信璐瑤 石帥鋒 劉祥杰 齊萌 王云峰 鄧金華 余復(fù)昌

摘 要：為了解阿拉爾市售鴿的蛔蟲感染種類，采用剖檢法對從阿拉爾市農(nóng)貿(mào)市場購買的110羽鴿進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)14羽感染蛔蟲，感染率為12.7%（14/110）;共獲蟲體188條，最大感染強(qiáng)度為48條/羽。隨機(jī)提取10條蟲體DNA，分別基于線蟲SSU rDNA、nad2和cox1基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，結(jié)果顯示：所獲蟲體的SSUrDNA和nad2基因序列與雞尾鸚鵡蛔蟲同源性分別為99.9%和100%;cox1基因序列與鴿蛔蟲同源性為97.9%;鑒定本次分離的蟲體為雞尾鸚鵡蛔蟲。進(jìn)化分析顯示，本次所獲鴿源蛔蟲分離株與雞尾鸚鵡蛔蟲分離株聚類在一支，而與其他屬蛔蟲處于不同分支。研究結(jié)果為鴿源蛔蟲的種類鑒定提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：蛔蟲;鑒定;種類;鴿

中圖分類號：S836 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1673-1085（2022）02-0005-06

蛔蟲病是鴿常見的腸道寄生蟲病，可引起翅膀下垂、羽毛蓬亂、呆立萎靡、飛行能力降低和異嗜癖等癥狀，在我國各地廣泛流行[1]?；紫x發(fā)育不需要中間宿主，主要是感染性階段的蛔蟲卵通過污染用具、飼料、飲水等途徑傳播和感染。蛔蟲可感染各年齡段鴿，臨床癥狀表現(xiàn)主要跟感染強(qiáng)度呈正相關(guān)，感染強(qiáng)度大時可導(dǎo)致鴿群發(fā)生死亡，對養(yǎng)鴿業(yè)造成較大的危害[2]。報道顯示，寄生于禽類的蛔蟲種類至少有8種，我國禽類常見感染的種類有雞蛔蟲（Ascaridia galli）、鴿蛔蟲（Ascaridia columbae）和雞尾鸚鵡蛔蟲（Ascaridia nymphii），其中雞蛔蟲和鴿蛔蟲均可感染鴿，雞尾鸚鵡蛔蟲主要感染鸚鵡[3]。

傳統(tǒng)的蛔蟲分類鑒定是對成蟲蟲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，該法簡單便捷，但需要經(jīng)驗豐富者進(jìn)行鑒定，形態(tài)相近的種類不能有效區(qū)分，具有一定局限性。分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲種類鑒定方面具有較好的特異性和敏感性，可通過序列差異揭示物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，常用的蛔蟲分子標(biāo)記有核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（cox1）、核糖體小亞基（SSU rDNA）和煙酰胺脫氫酶亞基II（nad2）等[1，4]。

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對鴿產(chǎn)品的市場需求不斷增加，肉鴿養(yǎng)殖已成為新興家禽產(chǎn)業(yè)之一。新疆南疆地域廣泛，人口密度低，自古有肉鴿養(yǎng)殖的傳統(tǒng)，近年來為促進(jìn)當(dāng)?shù)鼐蜆I(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，政府大力倡導(dǎo)肉鴿產(chǎn)業(yè)發(fā)展[5]。然而，受多種因素影響，新疆南疆地區(qū)肉鴿養(yǎng)殖以農(nóng)牧民和小型養(yǎng)殖場為主，養(yǎng)殖人員疫病防治知識水平偏低，飼養(yǎng)管理水平不高。為了解阿拉爾市售鴿感染情況及其種類，采用系統(tǒng)剖檢法和PCR法對鴿進(jìn)行調(diào)查和檢測，以期為鴿蛔蟲病的防治提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 鴿的蛔蟲樣本收集

自阿拉爾市農(nóng)貿(mào)市場購買110羽鴿，采用系統(tǒng)剖檢法進(jìn)行剖檢。經(jīng)肉眼觀察，將在腺胃、肌胃及腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛔蟲成蟲，置于70%乙醇中保存。

1.2 蛔蟲蟲體DNA提取

從鴿體內(nèi)檢出的所有蛔蟲中，隨機(jī)選取10條蛔蟲，各剪一段5 mm蟲體，分別置于無菌的1.5 mL離心管中，充分研磨后，采用組織基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）按照操作說明步驟提取蟲體DNA，置-20 ℃長期保存。

1.3 PCR擴(kuò)增

參考文獻(xiàn)報道[3，4，6]分別設(shè)計線蟲通用的SSU rDNA、nad2和cox1基因的引物序列，由蘇州金維智生物科技有限公司合成，引物序列和反應(yīng)程序見表1。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2× EasyTaq PCR SuperMix （北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）12.5 μL，雙蒸水 10.9 μL，上下游引物各0.3 μL，DNA 模板1 μL。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL第二輪PCR產(chǎn)物加入1%的瓊脂糖凝膠膠孔中，110 V電壓電泳30 min，置凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.4 序列比對和種系發(fā)育分析

成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測序，由蘇州金維智生物科技有限公司完成。測序所獲序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行比對分析，根據(jù)比對結(jié)果鑒定蛔蟲種類。下載相關(guān)蛔蟲同源序列，采用Mega 6.0軟件，選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹，其可靠性用Bootstrap分析檢測，進(jìn)行1 000個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 鴿的蛔蟲檢查和PCR擴(kuò)增結(jié)果

對110羽鴿進(jìn)行剖檢，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)有14羽感染蛔蟲，感染率為12.7%（14/110）。14羽呈蛔蟲感染陽性的鴿中，最大感染強(qiáng)度為48條/羽，共收集蛔蟲蟲體188條。

分別基于SSU rDNA、nad2和cox1基因位點(diǎn)，采用PCR法擴(kuò)增隨機(jī)選取的10條蛔蟲DNA樣本，分別擴(kuò)增出約845、266 bp和450 bp的條帶，與目的片段相符，分別見圖1、圖2和圖3。

2.2 鴿的蛔蟲序列分析

在SSU rDNA基因位點(diǎn)，成功獲得10條蛔蟲序列，序列一致，均與來自日本的雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲（LC057210） 同源性為99.9%，存在1個堿基差異，在第25核苷酸位置存在插入堿基A。

在nad2基因位點(diǎn)，成功獲得10條蛔蟲序列，序列一致，均與來自日本的雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲（LC061195） 同源性為100%。

在cox1基因位點(diǎn)，成功獲得10條蛔蟲序列，序列一致，均與甘肅鴿源鴿蛔蟲（JX624729） 同源性為97.9%，存在5個堿基差異，分別在801、858、936、954和1086核苷酸位置存在A→G，T→C，A→G，C→T和A→G，提示其存在種類差異。

通過序列分析，鑒定本調(diào)查所獲蛔蟲均為雞尾鸚鵡蛔蟲。

2.3 鴿的蛔蟲序列種系發(fā)育分析

基于SSU rDNA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，本調(diào)查所獲鴿的蛔蟲序列與日本雞尾鸚鵡源和我國廣東金剛鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲序列聚集在一支，與美國雞源雞蛔蟲聚類構(gòu)成1個亞群結(jié)構(gòu)，而與其他屬蛔蟲形成不同的亞群分支 （圖4）。

基于nad2基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，本調(diào)查所獲鴿的蛔蟲序列與日本雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲單獨(dú)聚類構(gòu)成1個亞群，而與其他屬蛔蟲形成不同的亞群分支 （圖5）。

基于cox1基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，本文獲得的序列與我國甘肅鴿源鴿蛔蟲單獨(dú)聚類形成1個亞群（圖6）。

3 討論

蛔蟲是鴿體內(nèi)的大型寄生線蟲，時常引起群體感染，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。對線蟲進(jìn)行種類鑒定通常以形態(tài)學(xué)方法對蟲體進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征觀察，但要求觀察者是經(jīng)驗豐富者，且步驟較為繁瑣。目前，分子生物學(xué)技術(shù)已成為寄生蟲分類鑒定常用方法之一。Yang等[3]基于18S rDNA基因、ITS rDNA基因和nad4基因?qū)V東的金剛鸚鵡的蛔蟲鑒定，結(jié)果為雞尾鸚鵡蛔蟲;Abe等[4]通過nad2基因?qū)碓从谌毡倦u尾鸚鵡的蛔蟲研究發(fā)現(xiàn)，所獲得的蟲體是與鴿蛔蟲高度同源的雞尾鸚鵡蛔蟲;李佳緣等[7]基于cox1基因?qū)碓从趶V東、云南、湖南的8條雞的蛔蟲進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該位點(diǎn)雞蛔蟲與其他蛔蟲存在較大種間差異。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在SSU rDNA和nad2基因位點(diǎn)所獲鴿源蛔蟲序列與日本的雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲序列的同源性分別為99.9%和100%，與上述報道相一致，提示不同宿主來源和不同地理來源的雞尾鸚鵡蛔蟲存在一定的差異。在cox1基因所獲鴿源蛔蟲序列均與我國甘肅鴿源鴿蛔蟲存在5個堿基差異，提示存在種類差異，其應(yīng)該是不同的種;由于目前禽源蛔蟲cox1基因序列尚較少，其種系進(jìn)化發(fā)育有待于進(jìn)一步分析。本研究結(jié)果為鴿源蛔蟲的種類鑒定提供了基礎(chǔ)資料。

造成鴿蛔蟲病的發(fā)生主要是因為飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生差、飼料營養(yǎng)不均衡、養(yǎng)殖技術(shù)低、防病意識差等因素，防治鴿蛔蟲病應(yīng)做好鴿舍的清潔工作，及時清除糞便，保證飼料和飲水衛(wèi)生，選用優(yōu)質(zhì)混合料，定期驅(qū)蟲，發(fā)現(xiàn)病例及時隔離治療等[8]。

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