于昌貴 葛兆寧/天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司 300380

支原體屬于自然界中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單且體積最小的原核生物，濾菌器難以對(duì)其傳播進(jìn)行有效阻攔，同時(shí)支原體自身針對(duì)多方面的抗生素均能夠體現(xiàn)出抗藥性，相關(guān)的細(xì)胞器中含有濃度較高的粘附蛋白，可通過對(duì)真核細(xì)胞進(jìn)行粘附，直接向細(xì)胞內(nèi)部穿入。獸用生物制品的原材料包括動(dòng)物組織、動(dòng)物血液、原蟲、微生物代謝產(chǎn)物以及微生物等多個(gè)方面，可針對(duì)動(dòng)物傳染病或其他相關(guān)疾病進(jìn)行預(yù)防、治療、診斷，屬于一類免疫制劑，其安全性能夠?qū)?dòng)物健康以及人類健康起到直接或是間接的影響作用，所以針對(duì)獸用生物制品的生產(chǎn)質(zhì)量予以充分重視，既有利于保障動(dòng)物健康，也有利于維持人類社會(huì)的穩(wěn)定和諧。當(dāng)前支原體在自然界中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)100 種左右，其均能夠在一定程度上導(dǎo)致動(dòng)物或是人類出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育停滯、呼吸道感染以及免疫系統(tǒng)損傷等多方面情況，所以當(dāng)前支原體已經(jīng)吸引了醫(yī)學(xué)界以及獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。由此可見，針對(duì)獸用生物制品中支原體的污染來源及檢測(cè)預(yù)防控制策略進(jìn)行分析具有重要意義。

1 獸用生物制品中支原體的污染來源

1.1 血清及胰酶血清屬于疫苗生產(chǎn)過程中的主要原材料之一，被支原體污染的可能性較大，而且難以通過除菌過濾膜將其有效去除。胰酶則屬于疫苗生產(chǎn)過程中進(jìn)行細(xì)胞傳代以及消化時(shí)必須應(yīng)用的重要物料，主要來自于牛、豬、羊等牲畜的胰腺，易出現(xiàn)支原體污染情況。

1.2 細(xì)胞及種毒在疫苗生產(chǎn)過程中，種毒能夠起到十分重要的影響作用，甚至能夠決定疫苗的屬性特點(diǎn)以及內(nèi)在質(zhì)量，如果種毒受到支原體污染，則能夠出現(xiàn)逐級(jí)培養(yǎng)放大的情況，也就必然導(dǎo)致疫苗質(zhì)量受到影響。并且，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，支原體污染同樣能夠產(chǎn)生較大的影響，一般來說，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)污染情況的支原體主要來自牛、豬和人類，同時(shí)也包括梨支原體、豬鼻支原體、發(fā)酵支原體、口腔支原體、唾液支原體、精氨酸支原體等多種支原體，且其中部分來自于相關(guān)工作人員。

1.3 原代細(xì)胞及動(dòng)物組織對(duì)豬瘟活疫苗進(jìn)行生產(chǎn)的過程中，主要需要應(yīng)用羊睪丸或是牛睪丸的原代細(xì)胞作為其中所需的原材料，但是牛、羊其自身即為易感支原體的動(dòng)物，同時(shí)毛發(fā)較多，若出現(xiàn)消毒不全面、不徹底的情況，發(fā)生支原體污染現(xiàn)象的可能性將更大，所以應(yīng)用動(dòng)物組織作為獸用生物制品的原材料，極有可能出現(xiàn)支原體感染的情況，也就能夠?qū)臃N動(dòng)物造成嚴(yán)重威脅。

1.4 環(huán)境污染支原體能夠在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞傳代，并且傳播速度相對(duì)較快。與此同時(shí)，活支原體能夠在其中存活至少4～6d，還能夠成功實(shí)現(xiàn)復(fù)壯，且受到支原體污染的細(xì)胞傳播結(jié)束之后，還能向干凈細(xì)胞進(jìn)行傳遞，且直至6 周以后，仍能夠在其中檢測(cè)出陽性，可見支原體不僅傳播速度較快，且傳播難度較低。

2 支原體檢測(cè)方法

2.1 PCR 法PCR 法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、重復(fù)性良好、產(chǎn)率高、易自動(dòng)化等多方面優(yōu)勢(shì)，但與此同時(shí)，其中假陰性、假陽性出現(xiàn)的可能性也相對(duì)更大，對(duì)相關(guān)工作人員提出了更多更高的要求。其主要可以針對(duì)巴氏桿菌、沙門氏桿菌、豬鏈球菌、大腸桿菌、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、二型豬瘟病毒、新城疫病毒等多項(xiàng)病原的擴(kuò)散情況進(jìn)行有效檢測(cè)，可見該方法在獸用生物制品的生產(chǎn)質(zhì)量控制工作中能夠體現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)，其在相關(guān)的疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)工作中應(yīng)用效果也較為良好。

2.2 一步法試劑盒檢測(cè)法一步法試劑盒中所應(yīng)用的原理在于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，僅需1μL 的加樣量，即能夠借助變色情況對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。從整體上來看，該檢測(cè)方法周期較短，檢測(cè)結(jié)果可用肉眼直接觀察，并且具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確率。

2.3 ELISA 法根據(jù)“ELISA 抗體夾心法”原理，某公司研制并推廣了支原體檢測(cè)試劑盒。該試劑盒可以有效避免出現(xiàn)假陰性和假陽性的情況，不僅操作過程便捷，且省時(shí)省力，同時(shí)結(jié)果準(zhǔn)確性較高，并能夠體現(xiàn)出高通量、高靈敏度和價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)。首先在樣品上標(biāo)注地高新標(biāo)簽和生物素標(biāo)簽，再針對(duì)孔板使用預(yù)先包被對(duì)鏈親和素進(jìn)行獲取，之后加入抗地高新檢測(cè)抗體，且需注意，在將該抗體加入之前，需首先進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記，最后將底物顯色加入其中，采用比色法獲取檢驗(yàn)結(jié)果，以判定其中是否存在支原體。

2.4 分離培養(yǎng)法在固體培養(yǎng)基或是液體培養(yǎng)基之中，均可應(yīng)用分離培養(yǎng)法開展分離培養(yǎng)工作，在固體培養(yǎng)基之中，多數(shù)支原體能夠呈現(xiàn)出典型的菌落，在液體培養(yǎng)基之中，支原體則能夠呈現(xiàn)出pH 值得顯著變化，由此可見，分離培養(yǎng)法的應(yīng)用效果良好，但同時(shí)該方法敏感性不足、培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，同時(shí)受到抗生素自身影響的可能性較大，且不能將其中存在的全部支原體有效檢出。當(dāng)前《中國(guó)獸藥典》相關(guān)內(nèi)容仍指定分離培養(yǎng)法作為開展支原體檢測(cè)工作的基本方法，但是在實(shí)際上，我國(guó)獸用生物制品企業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展，均需有更加先進(jìn)、更加有效的快速檢驗(yàn)方法支持工作，所以針對(duì)分離培養(yǎng)法，需要進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化完善，或是與其他方法進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，以促使其中的支原體檢出率得到有效提升。

3 預(yù)防支原體污染方法

3.1 環(huán)境控制針對(duì)生產(chǎn)車間，應(yīng)保持其中的衛(wèi)生環(huán)境良好，定期開展清潔工作和消毒工作，并需要定期檢測(cè)其中的衛(wèi)生情況，以保障其中各項(xiàng)參數(shù)均處于標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，且持續(xù)可控。在進(jìn)行生產(chǎn)的過程中，需要針對(duì)流程之中的各項(xiàng)工作環(huán)節(jié)進(jìn)行持續(xù)細(xì)化，嚴(yán)格控制工作人員、物品、以及污物出入的路徑，以盡可能降低交叉感染情況出現(xiàn)的機(jī)率。生產(chǎn)工作結(jié)束后，應(yīng)徹底消毒生產(chǎn)設(shè)備，并根據(jù)各項(xiàng)設(shè)備及器械的實(shí)際特點(diǎn)，采用消毒水浸泡的方式或是高壓滅菌的方式對(duì)其進(jìn)行消毒處理，且車間內(nèi)清潔區(qū)的全部物品，均應(yīng)使用紫外線照射或是表面消毒的方式進(jìn)行處理。

3.2 原材料控制血清、胰酶、細(xì)胞一類的動(dòng)物源性原材料在獸用生物制品之中，均屬于占據(jù)重要地位的生產(chǎn)材料，同時(shí)也是支原體生存的重要基礎(chǔ)。根據(jù)相關(guān)研究顯示，當(dāng)前血清或細(xì)胞的原材料，能夠?qū)е轮辽?0 種支原體發(fā)生污染，所以不僅需要保障無菌狀態(tài)，還應(yīng)該在開展應(yīng)用之前，強(qiáng)化相關(guān)的支原體檢驗(yàn)工作，以盡可能避免出現(xiàn)支原體污染擴(kuò)散的情況。與此同時(shí)，在開展細(xì)胞培養(yǎng)工作的過程中，相關(guān)人員還應(yīng)注意保持個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣良好，同時(shí)完全遵循操作規(guī)范，以降低支原體污染情況出現(xiàn)的幾率，之后還應(yīng)以相關(guān)制度為基礎(chǔ)，對(duì)檢驗(yàn)體系進(jìn)行持續(xù)完善，嚴(yán)格檢驗(yàn)種細(xì)胞、原代細(xì)胞以及帶代次細(xì)胞，以保障細(xì)胞中不會(huì)出現(xiàn)支原體污染的情況。另外，針對(duì)新引進(jìn)的細(xì)胞或是種毒，應(yīng)該首先進(jìn)行隔離培養(yǎng)工作，確認(rèn)檢驗(yàn)結(jié)果合格，方可應(yīng)用于車間生產(chǎn)工作。

3.3 消毒滅菌采用正確的消毒滅菌處理方法，有利于控制各種微生物以及污染物滋生，所以，一方面，需要針對(duì)生產(chǎn)生物制品過程中需要應(yīng)用的全部物品以及器具，開展全面徹底的消毒滅菌工作，確認(rèn)無菌測(cè)試結(jié)果合格，方可再次投入到使用當(dāng)中，以能夠從源頭處開始對(duì)污染物的產(chǎn)生起到有效的控制作用，另一方面，應(yīng)該注意，其中應(yīng)用的消毒滅菌方法正確與否，例如干熱烤箱或是高壓鍋中大量堆積物品，則可能導(dǎo)致出現(xiàn)加熱不均的情況，也就能夠引起滅菌不徹底的情況，或是在進(jìn)行滅菌工作時(shí)，存在循環(huán)時(shí)間過短的現(xiàn)象，特別是其中液體劑量已經(jīng)超過500mL，或是其中含有淀粉、瓊脂一類的膠質(zhì)物質(zhì)，能夠?qū)е聹缇Ч蠓冉档停栽陂_展消毒滅菌工作的過程中，還需要對(duì)滅菌材料的性質(zhì)、質(zhì)量、尺寸、體積等各個(gè)方面進(jìn)行充分考慮和合理協(xié)調(diào)，以保障消毒滅菌工作效果良好。

3.4 合理應(yīng)用抗生素將抗生素應(yīng)用于支原體污染之中，可以起到較好的抑制作用，所以在開展生物制品生產(chǎn)工作的過程中，需要對(duì)抗生素進(jìn)行合理應(yīng)用，以降低支原體污染情況出現(xiàn)的機(jī)率。但是從實(shí)際上來看，支原體對(duì)于一般抗生素普遍不具有良好的敏感性，甚至存在抗藥性，所以需要提升抗生素選擇的合理性，在保持用藥劑量科學(xué)合理的同時(shí)，盡可能不對(duì)細(xì)胞正常功能產(chǎn)生影響，并在此同時(shí)對(duì)支原體污染情況進(jìn)行有效控制。

4 結(jié)語

支原體屬于一類病原微生物，針對(duì)人體或動(dòng)物均能夠產(chǎn)生致病性，一旦生物制品受到支原體污染，其品質(zhì)將能夠出現(xiàn)大幅度的下降，而支原體污染這一情況能夠體現(xiàn)出隱蔽性特征，所以還需針對(duì)相關(guān)的原材料以及環(huán)境加強(qiáng)檢驗(yàn)和控制工作，以保障獸用生物制品的質(zhì)量。當(dāng)前獸用生物制品的生產(chǎn)廠家所應(yīng)用的篩查方式雖然快捷有效，但是相對(duì)于與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)來說，仍然不夠完善，所以有必要根據(jù)實(shí)際情況對(duì)管理制度進(jìn)行進(jìn)一步的規(guī)范，并嚴(yán)格控制各個(gè)操作環(huán)節(jié)，以能夠?qū)撛诘奈廴撅L(fēng)險(xiǎn)完全排除。