吳佳琪 李為民 王怡棟 潘文勝

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例約103萬，死亡78萬[1]。我國是胃癌高發(fā)大國，國內(nèi)胃癌發(fā)病率僅次于肺癌[2]。由于胃癌早期癥狀的非特異性，患者確診時往往已是晚期，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。胃癌組織的分化程度與胃癌預(yù)后關(guān)系緊密，低分化胃癌較中高分化胃癌更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，同時伴隨預(yù)后不良[3]。而死于腫瘤的病例中，90%與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。因此，尋找抑制低分化胃癌細(xì)胞侵襲能力的分子標(biāo)志物，對于提高患者的生存率具有重要的意義。

干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5,IRF5）是干擾素調(diào)節(jié)因子家族的重要一員，過去研究表明IRF5不僅對病原體的防御與免疫細(xì)胞的分化方面起重要作用，同時也參與腫瘤形成及腫瘤細(xì)胞凋亡[5-6]。同時，研究表明IRF5在不同腫瘤細(xì)胞中可發(fā)揮抑制腫瘤或者促進(jìn)腫瘤的作用，提示IRF5功能的多樣性[7-8]。目前，IRF5在低分化胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其機制尚未完全闡明。過去研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞系中IRF5基因DNA區(qū)域高度甲基化，然而具體作用依然不清[9-10]。因此本研究探討IRF5對低分化胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響及其作用機制，為尋找低分化胃癌的治療靶點提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 實驗標(biāo)本 選取2019年12月至2020年7月杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院行胃鏡活檢及手術(shù)且經(jīng)病理學(xué)檢查最終證實為低分化胃癌石蠟標(biāo)本5例以及正常胃黏膜組織石蠟標(biāo)本5例。本研究經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院科研倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號：2019（倫02）-HS-27。

1.2 細(xì)胞及主要試劑 人低分化胃癌細(xì)胞株BGC-823和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1由本課題組保存。兔源IRF5抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體均購自美國abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記GAPDH抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體、嘌呤霉素、RIPA裂解液均購自上海碧云天公司；BCA定量法試劑盒、脂質(zhì)體3000均購自美國ThermoFisher公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司；RPMI1640購自美國Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒均購自日本TAKARA公司；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室均購自美國Corning公司；慢病毒為載體的IRF5 shRNA、MMP-9過表達(dá)慢病毒液及空載病毒、IRF5空載質(zhì)粒及IRF5過表達(dá)質(zhì)粒、pGL3-basic質(zhì)粒及pGL3-MMP-9質(zhì)粒均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)于5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。取處對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞，分別加入稀釋后的IRF5 shRNA慢病毒液及空載病毒液，轉(zhuǎn)染24 h后棄含病毒液的舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)48～96 h后，采用2 μg/ml嘌呤霉素篩選，得到IRF5敲低的BGC-IRF5組及作為對照的BGC-NC組。BGC-IRF5組細(xì)胞加入MMP-9過表達(dá)慢病毒液，經(jīng)過轉(zhuǎn)染篩選得到MMP-9高表達(dá)的BGC-MMP-9 Over組細(xì)胞。

1.4 胃組織中IRF5和MMP-9相對表達(dá)水平檢測 采用免疫組化法。低分化胃癌組織和正常胃黏膜組織標(biāo)本脫蠟后放入盛有檸檬酸的溶液中，隨后進(jìn)行高溫抗原修復(fù)。3%過氧化氫進(jìn)行室溫避光孵育10 min，PBS洗3次后正常山羊血清封閉1 h。除去血清后，每張玻片加IRF5或MMP-9一抗，4℃孵育過夜。PBS洗3次后加羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。新鮮配制的DAB溶液顯色5 min，自來水水洗4 min終止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核3～5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。各個樣本在高倍顯微鏡（400倍）下隨機拍攝3張，使用Image-Pro Plus 6.0分析平均光密度，以正常組織為對照計算相對表達(dá)水平。

1.5 IRF5和MMP-9 mRNA相對表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法。采用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，PCR：95℃ 15 s、60℃ 60 s，共40個循環(huán)，溶解曲線：95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 30 s，擴增結(jié)果以 Ct值顯示。用2-ΔΔCt表示各組基因表達(dá)水平的倍比關(guān)系。每次實驗至少重復(fù)3次。

1.6 IRF5和MMP-9蛋白相對表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞內(nèi)的蛋白，對細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)裂解后離心，BCA法測定蛋白濃度。每孔加入20 μg蛋白樣品上樣以后，進(jìn)行SDSPAGE電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用5%脫脂奶粉 PBST常溫封閉 1 h，IRF5或 MMP-9一抗（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。加入二抗，室溫孵育1 h后，隨后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取條帶。以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白/GAPDH代表目的蛋白的相對表達(dá)水平，每次實驗至少重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測 在6孔板中接種BGCIRF5組和BGC-NC組5×105個細(xì)胞，接種的細(xì)胞在培養(yǎng)板里分布均勻。接種原則為過夜后融合率達(dá)到90%。用滅菌的100 μl槍頭在孔正中間畫1條直線，吸除培養(yǎng)基，并用PBS將懸浮的細(xì)胞除去。加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在0 h和24 h拍照記錄劃痕愈合程度，用Image J軟件分析，計算相對遷移水平。每次實驗至少重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞侵襲能力檢測 Matrigel基質(zhì)膠包被在Transwell小室底部膜的上室面，鋪制均勻平整，置于37℃孵箱使膠凝固。BGC-MMP-9 Over組、BGC-IRF5組和BGC-NC組細(xì)胞血清饑餓24 h后，消化重懸，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml。將200 μl懸液加入上室，在下室中加入約500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，吸棄上室液體，用PBS輕柔漂洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，用棉簽仔細(xì)擦凈膜上未遷移的細(xì)胞。下室加入濃度為5 μg/ml的DAPI溶液，避光染色 15～20 min，吸去DAPI溶液，加入PBS溶液，熒光顯微鏡下觀察計數(shù)，即為穿基底膜細(xì)胞數(shù)量。每次實驗至少重復(fù)3次。

1.9 IRF5對MMP-9相對表達(dá)水平的調(diào)控 采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測。在24孔板中接種5×105個293T細(xì)胞，在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用脂質(zhì)體3000分別共轉(zhuǎn)染：IRF5空載質(zhì)粒＋pGL3-空載質(zhì)粒，IRF5空載質(zhì)粒＋pGL3-MMP-9質(zhì)粒，IRF5過表達(dá)質(zhì)粒＋pGL3-空載質(zhì)粒，IRF5過表達(dá)質(zhì)粒＋pGL3-MMP-9質(zhì)粒。48 h后獲取細(xì)胞，相對熒光素酶活性檢測使用Dual-Luciferase Reporter Assay System，操作按說明書使用。20 μl細(xì)胞裂解液加入至100 μl LARⅡ，檢測發(fā)光讀數(shù)，隨后加入100 μl終止液體，再次讀數(shù)。每次實驗至少重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低分化胃癌組織及正常胃黏膜組織IRF5與MMP-9相對表達(dá)水平比較 低分化胃癌組織中IRF5與MMP-9相對表達(dá)水平均明顯高于正常胃黏膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1（插頁）和表1。

表1 低分化胃癌組織和正常胃黏膜組織IRF5與MMP-9相對表達(dá)水平比較

圖1 低分化胃癌組織和正常胃黏膜組織IRF5與MMP-9免疫組化檢測所見（×400）

2.2 BGC-IRF5組、BGC-NC組和 GES-1組 IRF5 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平比較 BGC-NC組IRF5 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平均明顯高于BGC-IRF5組和GES-1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2和表2。

表2 3組細(xì)胞IRF5 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平比較

圖2 3組細(xì)胞IRF5蛋白表達(dá)的電泳圖

2.3 BGC-IRF5組和BGC-NC組相對遷移水平比較 BGC-IRF5組及BGC-NC組相對遷移水平分別為0.59±0.12和1.08±0.14，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3。

圖3 兩組細(xì)胞相對遷移水平劃痕圖

2.4 BGC-MMP-9 Over組、BGC-IRF5組和BGC-NC組MMP-9 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平、穿基底膜細(xì)胞數(shù)量比較 BGC-IRF5組較BGC-MMP-9 Over組和BGC-NC組MMP-9 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平均明顯下降，穿基底膜細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖4，圖5（插頁）和表3。

表3 3組MMP-9 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平、穿基底膜細(xì)胞數(shù)量比較

圖4 3組細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的電泳圖

圖5 3組細(xì)胞穿基底膜細(xì)胞數(shù)量比較（×400）

2.5 4種質(zhì)粒相對熒光素酶活性比較 IRF5過表達(dá)質(zhì)粒+pGL3-MMP-9質(zhì)粒較IRF5空載質(zhì)粒+pGL3-空載質(zhì)粒、IRF5空載質(zhì)粒+pGL3-MMP-9質(zhì)粒和IRF5過表達(dá)質(zhì)粒+pGL3-空載質(zhì)粒相對熒光素酶活性均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表4。

表4 4種質(zhì)粒相對熒光素酶活性比較

3 討論

轉(zhuǎn)移和侵襲是晚期胃癌最主要的特征，是導(dǎo)致患者胃癌復(fù)發(fā)和死亡的主要原因，其中低分化胃癌又是最容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的病理類型之一。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段和多因素參與的復(fù)雜過程[11]。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力增強是引起腫瘤轉(zhuǎn)移的重要作用機制，其中諸多分子相互協(xié)調(diào)，共同參與該過程[12]。因此從分子層面研究胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生的過程，尋找相關(guān)分子，有助于尋找潛在藥物干預(yù)靶點，改善胃癌患者預(yù)后。

研究表明IRF5在調(diào)節(jié)先天免疫和腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲方面起到至關(guān)重要的作用[5-6]。通過依賴或者非依賴p53途徑，IRF5可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[7，13]。此外，還有研究指出IRF5參與TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[7，13]。在病毒相關(guān)的腫瘤發(fā)生中，IRF5可以抑制病毒復(fù)制，減少腫瘤發(fā)生[8，15]。然而，Massimino 等[16]發(fā)現(xiàn)IRF5在甲狀腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著增高，且IRF5異常增高可以增加甲狀腺癌細(xì)胞的增殖能力，提示IRF5可能參與促進(jìn)腫瘤的作用。上述研究結(jié)果提示IRF5在不同腫瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮不同的作用。還有研究指出與正常乳腺組織及乳腺細(xì)胞相比，人乳腺腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中IRF5表達(dá)水平降低明顯，當(dāng)乳腺腫瘤細(xì)胞過表達(dá)IRF5后，其增殖及遷移能力會受到部分抑制，該機制研究表明此效應(yīng)可能跟調(diào)控CXCR4表達(dá)水平相關(guān)[17]。本研究首次探討了IRF5在低分化胃癌中的作用，結(jié)果表明在低分化胃癌細(xì)胞BGC-823中，敲低IRF5可降低胃癌細(xì)胞的侵襲能力，提示IRF5可能促進(jìn)低分化胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。由此可見，IRF5在低分化胃癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，與低分化胃癌的發(fā)展關(guān)系密切。

IRF5影響低分化胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的具體分子機制目前仍不清楚。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解和基底膜破壞是首要條件，而MMP家族在該過程中扮演重要的角色[12]。研究表明MMP-9在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，人胃癌組織中MMP-9相對表達(dá)水平顯著高于周圍相鄰健康組織，且低分化胃癌中MMP-9相對表達(dá)水平高于高分化組織[18]。同時，MMP-9相對表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)[18-19]。MMP-9還參與HER2、HOXC6等上游分子調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移過程[20-21]。本研究結(jié)果提示，下調(diào)IRF5可以降低低分化胃癌細(xì)胞的MMP-9相對表達(dá)水平，由此推測，IRF5可能通過調(diào)控MMP-9相對表達(dá)水平，破壞胃癌的基底膜，促進(jìn)低分化胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。IRF5與MMP的調(diào)控機制目前尚未詳細(xì)闡明。在急性心肌梗死組織中，下調(diào)IRF5可顯著降低組織中MMP-9相對表達(dá)水平[22]。該結(jié)論與本研究團(tuán)隊在BGC-823細(xì)胞中得到的結(jié)論一致。此外，有研究指出在人原代軟骨細(xì)胞中IRF5可以調(diào)控MMP-3相對表達(dá)水平，具體分子機制可能是IRF5直接結(jié)合MMP-3啟動子區(qū)域和與NF-κB分子協(xié)同調(diào)節(jié)MMP-3相關(guān)[23]。上述研究結(jié)果均提示IRF5可能通過多種機制調(diào)節(jié)MMP-9相對表達(dá)水平。本研究結(jié)果提示IRF5可通過直接結(jié)合MMP-9啟動子區(qū)域，發(fā)揮對MMP-9啟動子區(qū)域的調(diào)節(jié)，繼而影響MMP-9相對表達(dá)水平。

綜上所述，IRF5可以促進(jìn)低分化胃癌的侵襲和遷移，該效應(yīng)可能通過調(diào)控MMP-9來完成。本研究為降低低分化胃癌侵襲能力提供了新的治療靶點。在未來的研究中，本團(tuán)隊將在動物水平進(jìn)一步論證，充分探討IRF5在低分化胃癌遷移和侵襲中的功能及機制。