蘇鴻鋒 晏嫦妤

（華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642）

越南擁有豐富的茶樹資源，大致分為小葉茶（C.sinensis（L.）O.Kuntze var. sinensis）、阿薩姆茶（C.sinensis var. assamica（Masters））和撣茶（C.sinensis var. pubilimba Chang），其中小葉茶品種占比最大，撣茶品種占比最少[1]。緬甸茶樹多為喬木和小喬木的大葉品種，僅在北部地區(qū)混有葉形較小的茶樹，其主要的茶樹品種類型包括撣部種（T.S. Burma and shan）、云南大葉種（T.S. yunan）、葡萄種（T.S. Putao）、阿薩姆種以及一些野生型茶樹[2]。但是關于越南、緬甸茶樹種質(zhì)資源遺傳背景的研究較少。本研究采用ISSR分子標記技術，對華南農(nóng)業(yè)大學茶樹資源圃中的17份越南、緬甸茶樹種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，以期了解這些資源的遺傳背景，為進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于華南農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)茶園，摘取茶樹單株嫩葉用于提取基因組DNA（表1）。

1.2 實驗試劑與設備

實驗試劑包括快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（DP321） 、2×Taq PCR Mastermix（KT201）、GeneGreen核酸染料（RT210）、D2000 DNA Marker（MD114） 、70%乙醇溶液（v/v）和異丙醇溶液等。

主要儀器設備包括離心機、WiseBath恒溫水浴鍋、BG-Power600型電泳儀、SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋、超低溫冰箱、Link-Bio PCR熱循環(huán)儀、Link-Bio超微量核酸蛋白分析儀、伯樂GelDoc XR+凝膠成像儀、IM-25制冰機、鼓風烘干箱等。

1.3 方法

1.3.1 茶樹DNA的提取

利用由天根生化科技（北京）有限公司提供的快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（DP321）對17份茶樹材料DNA進行提取，并及時放入-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的篩選與PCR擴增

經(jīng)篩選，選用引物UBC826、UBC830、UBC849、UBC873、UBC880，引物序列見表2。PCR反應體系和PCR擴增條件分別見表3和表4。

表2 引物序列信息

表3 ISSR-PCR反應體系

表4 ISSR-PCR反應程序

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采取人工讀帶的方法，在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)拍照后，讀取瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)的條帶，將在相同位置的地方出現(xiàn)的清晰可辨的條帶記作“1”，相同位置的地方?jīng)]有出現(xiàn)條帶或無法辨析的條帶記作“0”，并把五條引物擴增出來的所有條帶的數(shù)據(jù)輸入到Excel表格，計算出ISSR引物的多態(tài)性百分比。使用NTSYSpc2.10、Popgene32等軟件進行遺傳多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴增多樣性分析

圖1和圖2為部分擴增結(jié)果，使用軟件Popgene32對5條ISSR引物的擴增結(jié)果進行分析表明（表5），5條引物共擴增出45個位點，多態(tài)性位點38個，總多態(tài)性百分率為84.44%，平均多態(tài)性位點7.6個。其平均Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.28，平均Shannon信息指數(shù)（I）為0.44。說明該17份茶樹供試材料具有豐富的遺傳多樣性，可以作為育種研究的材料。

圖1 引物UBC826的擴增結(jié)果

圖2 引物UBC826的擴增結(jié)果

表5 引物擴增結(jié)果及多態(tài)性

2.2 遺傳相似性分析

17份材料的遺傳相似性系數(shù)與遺傳距離結(jié)果如表6所示，遺傳相似系數(shù)的變化范圍在0.489~0.867之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.704，其遺傳距離在0.143~0.716之間，平均遺傳距離為0.358，說明其個體間存在較大的變異。其中編號為Y2和Y3、Y6和Y8的樣本遺傳相似性系數(shù)最高，為0.867；編號為S4和Y12的樣本遺傳相似性系數(shù)最低，為0.489。將17份茶樹資源按品種劃分為越南大葉種和緬甸撣部種后進行居群間分析得，總遺傳多樣性（HT）為0.2715，種群內(nèi)基因多樣性（HS）為0.2369，種群間基因多樣性（DST）為0.0346，遺傳分化水平（Gst）為0.1277，基因流為3.4163，兩個居群間的遺傳相似性為0.0949，說明該兩個品種間存在中等程度的遺傳分化，種群內(nèi)基因交流較為頻繁，而種群間的遺傳交流較低。

表6 供試材料的遺傳相似系數(shù)與遺傳距離

2.3 聚類分析

使用軟件NTSYSpc2.10分析17份材料種質(zhì)資源的原始二元矩陣數(shù)據(jù)，按UPGMA法（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean）對供試材料種質(zhì)資源進行聚類分析（圖3）。結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.61處，17份供試材料只有編號為Y12的茶樹樣本被單獨劃分出來。在遺傳相似性GS為0.68處，17份茶樹資源被劃分為3大類，類群Ⅰ包括13份茶樹資源，其中有11份越南茶樹資源和2份緬甸茶樹資源、類群Ⅱ包括3份緬甸茶樹資源、類群Ⅲ包括1份越南茶樹資源（Y12）。

圖3 17份茶樹種質(zhì)資源的聚類分析

3 討論與結(jié)論

3.1 17份茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

本研究結(jié)果說明供試材料的茶樹遺傳多樣性豐富，個體間變異程度較大，可以作為育種研究中的優(yōu)良材料。茶樹Y2與Y3、Y6與Y8具有最高的遺傳相似度（0.867），證明它們有比較一致的遺傳基礎；茶樹Y12與S4的遺傳相似程度最低（0.489），變異豐富較大。越南大葉種的遺傳相似度（0.756）大于撣部種的遺傳相似度（0.667），因此撣部種茶樹的變異程度大于越南大葉種茶樹，撣部種茶樹具有更豐富的遺傳多樣性。茶樹Y12在遺傳相似度為0.61處被單獨劃分出來，證明其變異最大，可以作為日后特異種質(zhì)進行進一步研究。緬甸撣部種茶樹S2和S5被聚類到類群Ⅰ（越南大葉種群體），其原因有待進一步分析。

3.2 與不同地區(qū)與國家的茶樹資源遺傳多樣性比較

基于ISSR分子技術（表7），朱晨等[3]利用該法研究53份福建茶樹資源，結(jié)果表明其多態(tài)性位點占比為94.84%，基因多樣性指數(shù)為0.224，Shannon信息指數(shù)為0.368，遺傳相似系數(shù)為0.895。孫雪梅等[4]利用該法研究云南67份茶樹資源，結(jié)果表明其多態(tài)性位點占比為97.76%，基因多樣性指數(shù)為0.27，Shannon信息指數(shù)為0.42，遺傳相似系數(shù)為0.693。高樹文[5]利用該法研究28份山東茶區(qū)資源，結(jié)果表明其多態(tài)性位點占比為86.0%，遺傳相似系數(shù)為0.693。李浩宇等[6]對蘇州洞庭地區(qū)的51份茶樹資源進行分析，結(jié)果表明其多態(tài)性位點占比為92.11%，遺傳相似系數(shù)介于0.37~0.89。李建華等[7]對四川地區(qū)37份茶樹資源進行分析，結(jié)果表明其多態(tài)性位點占比為95.2%，遺傳相似系數(shù)介于0.689。除此之外，周治淼等[8]利用SRAP分子標記對廣東地區(qū)25份茶樹資源進行分析，結(jié)果表明其多態(tài)性基因位點占比88.67%，遺傳相似系數(shù)為0.3195。Shen CW等[9]利用RAPD分子標記分析湖南240份茶樹資源，結(jié)果表明其多態(tài)性位點占比為88.9%，遺傳相似系數(shù)0.57[9]。喬小燕等[10]利用EST-SSR技術分析廣東、廣西共105份茶樹資源，其中廣西茶樹資源的多態(tài)性信息含量（PIC）為0.41，地區(qū)間遺傳相似系數(shù)在0.83～0.94之間；李燁昕[11]利用SSR技術對安徽65份茶樹資源，結(jié)果表明其Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.4751，Shannon信息指數(shù)為0.7869，遺傳相似系數(shù)在0.946~0.987之間。曹爍[12]基于SNP（單核苷酸多態(tài)性）分子標記分析貴州地區(qū)51份茶樹資源，結(jié)果顯示其基因多樣性為0.472，Shannon信息指數(shù)為0.66，遺傳相似系數(shù)為0.570。Xu YX等[13]基于SCoT（目標起始密碼子多態(tài)性）分子標記對浙江18份茶樹品種資源進行分析，結(jié)果表明其多態(tài)性位點百分比為83.7%，遺傳相似系數(shù)在0.587~0.814之間。

表7 基于ISSR標記的不同地區(qū)茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)

由以上數(shù)據(jù)分析表明，17份茶樹材料的多態(tài)性百分比小于福建、云南、四川等茶樹資源的多態(tài)性百分比，接近于廣東、湖南、浙江等地區(qū)茶樹資源；其基因多樣性指數(shù)接近云南和福建，Shannon信息指數(shù)接近云南和湖南；其遺傳相似性小于福建、安徽和廣西等茶樹資源，高于廣東、湖南、貴州等地，接近于云南、山東、四川、貴州等地茶樹資源的遺傳相似系數(shù)?？傊?7份茶樹材料遺傳多樣性情況與云南茶樹資源基本一致。

不同的國家中，中國、日本和肯尼亞三個國家之間茶樹資源基因多樣性，中國最為豐富，其多態(tài)性位點百分比（PPL）為96.1%、Nei’s基因多樣性（H）為0.22、Shannon信息指數(shù)（I）為0.35[14]，與本研究的茶樹資源遺傳多樣性接近。Francis Wachira等[15]研究結(jié)果得：越南茶樹資源的基因多樣性為0.260，Shannon信息指數(shù)為0.389，低于本實驗數(shù)據(jù)，并且其遺傳相似性更接近印度、斯里蘭卡等國。從Yoshinobu Katoh等學者[16]的研究可知，緬甸的茶樹資源與滇緬茶（C. irrawadiensis）具有遺傳相似性，而越南茶樹資源與泰國茶樹在形態(tài)分類上有密切關聯(lián)。17份茶樹資源遺傳多樣性接近中國、印度、泰國等南亞和東南亞國家的茶樹資源，遺傳多樣性高于日本、肯尼亞等國。李遠志等[17]研究認為越南大葉種、緬甸的撣部種與中國的云南大葉種在遺傳上具有相似性，其原因可能是云南大葉種通過與越南和緬甸部分相連的河流，如怒江、龍川江等逐漸流到越南和緬甸后形成的兩個茶樹品種。

雖然ISSR分子標記應用廣泛，但在研究茶樹育種的時候，選取何種分子標記進行研究有待進一步探索。它取決于一系列因素，包括引物的分子性質(zhì)、研究對象生物學特性和可以利用的資源等[18]。在Kumar Mondal[19]研究的認為，ISSR引物比SSR引物更容易獲得，可以作為RAPD分子標記技術的一種補充手段使分析結(jié)果更加可靠，但ISSR標記不是共顯性標記，可能會導致有效的雙等位基因條帶消失等缺點。目前有較多研究數(shù)據(jù)與本次研究數(shù)據(jù)進行比較，不過由于采取的分子標記手段有所不同，對于其分析結(jié)果可能有所差異。Zhang Y等[20]通過SRAP、SCoT、EST-SSR三種分子標記研究秦巴地區(qū)茶樹資源，發(fā)現(xiàn)它們產(chǎn)生的遺傳距離相關性很小，因此不建議用單一分子標記的手段評價遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，而應該利用不同類型分子標記的結(jié)合進行綜合評價。所以，對于不同地區(qū)的茶樹資源、不同的茶樹品種和不同的茶樹群體，采取何種手段進行研究，還需要進行進一步的探究。本研究基于ISSR分子標記手段研究越南和緬甸茶樹品種的遺傳多樣性，日后要在此基礎上進行更多的探究，才能科學有效分析遺傳多樣性，合理利用茶樹種質(zhì)資源。