吳飛，吳杰，陳學(xué)秋，周靜茹，張惠，黃艷，時(shí)恒枝，楊怡，馬光旭，杜愛(ài)芳

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310058）

細(xì)胞系（cell line）通常指能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞，其易于傳代和編輯的特性使得其在生物學(xué)研究尤其是在探究癌癥發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療方案中具有重要的地位[1?2]。然而，廣泛應(yīng)用的綿羊細(xì)胞系仍十分匱乏[3]，國(guó)內(nèi)易獲得的主要包括綿羊肺成纖維細(xì)胞（OAR?L1）和迪慶綿羊皮膚成纖維細(xì)胞（DQSHS1），前者是由中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)于1990年從雌性綿羊的肺組織中建立的細(xì)胞系，呈纖維狀，貼壁生長(zhǎng)，2～3 d 以1∶3 的比例傳代，生長(zhǎng)迅速，連續(xù)傳代后形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，非常適合做細(xì)胞模型。目前，在基于綿羊細(xì)胞的研究中，仍主要依賴于原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)，鮮有將現(xiàn)有綿羊細(xì)胞系應(yīng)用于研究中的報(bào)道[4?5]。同時(shí)，對(duì)綿羊細(xì)胞系或原代細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染方法的探索也十分有限，缺乏可推廣的普適性結(jié)論[6?10]。因此，尋找一種能夠簡(jiǎn)單、便捷地對(duì)綿羊細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染的方法十分重要。

真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)基因及蛋白質(zhì)功能的一種重要手段，普遍應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和病原學(xué)等眾多學(xué)科的多個(gè)領(lǐng)域中，主要可分為物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)方法[11?12]。每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，如電穿孔法、顯微注射法、基因槍粒子轟擊法和激光轉(zhuǎn)染技術(shù)等物理學(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)打靶，但這類方法不僅需要特定的高精度儀器和專業(yè)的培訓(xùn)，而且通常操作的細(xì)胞數(shù)量有限或受轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率過(guò)高[11,13?14]。因此，這類方法在基于反芻動(dòng)物細(xì)胞研究過(guò)程中的應(yīng)用有限。目前，應(yīng)用最為廣泛的仍是化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，其中最常用的是脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑（LipofectamineTM2000 transfection reagent, Lipo 2000）、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine,PEI）及其類似的產(chǎn)品，其在原代綿羊細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效果最好，但效率均未超過(guò)30%[4?5,15?16]。 另 外，成 纖 維 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒（CytofectTMfibroblast transfection kit,CF2）因具有顯著提高原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的能力[17]，亦受到部分學(xué)者關(guān)注，但其是否能高效轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞系仍需要進(jìn)一步探索。至于生物學(xué)方法，目前應(yīng)用更多的仍是慢病毒，首先是因?yàn)檫@類病毒存在缺陷，在侵染了一代細(xì)胞后不會(huì)在受侵染的細(xì)胞中再次包裝新的病毒；其次是這類方法在細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率上具有顯著的優(yōu)勢(shì)[18?19]，甚至能夠有效侵染多種公認(rèn)的難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或原代細(xì)胞[13]。但這類方法在基于綿羊細(xì)胞的研究中，主要用于構(gòu)建過(guò)表達(dá)或敲降細(xì)胞株，鮮有將之用作普通轉(zhuǎn)染方法[20]的報(bào)道。

基于此，本研究擬使用PEI、Lipo 2000、CF2 和慢病毒侵染的方法，對(duì)OAR?L1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果的比較，以尋找能夠快捷、高效轉(zhuǎn)染OAR?L1 細(xì)胞的方法，為后續(xù)基于綿羊細(xì)胞的研究奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒

細(xì)胞（HEK 293T細(xì)胞）、菌株（大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10）和質(zhì)粒（pMD2.G、psPAX2 以及熒光質(zhì)粒pLentiCMV?EGFP?Puro、pLentiCMV?mCherry?Puro）均由本實(shí)驗(yàn)室凍存，其中2種熒光質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 熒光質(zhì)粒圖譜示意Fig.1 Schematic diagram of fluorescent plasmid maps

1.2 試驗(yàn)試劑

2×Taq主混合物購(gòu)自上海近岸生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、BamHⅠ和SalⅠ，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（PEI,Linear）（分子量25 000）、脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑（Lipo 2000）和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（CF2）分別購(gòu)自美國(guó)Polysciences、Thermo Fisher Scientific 和Cell Applications公司；達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM）和Gibico 胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）分別購(gòu)自以色列Biological Industries 公司和美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；預(yù)染彩虹蛋白標(biāo)志物10～180 kDa、FDbio?Femto ECL 發(fā)光液、一步法凝膠制備試劑盒（12%）和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自浙江易思得生物科技有限公司；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）抗體（小鼠單抗）、Western一抗稀釋液和Western一抗二抗去除液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；mCherry 抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物及序列測(cè)定

質(zhì)粒鑒定時(shí)所用的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）引物為測(cè)序通用引物（CMV?F，5′?CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG?3′；WPRE?R，5′?CATAGCGTAAAAGGAGCAACA?3′），由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司提供，且測(cè)序亦由該公司完成。

1.4 熒光質(zhì)粒表達(dá)鑒定

將實(shí)驗(yàn)室保存的熒光質(zhì)粒pLentiCMV?EGFP?Puro、pLentiCMV?mCherry?Puro轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10 中并涂于氨芐抗性的溶菌肉湯（lysogeny broth,LB）平板上，次日挑取單克隆送往公司測(cè)序；用測(cè)序正確的菌液樣品在氨芐抗性的LB平板上劃線，次日挑取單克隆，于37 ℃條件下?lián)u菌3 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性樣品接種至含5 mL氨芐抗性LB溶液的試管中擴(kuò)繁，16～18 h后按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行質(zhì)粒抽提；測(cè)定所提質(zhì)粒的濃度并經(jīng)雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒在6孔板中按照2 μg/孔的劑量轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，后續(xù)結(jié)合熒光表達(dá)情況和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）結(jié)果對(duì)留存質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.5 PEI、Lipo 2000 及CF2 轉(zhuǎn)染OAR-L1 細(xì)胞

鑒定成功的質(zhì)粒，分別以PEI（1 mg/mL）、Lipo 2000和CF2為轉(zhuǎn)染試劑，按不同的劑量轉(zhuǎn)染在24孔板中以梯度密度鋪板的OAR?L1 細(xì)胞（圖2）。待滿鋪的OAR?L1 細(xì)胞消化后重懸于2 mL培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)后將1×104、2×104、4×104、8×104個(gè)細(xì)胞分別接種至24 孔板A、B、C 和D 行對(duì)應(yīng)的孔中，轉(zhuǎn)染時(shí)24 孔板的第1—6 列分別加入1、2、3、4、5、6 μL PEI、Lipo 2000 或CF2轉(zhuǎn)染劑（圖2C）。轉(zhuǎn)染參照相應(yīng)試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，48 h后觀察熒光表達(dá)情況。

1.6 慢病毒侵染OAR-L1 細(xì)胞

鑒定成功的質(zhì)粒在6孔板中按照每孔1 μg熒光質(zhì)粒、0.75 μg psPAX2、0.25 μg pMD2.G 的劑量共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程如圖2B所示；隨后收集表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞上清液，以800g離心5 min，并經(jīng)0.45 μm的濾器過(guò)濾獲得包裝完成的病毒液；收集的慢病毒用于侵染以圖2C 方式鋪板的OAR?L1 細(xì)胞，侵染時(shí)24 孔板的第1—6 列每孔分別使用100、200、300、400、500、600 μL 病毒液，并補(bǔ)加100 μL 新鮮培養(yǎng)液，6 h后再補(bǔ)加250 μL培養(yǎng)液，24 h后換液，48 h后觀察熒光并采用蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證（圖2B）。

1.7 慢病毒保存條件和時(shí)間

包裝完成后收集的病毒液共分為8 份，其中2份在收集后立即侵染OAR?L1細(xì)胞，其余6份分成2組分別儲(chǔ)存在4 和－80 ℃條件下，并在第5、10、15天各自取出1 份侵染OAR?L1 細(xì)胞，每次侵染48 h后觀察熒光表達(dá)情況。

1.8 慢病毒共侵染OAR-L1 細(xì)胞

本研究中共侵染以2種方式進(jìn)行，一種是先包裝再共同侵染，另一種是同時(shí)包裝2種慢病毒質(zhì)粒，獲得混合的病毒液后再進(jìn)行侵染。前者的病毒包裝過(guò)程如圖2B 所示，獲得的2 種病毒液按照1∶1 的比例侵染OAR?L1細(xì)胞；后者的包裝過(guò)程也相似，不同的是在轉(zhuǎn)染時(shí)將1 μg 紅色熒光質(zhì)粒、1 μg 綠色熒光質(zhì)粒與0.75 μg psPAX2 和0.25 μg pMD2.G 充分混合，后續(xù)過(guò)程與前面一致，48 h后觀察熒光表達(dá)情況。

圖2 轉(zhuǎn)染、侵染流程和細(xì)胞鋪板情況Fig.2 Protocols of transfection,infection and cell plating

1.9 融合其他外源蛋白的慢病毒共侵染OAR-L1細(xì)胞

pLentiCMV?EGFP?Puro 及pLentiCMV?mCherry?Puro 經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)雙酶切后連接入一段外源基因，構(gòu)建能夠表達(dá)特定蛋白的熒光質(zhì)粒，再根據(jù)1.7節(jié)結(jié)果選擇合適的共侵染方式進(jìn)行共侵染試驗(yàn)，通過(guò)觀察熒光表達(dá)情況和采用蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)ImageJ 1.52v軟件統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染后表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)；利用t檢驗(yàn)對(duì)不同轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用GraphPad Prism 6繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種熒光質(zhì)粒的表達(dá)鑒定結(jié)果

用本實(shí)驗(yàn)室留存質(zhì)粒（pLentiCMV?EGFP?Puro和pLentiCMV?mCherry?Puro）轉(zhuǎn)染TOP10 后挑取單克隆，菌液PCR 鑒定結(jié)果顯示，所有克隆均擴(kuò)增出長(zhǎng)約750 bp 的目的條帶（圖3A）；BamHⅠ/SalⅠ雙酶切結(jié)果可見(jiàn)長(zhǎng)約750 bp 的目的條帶（圖3B）。分 別 將 鑒 定 正 確 的pLentiCMV?EGFP?Puro 和pLentiCMV?mCherry?Puro 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，結(jié)果（圖3C）顯示，HEK 293T 細(xì)胞分別成功表達(dá)綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果中可見(jiàn)與理論大小一致的目的條帶，進(jìn)一步證明熒光蛋白在細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室留存的pLentiCMV?EGFP?Puro 和pLentiCMV?mCherry?Puro 質(zhì)粒能夠表達(dá)相應(yīng)的熒光蛋白，且能在HEK 293T 細(xì)胞中高效表達(dá)，適用于后續(xù)的試驗(yàn)。

圖3 熒光質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.3 Results of fluorescent plasmid identification

2.2 不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染OAR-L1細(xì)胞的效果比較

PEI、Lipo 2000 和CF2 轉(zhuǎn)染OAR?L1 細(xì)胞的結(jié)果顯示，3 種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)OAR?L1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均未超過(guò)30%，且CF2 最佳轉(zhuǎn)染效率要顯著低于PEI 和Lipo 2000（圖4）。同時(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)染后不同組熒光細(xì)胞數(shù)目可知，3 種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞密度和試劑使用量都有比較嚴(yán)格的要求，當(dāng)轉(zhuǎn)染條件為2 μL CF2 或3 μL Lipo 2000 且鋪板細(xì)胞量為2×104個(gè)時(shí)，或1 μL PEI 在鋪板細(xì)胞量為4×104個(gè)時(shí)才能達(dá)到各自最佳轉(zhuǎn)染效果（圖4）。

圖4 3種試劑轉(zhuǎn)染OAR-L1細(xì)胞的效果Fig.4 Effects of three different reagents transfecting OAR-L1 cells

2.3 慢病毒侵染OAR-L1 細(xì)胞的效果

由圖5 可見(jiàn)，慢病毒侵染能夠在OAR?L1 細(xì)胞中高效表達(dá)異源蛋白，且其侵染效率與細(xì)胞鋪板密度和病毒液用量沒(méi)有明顯的相關(guān)性。但該種方法得到的表達(dá)效率要顯著高于PEI、Lipo 2000、CF2組最佳轉(zhuǎn)染效率（圖6）。

圖5 慢病毒侵染OAR-L1細(xì)胞的效果Fig.5 Effects of lentivirus infecting OAR-L1 cells

圖6 不同轉(zhuǎn)染試劑最佳轉(zhuǎn)染效率下的熒光細(xì)胞數(shù)目Fig.6 Numbers of fluorescent cells under the best transfection efficiencies of different regents

2.4 儲(chǔ)存條件和時(shí)間對(duì)慢病毒侵染效果的影響

在4 或－80 ℃分別存儲(chǔ)5、10、15 d 后，慢病毒侵染OAR?L1 細(xì)胞的效果如圖7 所示。從中可知，慢病毒在4 或－80 ℃條件下保存15 d 內(nèi)并不會(huì)對(duì)侵染效率產(chǎn)生明顯影響。因此，收集的慢病毒在4或－80 ℃條件下均能保存較長(zhǎng)時(shí)間。

圖7 不同保存條件和時(shí)間對(duì)慢病毒侵染OAR-L1細(xì)胞效果的影響Fig.7 Effects of different storage conditions and time on the infection efficiencies of OAR-L1 cells by lentivirus

2.5 不同方式包裝慢病毒共侵染OAR?L1的結(jié)果

2種慢病毒包裝方式共侵染OAR?L1細(xì)胞的結(jié)果顯示，2 種方法都能實(shí)現(xiàn)在OAR?L1 細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)2 種外源蛋白，但分開(kāi)包裝病毒再共同侵染的方式共表達(dá)效率更高（圖8）。

2.6 融合其他外源蛋白對(duì)慢病毒共侵染OAR-L1細(xì)胞的影響

2種熒光質(zhì)粒連接外源基因后，在HEK 293T細(xì)胞中包裝相應(yīng)的慢病毒，再共侵染OAR?L1 細(xì)胞，結(jié)果顯示，OAR?L1 細(xì)胞表達(dá)的融合外源基因的熒光蛋白強(qiáng)度要明顯低于空載熒光蛋白的強(qiáng)度，且前者熒光共定位的比例也明顯較后者低，但其本身的共定位比例并不低（圖8～9）。

圖8 2種包裝方式對(duì)慢病毒共轉(zhuǎn)染OAR-L1細(xì)胞的影響Fig.8 Effects of two packaging methods on co-transfection of OAR-L1 cells by lentivirus

3 討論

本研究通過(guò)比較不同的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)OAR?L1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染/侵染效果發(fā)現(xiàn)，PEI 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率雖然要比Lipo 2000稍高，但PEI的細(xì)胞毒性也更大，這與曹慧玲等[15]的研究結(jié)果相符。但這2 種目前公認(rèn)的轉(zhuǎn)染效率較高的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)受轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)該具有選擇性，因?yàn)樗鼈儗?duì)OAR?L1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率都不超過(guò)30%，與其他類似的研究結(jié)果[4?5,6?10,16]相當(dāng)；CF2 轉(zhuǎn)染OAR?L1 時(shí)也同樣沒(méi)有取得理想的效果，可能是因?yàn)檫@種試劑中含有的能夠提高原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的成分會(huì)抑制細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率。值得關(guān)注的是，在本試驗(yàn)中，雖然慢病毒包裝和侵染過(guò)程較其他轉(zhuǎn)染方式用時(shí)更長(zhǎng)，但結(jié)合上述結(jié)果可知，慢病毒侵染的方式能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)外源熒光蛋白的目的，與在其他細(xì)胞系中獲得的研究結(jié)果[21?23]一致，較本研究中其他轉(zhuǎn)染方法而言是一種更理想的OAR?L1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式。當(dāng)使用pLentiCMV?EGFP?Puro 和pLentiCMV?mCherry?Puro熒光質(zhì)粒時(shí)，侵染效率超過(guò)90%，然而，這2 種質(zhì)粒融合目的基因后侵染效率會(huì)有所降低，后續(xù)的試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)這種影響與所融合的基因相關(guān)，即是否能夠取得理想的侵染效果，可能在一定程度上也依賴于所插入的目的基因。

雖然使用慢病毒侵染的方式能夠高效地表達(dá)外源基因，但收獲的病毒液如何保存及有效期的問(wèn)題值得重視。一般來(lái)說(shuō)，包裝的慢病毒常通過(guò)4、－80 ℃冰箱或添加其他凍存劑等方式保存[20,24]?；诖耍驹囼?yàn)探究了在4和－80 ℃條件下保存不同時(shí)間后，病毒液侵染OAR?L1細(xì)胞效率的變化。結(jié)果顯示，無(wú)論是在4 ℃還是在－80 ℃保存條件下，15 d內(nèi)病毒液的侵染效率不會(huì)受到影響，因此，可提前包裝收集足夠的病毒液凍存后使用。另外，隨著科學(xué)研究日益深入，單個(gè)基因的轉(zhuǎn)染越來(lái)越難以滿足科研需求，因此，本研究還探索了利用慢病毒侵染的方式在OAR?L1 細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染的條件。結(jié)果表明，分別包裝后再共同侵染OAR?L1細(xì)胞能夠獲得更高的共轉(zhuǎn)率，這種方法在融合目的基因后依然有效，這使得在OAR?L1細(xì)胞中研究基因與基因間的相互作用成為可能。

雖然，目前已證實(shí)慢病毒在細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和保存方面具有優(yōu)勢(shì)，但限于細(xì)胞系和毒株等試驗(yàn)材料的缺乏，本研究并未就其本身是否影響細(xì)胞的各項(xiàng)機(jī)能、是否參與其他胞內(nèi)病原體涉及的信號(hào)通路以及是否適用于這些病原體的研究進(jìn)行深入的探索。另外，近年來(lái)轉(zhuǎn)錄后修飾相關(guān)研究越來(lái)越熱，通常的單個(gè)基因轉(zhuǎn)染或2個(gè)基因共轉(zhuǎn)并不能滿足這類研究的需求，如泛素化研究需要至少同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入3個(gè)基因（靶基因、泛素化連接酶和泛素）[25?26]，本試驗(yàn)尚未找到很好的方法去驗(yàn)證慢病毒侵染能否滿足這類需求，因?yàn)檫@可能需要表達(dá)第3種甚至更多種熒光蛋白，后續(xù)可以進(jìn)行更為深入的探索。

圖9 融合其他外源蛋白對(duì)慢病毒侵染OAR-L1細(xì)胞的影響Fig.9 Effects of fusing with other exogenous proteins on the infection of OAR-L1 cells by lentivirus

4 結(jié)論

本研究通過(guò)比較PEI、Lipo 2000、CF2以及慢病毒介導(dǎo)的4種轉(zhuǎn)染方法在OAR?L1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果，確定慢病毒侵染的方式比其他3 種方法更高效地在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了外源蛋白。此外，分開(kāi)包裝再共同侵染的方式能獲得更高的共轉(zhuǎn)率，而插入的目的基因會(huì)降低共轉(zhuǎn)效率且這種降低程度與插入基因自身特性相關(guān)聯(lián)。綜上所述，慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法能夠在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)基于OAR?L1 細(xì)胞對(duì)綿羊甚至其他反芻動(dòng)物展開(kāi)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，也能夠?yàn)樘剿髌渌y轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法提供參考。