含量分別是黃連葉的11.3 倍、黃連莖的13.17 倍、黃連須的9.25 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；黃連堿含量分別是黃連葉的16.77 倍、黃連莖的3.09 倍、黃連須的1.22 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；表小檗堿含量分別是黃連葉的60.57 倍、黃連莖的7.89 倍、黃連須的1.25 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；由此可見，黃連各生物堿含量明顯高于其他部位，并且黃連四種生物堿小檗堿含量最高。

圖3 黃連不同部位含量檢測

3 討論

中藥及其復(fù)方殘留低、不易產(chǎn)生耐藥性、質(zhì)量難于量化控制以及非藥用部位可飼用等特點，建立完善的質(zhì)量標準控制體系和評價體系，把控中藥制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性、藥材副產(chǎn)物的合理利用成為急需待解決的問題。生物堿類是黃連最主要的藥效成分，包括黃連堿、巴馬汀、小檗堿、表小檗堿等。本研究通過薄層色譜鑒別結(jié)果顯示黃連各部位生物堿熒光斑點清晰，且黃連各生物堿熒光斑點最大；結(jié)合高效液相色譜含量測定結(jié)果可知與黃連相比非藥用部位黃連葉、黃連莖、黃連須中4 種生物堿含量存在明顯變化，該結(jié)果與文獻報道的黃連不同部位總生物堿含量大小順序依次是根莖 ＞ 須根＞ 葉片結(jié)果相吻合。并且本研究結(jié)果顯示黃連的4 種生物堿含量最高與文獻報的黃連藥材生物堿含量順序為小檗堿＞黃連堿＞巴馬?。颈硇￠迚A＞非洲防己堿＞藥根堿結(jié)果相一致。此外相關(guān)研究表明在黃連生長過程中，其植株的生物堿隨著生長不斷向根莖轉(zhuǎn)移，該結(jié)論與本實驗結(jié)果存在一定出入，可能不同品種、季節(jié)對黃連生物堿的分布存在一定的影響。而中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含有的化學(xué)成分，黃連的廣泛應(yīng)用與其所含各種生物堿的藥理作用存在密切關(guān)系，并且黃連的藥理作用并不是某單一生物堿作用的結(jié)果，比如黃連中小檗堿抗炎作用較強，但是黃連水提液的最低抑菌能力要強于小檗堿，由此表明黃連中含有其他抗菌或?qū)咕袇f(xié)同作用的成分 。所以只有對其主要生物堿的含量進行全面控制，才能保證藥材的質(zhì)量。此外有資料顯示黃連其須根、莖、葉等可以作為黃連的代用品 。結(jié)合本實驗研究結(jié)果這為加強中獸藥在動物養(yǎng)殖中的實踐應(yīng)用，開發(fā)替抗類飼用產(chǎn)品，有效推動我國畜牧養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展提供很好的保障。

黃連非藥用部位各生物堿具有一定的綜合利用價值，能否完全或部分替代藥用部位臨床效果有待于進一步確定，同時也為黃連非藥用部位作為飼料添加劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。