葛瑩，張雷，王歡歡，樓立峰，李慶海，黃沁，章學(xué)東

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310024）

糖尿病一直是人類健康的巨大威脅，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，全球范圍內(nèi)的糖尿病患者數(shù)量將在2030 年達(dá)6.43 億（https://diabetesatlas.org）。作為一種慢性代謝性疾病，糖尿病患者主要表現(xiàn)為體內(nèi)胰島素分泌不足或胰島素抵抗而引起的高血糖癥[1]。當(dāng)血糖濃度長時間過高時，患者會出現(xiàn)一系列并發(fā)癥，比如心血管疾病、眼部病變和腎功能衰竭等。目前，治療糖尿病的藥物主要有胰島素類、胰島素增敏劑、磺酰脲類、雙胍類、α?葡萄糖苷酶抑制劑類[2]，其中，以α?葡萄糖苷酶抑制劑為代表的口服降糖藥在臨床上應(yīng)用廣泛，如阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等[3]。但是，長期服用這些化學(xué)合成藥物勢必會對人體造成一定的毒副作用，所以學(xué)者們不斷嘗試挖掘動植物來源的、具有降血糖功能的天然生物活性物質(zhì)。已有的研究發(fā)現(xiàn)，“苦瓜多肽”“海洋膠原肽”對糖尿病具有一定預(yù)防和治療作用[4?5]。

烏骨雞是我國歷史上傳統(tǒng)的藥食兩用保健型雞種。據(jù)《本草綱目》記載，烏骨雞具有“補(bǔ)虛勞羸弱，治消渴中惡”的作用，而中醫(yī)所稱消渴癥范疇涵蓋糖尿病[6]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，烏骨雞的功能活性成分除了黑色素，還包括氨基酸、脂肪酸和肌肽小肽、多肽等生物活性肽?；钚噪淖鳛閷C(jī)體功能或狀態(tài)有益的特定氨基酸片段，需經(jīng)蛋白質(zhì)酶解得到，具有分子量小、易吸收的特點(diǎn)[7?9]。目前，烏骨雞活性肽在補(bǔ)氣血、抗氧化、抗衰老、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等方面均有科學(xué)報道，但缺乏抗糖尿病方面的研究。因此，本試驗(yàn)旨在制備烏骨雞活性肽并分析其對糖尿病模型小鼠的體質(zhì)量、血液生化指標(biāo)和組織器官的影響，并探討烏骨雞活性肽在體內(nèi)發(fā)揮抗糖尿病作用的效果和途徑，從而為特色保健食品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用烏骨雞來自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自行培育的BG系烏骨雞群體，選擇150日齡的烏骨雞若干只，屠宰后迅速分離兩側(cè)胸肌，置于－20 ℃冰箱中凍存，備用；雄性ICR 小鼠（清潔級，5 周齡，體質(zhì)量20～22 g）購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于試驗(yàn)小鼠籠內(nèi)，室內(nèi)溫度（20±2）℃、相對濕度50%～60%、12 h/12 h明暗循環(huán)，保證專用飼料和清潔飲水的供應(yīng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)期1 周。所有動物試驗(yàn)操作均符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 試劑及溶液配制

鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）、阿卡波糖（德國Sigma 公司），木瓜蛋白酶（2 000 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（40 U/mg）、檸檬酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等分析純[生工生物工程（上海）股份有限公司]，4%組織細(xì)胞固定液（北京索萊寶科技有限公司），胰島素（insulin, INS）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。

檸檬酸鈉緩沖液配制：將2.1 g檸檬酸、2.94 g檸檬酸三鈉分別溶于100 mL ddH2O，再將這2 種溶液按體積比1∶1.32 混合，pH 調(diào)至4.2～4.5，制成0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液。

注射液配制：將STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，制成10 mg/mL 質(zhì)量濃度的注射液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后即刻使用。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；臺式低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；SHP?110X型恒溫水浴鍋（江蘇省常州億通分析儀器制造有限公司）；抽濾裝置（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；真空冷凍干燥機(jī)（美國Labconko公司）；血糖儀和血糖試紙（美國Roche公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；Chemray800 型全自動生化分析儀（廣東省深圳雷杜生命科技股份有限公司）；DM2500 型徠卡顯微系統(tǒng)（德國Leica 公司）；Pelliconn?3盒式超濾膜包、Congent?μScale切向流超濾系統(tǒng)、超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 烏骨雞活性肽制備

稱取適量烏骨雞肌肉，絞碎成肉泥，以質(zhì)量體積比1∶5 加水制成懸濁液，然后將木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶均以質(zhì)量體積比3∶1 000加入到懸濁液中混勻，pH 7.0，55 ℃酶解3 h，95 ℃滅酶30 min，以1.2×104r/min 離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾得到粗酶液，依次通過截留分子量為30 kDa 的超濾膜（操作壓力1.03×105Pa，流速180 mL/min）、5 kDa的超濾膜（操作壓力1.38×105Pa，流速120 mL/min），得到烏骨雞活性肽溶液，將其真空冷凍干燥成粉末，于－20 ℃條件下保存。

1.4.2 糖尿病模型小鼠構(gòu)建

ICR 小鼠（6 周齡）隔夜禁食16 h 后，按照120 mg/kg STZ劑量進(jìn)行腹腔注射來誘導(dǎo)糖尿病。注射7 d 后斷尾取血，當(dāng)空腹血糖值≥11.1 mmol/L 則視為糖尿病小鼠[10]。

1.4.3 試驗(yàn)分組

將糖尿病小鼠隨機(jī)分成4 個處理組，每組各10只小鼠，分別灌服100 mg/kg烏骨雞活性肽（低劑量組）、400 mg/kg烏骨雞活性肽（高劑量組）、30 mg/kg阿卡波糖（藥物組）、生理鹽水（陽性對照組）[11]。另設(shè)正常對照組小鼠，灌服生理鹽水，每日定時灌胃，給藥體積均為0.2 mL，持續(xù)30 d（7～12周齡）。

1.4.4 采樣

分別測定試驗(yàn)起始、終末的小鼠體質(zhì)量和空腹血糖值。終末時，采集小鼠眼眶靜脈竇血，于4 ℃條件下將血液靜置24 h，以3 000 r/min 離心15 min，分離出血清，將其保存于－80 ℃冰箱中。采用脫頸法處死小鼠并采集胰腺、肝、腎組織，對肝、腎稱量用以計(jì)算器官指數(shù)：器官指數(shù)=器官質(zhì)量/mg÷活體質(zhì)量/g。之后將肝、腎、胰腺組織樣本固定于4%多聚甲醛中。

1.4.5 血液生化指標(biāo)測定

使用全自動生化分析儀分別檢測血清甘油三酯（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL?C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL?C）含量。參照SOD、MDA、INS測試盒說明書要求，利用酶標(biāo)儀測定各吸光度值，并根據(jù)相關(guān)公式分別計(jì)算得到血清SOD活性以及MDA、INS含量。

1.4.6 組織病理學(xué)觀測

取固定后的肝、腎、胰腺組織樣本進(jìn)行石蠟包埋。按組織橫斷面進(jìn)行切片，然后用二甲苯脫蠟，再逐級經(jīng)過100%乙醇及梯度乙醇直至蒸餾水進(jìn)行水化，最后用蘇木精?伊紅（hematoxylin?eosin,HE）染色，梯度乙醇?二甲苯脫水至透明，封片鏡檢。樣本切片經(jīng)顯微鏡拍照后，使用Image-Pro Plus 軟件（美國Media Cybernetics公司）分析并計(jì)算胰腺組織中的胰島面積，設(shè)定正常對照組的胰島面積為1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理。使用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著性采用Tukey 檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏骨雞活性肽對小鼠體質(zhì)量和空腹血糖的影響

由表1 可知：灌胃起始，與正常對照組相比，低劑量組、高劑量組、藥物組、陽性對照組的體質(zhì)量均下降，空腹血糖水平均顯著升高（P＜0.05），表明STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠呈現(xiàn)體質(zhì)量減輕、血糖升高的癥狀；并且，由于糖尿病引發(fā)了死亡，低劑量組和陽性對照組小鼠的終末數(shù)量減少。比較同一組別中的起始與終末發(fā)現(xiàn)：陽性對照組的體質(zhì)量顯著降低（P=0.043），而低劑量組、高劑量組、藥物組以及正常對照組的體質(zhì)量分別增加了2.8%、6.2%、6.2%、4.7%；陽性和正常對照組的空腹血糖水平基本保持不變，而低劑量組、高劑量組、藥物組的空腹血糖水平分別顯著下降了29.3%（P=0.014）、40.5%（P=0.001）、32.6%（P=0.005），說明烏骨雞活性肽對糖尿病小鼠的體質(zhì)量和血糖水平具有一定的調(diào)節(jié)作用。同時，高劑量組的效果與阿卡波糖藥物組相似且均優(yōu)于低劑量組。

表1 各組小鼠的起始、終末體質(zhì)量和空腹血糖水平Table 1 Initial,final body mass and fasting blood glucose level of mice in each group

2.2 烏骨雞活性肽對小鼠血脂指標(biāo)的影響

TG和TC水平是脂質(zhì)平衡的重要指標(biāo)。由表2可知：與正常對照組相比，低劑量組、高劑量組、藥物組和陽性對照組的血清TG、TC、LDL?C 水平較高（其中，陽性對照組P=0.001、P=0.001 和P=0.002），表明糖尿病小鼠血脂代謝異常。與陽性對照組相比，低劑量組、高劑量組和藥物組的TG、TC、LDL?C水平下降，HDL?C水平升高，其中，藥物組的TG、TC下降顯著（P=0.020、P=0.007）；高劑量組的TC、LDL?C 下降顯著（P=0.013、P=0.038）且HDL?C 升高顯著（P=0.003），表明灌服的400 mg/kg 烏骨雞活性肽和阿卡波糖都具有一定的降高血脂作用。

表2 各組小鼠的血脂指標(biāo)Table 2 Indexes of blood lipids of mice in each group mmol/L

2.3 烏骨雞活性肽對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

SOD活性和MDA含量是反映機(jī)體自由基代謝的重要指標(biāo)。由表3可知：與正常對照組相比，低劑量組、高劑量組、藥物組和陽性對照組的SOD 活性降低且MDA 含量升高（其中，陽性對照組P=0.021），表明糖尿病小鼠清除體內(nèi)自由基的能力降低且存在脂質(zhì)過氧化。與陽性對照組相比，低劑量組、高劑量組和藥物組的SOD 活性顯著提高（P=0.047、P=0.016和P=0.034）且MDA含量降低（其中，高劑量組P=0.027），說明灌服的400 mg/kg 烏骨雞活性肽具有較好的抗氧化和清除自由基能力。

表3 各組小鼠的血清抗氧化指標(biāo)Table 3 Serum antioxidant indexes of mice in each group

2.4 烏骨雞活性肽對小鼠胰腺組織以及血清胰島素的影響

正常生理狀態(tài)下的胰島器官呈邊界清晰的球形細(xì)胞團(tuán)，胰島細(xì)胞大小均一，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富。相較于正常對照組，陽性對照組的胰島形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞核大小不一且胰島面積顯著減少（P=0.002），表明其胰島β細(xì)胞的病理損傷較嚴(yán)重。低劑量組、高劑量組和藥物組的胰島形態(tài)和面積則與正常對照組無顯著差異（圖1A～F）。同時，血清胰島素測定結(jié)果顯示，低劑量組、高劑量組、藥物組和正常對照組之間無顯著差異，但均顯著高于陽性對照組（P=0.002、P=0.001、P=0.003 和P=0.000）（圖1G），表明灌服烏骨雞活性肽和阿卡波糖有可能修復(fù)糖尿病小鼠胰腺損傷并恢復(fù)其胰島素水平。

圖1 烏骨雞活性肽對糖尿病小鼠胰腺的影響Fig.1 Effects of the bioactive peptides from black-bone chicken on pancreas of diabetic mice

2.5 烏骨雞活性肽對小鼠肝臟的影響

由圖2 可知：正常對照組小鼠的肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周呈輻射狀規(guī)則排列，而陽性對照組的小鼠肝細(xì)胞腫脹、條索狀結(jié)構(gòu)消失，存在空泡和纖維化，肝指數(shù)顯著升高（P=0.013）。低劑量組、高劑量組和藥物組的肝指數(shù)雖高于正常對照組，但低于陽性對照組；低劑量組、高劑量組和藥物組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，空泡和纖維化較少，表明烏骨雞活性肽和阿卡波糖對糖尿病小鼠肝臟具有保護(hù)作用。

圖2 烏骨雞活性肽對糖尿病小鼠肝臟的影響Fig.2 Effects of the bioactive peptides from black-bone chicken on the liver of diabetic mice

2.6 烏骨雞活性肽對小鼠腎臟的影響

由圖3可知：正常對照組小鼠的腎小球大小、形態(tài)正常，邊界清楚，而陽性對照組的腎小球腫大，腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞空泡化，且間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，病理變化較明顯，造成腎指數(shù)顯著高于低劑量組、高劑量組、藥物組和正常對照組（P=0.028、P=0.012、P=0.003 和P=0.000）。低劑量組、高劑量組以及藥物組的腎小球較腫大，存在淋巴細(xì)胞浸潤，但腎小管空泡化程度明顯輕于陽性對照組，腎指數(shù)與正常對照組相比無顯著差異，特別是高劑量組和藥物組表現(xiàn)更好，說明烏骨雞活性肽在一定程度上能緩解糖尿病小鼠的腎臟病變。

圖3 烏骨雞活性肽對糖尿病小鼠腎臟的影響Fig.3 Effects of the bioactive peptides from black-bone chicken on the kidney of diabetic mice

3 討論

STZ 是一種氨基葡萄糖?亞硝基脲化合物，結(jié)構(gòu)類似于葡萄糖，進(jìn)入體內(nèi)后被葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter 2,GLUT2）轉(zhuǎn)運(yùn)至胰腺組織，破壞β細(xì)胞以致胰島素分泌下降，從而誘發(fā)高血糖和“三多一少”，即多飲、多食、多尿和體質(zhì)量減輕等糖尿病癥狀[12]。本研究顯示，通過單劑量注射120 mg/kg STZ構(gòu)建的糖尿病模型小鼠，除表現(xiàn)這些典型臨床癥狀外，其胰腺細(xì)胞呈明顯病理形態(tài)，胰島面積減小且血清胰島素含量顯著降低。阿卡波糖是目前治療2型糖尿病的首選藥物，也可用于聯(lián)合治療1型糖尿病。有研究報道稱阿卡波糖能夠降低血糖深度并且提升胰島素水平，還有利于調(diào)節(jié)血脂，包括降低TG水平、改善HDL?C[13?15]。本研究發(fā)現(xiàn)，灌胃30 d 后，低、高劑量烏骨雞活性肽均能使糖尿病小鼠的空腹血糖水平有效降低，胰島素水平接近正常，體質(zhì)量恢復(fù)增加，特別是400 mg/kg高劑量烏骨雞活性肽的降糖效果與阿卡波糖相當(dāng)。同時，結(jié)合組織切片可以看出，降血糖效果應(yīng)與胰腺組織的損傷得到緩解、胰腺分泌胰島素的功能得到修復(fù)密切相關(guān)。

高脂血癥作為糖尿病的常見并發(fā)癥，是由血糖異常繼而誘發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂引起的，患者的血脂指標(biāo)TG、TC 和LDL?C 多數(shù)高于正常水平，還伴有HDL?C 水平降低[16]。降低血脂水平有利于改善糖尿病，從而減少心血管疾病等并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，400 mg/kg烏骨雞活性肽和阿卡波糖都能使糖尿病小鼠的TC、LDL?C 水平顯著降低，HDL?C 水平顯著升高，血脂趨向正常。同時，肝臟作為體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝的重要器官，其健康狀況與血脂指標(biāo)直接相關(guān)。從本研究的組織切片可知，糖尿病小鼠肝細(xì)胞腫脹，索狀結(jié)構(gòu)消失，炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致肝指數(shù)顯著升高，而服用一段時間的烏骨雞活性肽后，糖尿病小鼠的肝結(jié)構(gòu)趨向清晰，小葉空泡等病變情況明顯減少。

最近的研究指出，氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病眾多并發(fā)癥的重要原因，其產(chǎn)生的大量活性氧會導(dǎo)致細(xì)胞及組織損傷[18]。林霖等[19]、LIU等[20]進(jìn)行的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，烏骨雞活性肽具有清除多種自由基的能力。田穎剛等[21]在順鉑所致的小鼠腎損傷試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，烏骨雞活性肽明顯改善了抗腫瘤藥物順鉑導(dǎo)致的腎小管壞死，腎組織中抗氧化SOD活性增強(qiáng)而脂質(zhì)過氧化MDA 含量下降。本研究中，糖尿病模型小鼠的SOD活性顯著降低且MDA含量顯著升高，而灌服烏骨雞活性肽后，小鼠SOD 活性顯著回升，MDA 含量顯著下降；腎組織切片顯示，腎小球腫大、腎小管擴(kuò)張和空泡化等病變現(xiàn)象顯著減少，說明烏骨雞活性肽確有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠修復(fù)糖尿病帶來的各種組織器官損傷。

雖然本研究制備的烏骨雞活性肽分子量已經(jīng)小于5 kDa，但仍包含大量不同的肽段成分。例如：已有研究發(fā)現(xiàn)，烏骨雞比白膚雞富含更多的肌肽二肽[22]，而肌肽被證實(shí)對STZ糖尿病小鼠的血糖、體質(zhì)量以及胰腺組織會產(chǎn)生有益影響[23]；LIU 等通過純化烏骨雞活性肽得到一種五肽，具有比肌肽更強(qiáng)的抗氧化活性[20]。因此，有必要進(jìn)一步開展功能性肽段的分離與鑒定研究，以明確烏骨雞活性肽發(fā)揮抗糖尿病作用的主效成分。

4 結(jié)論

通過對糖尿病小鼠連續(xù)灌服30 d 烏骨雞活性肽（分子量小于5 kDa）發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的體質(zhì)量增加、空腹血糖水平下降，這充分證實(shí)了烏骨雞活性肽具有一定的抗糖尿病作用，同時還觀察到糖尿病小鼠的血脂下降、血清抗氧化水平升高以及胰腺、肝、腎組織形態(tài)得到改善及其器官指數(shù)降低，說明烏骨雞活性肽具有保護(hù)機(jī)體器官組織的功能。另外，對比發(fā)現(xiàn)400 mg/kg 劑量的烏骨雞活性肽效果優(yōu)于100 mg/kg 劑量。綜上所述，烏骨雞體內(nèi)富含的活性肽具有降血糖、降血脂、保護(hù)器官組織等多重生物保健功能，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。