呂心路，曹磊，顧潔，陸敏丹，項(xiàng)曉麗，張志成，成翠娥，陸芬英，蔣廷旺

(1.太倉市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇太倉215400；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫研究所，江蘇蘇州 215006；3.常熟市第二人民醫(yī)院a.重點(diǎn)專科實(shí)驗(yàn)室，b.眼科，c.消化科，江蘇常熟215500；4.常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇常熟215501)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確的自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)[1]，以自身免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)中小膽管的破壞損傷、肝臟門靜脈管道的淋巴細(xì)胞浸潤為主要特征[2]。PBC多發(fā)于中老年女性(40～60歲)[3-4]。血清學(xué)主要表現(xiàn)為堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase，GGT)異常特異性升高，自身免疫性抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA)或特異性抗核抗體(anti-GP210、anti-SP100)、抗早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein, PML)抗體陽性[5-8]。PBC發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能是遺傳易感性和環(huán)境觸發(fā)等多因素共同作用引起自身免疫功能紊亂，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞特異性攻擊膽管上皮細(xì)胞[9]。目前對PBC進(jìn)展到晚期的患者尚無良好的治療方案，因此，早期判斷患者疾病嚴(yán)重程度與預(yù)后對控制PBC具有重要臨床價值。

B7-H3屬于B7蛋白超家族成員，是一種新的腫瘤標(biāo)志物，其可在肝癌、膽管癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)，參與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[10-12]。同時，B7-H3在免疫系統(tǒng)中可通過抑制T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞功能影響免疫調(diào)控過程，可能是治療自身免疫病的潛在重要靶點(diǎn)。PBC發(fā)病過程中肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞是主要的受累細(xì)胞，盡管確切的損傷機(jī)制仍不明確，但B7-H3在膽管上皮細(xì)胞中高表達(dá)[13]，考慮到可溶性B7-H3(sB7-H3)在腫瘤和自身免疫病診斷中的重要性，本研究旨在探討sB7-H3在PBC患者預(yù)后判斷中的作用及其臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2021年2月至2021年6月常熟市第二人民醫(yī)院收治的37例PBC初診患者，其中，女性患者30例，年齡40～87歲，平均62歲；男性患者7例，年齡38～72歲，平均60歲。另收集同期體檢健康者(對照組)50例，其中，女性35人，年齡47～78歲，平均63歲；男性15人，年齡34～71歲，平均57歲。兩組間性別構(gòu)成比、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PBC診斷要點(diǎn)[14-15]：同時具備下列3條中的2條者可診斷為PBC，(1)血清ALP、GGT升高；(2)免疫熒光法AMA≥1∶40或者ELISA法AMA呈陽性；(3)肝活檢組織病理學(xué)顯示典型的肉芽腫性膽管炎、匯管區(qū)淋巴細(xì)胞聚集、小葉間膽管破壞、數(shù)目減少，細(xì)小膽管增生，可伴有纖維化和肝硬化。所有入組患者排除合并乙肝、丙肝等感染性肝炎，細(xì)菌感染，其他自身免疫病等。所有研究對象均簽署知情同意書，并取得常熟市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(CSEY 20200025)。

1.2患者M(jìn)ayo評分體系 Mayo自然史模型被廣泛用作估計PBC患者預(yù)后的工具，為了以評分的格式構(gòu)建一個簡短的風(fēng)險評分，為每個變量確定1～3個臨界值標(biāo)準(zhǔn)：年齡<38為0分，38～62歲為1分，≥63歲為2分；膽紅素<17.1 μmol/L為0分，17.1～29.1 μmol/L為1分，29.1～109.4 μmol/L為2分，>109.4 μmol/L為3分；清蛋白>4.1 g/dL為0分，2.8～4.1 g/dL為1分，<2.8 g/dL為2分；凝血酶原時間正常為1分，有延長為2分；無水腫為0分，有水腫為1分。PBC患者M(jìn)ayo評分標(biāo)準(zhǔn)按以下公式進(jìn)行：R=0.871×loge[0.058×膽紅素(μmol/L)]-2.53×loge[0.01×清蛋白(g/dL)]+0.039×年齡+2.38×loge[凝血酶原時間(s)]+0.859×水腫積分[16]。

1.3試劑及儀器 人源白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)試劑(中國和銳公司)，免疫印跡法抗核抗體譜檢測試劑(德國歐蒙公司)，多重微珠流式熒光抗核抗體譜檢測試劑(美國宙斯科技公司)，人sB7-H3檢測試劑(蘇州旭光科星抗體生物科技有限公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、GGT檢測試劑(日本世諾公司)，總膽紅素(total bilirubin, T-Bil)檢測試劑(中國伊普諾康公司)，ALP檢測試劑(中國九強(qiáng)公司)。生化試劑均有對應(yīng)的校準(zhǔn)品。全自動生化免疫分析儀(德國西門子公司)，酶聯(lián)儀(美國賽默飛公司)。

1.4血清標(biāo)本采集 清晨空腹采集5 mL外周靜脈血，3 000 r/min離心10 min，收集上層血清并分裝，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.5ELISA檢測血清sB7-H3和IL-6濃度 用雙抗體夾心ELISA法檢測人血清sB7-H3和IL-6濃度，均按照試劑盒說明書進(jìn)行。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對應(yīng)的吸光值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本sB7-H3和IL-6濃度。

1.6血清自身抗體和肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測 血清自身抗體anti-GP210和anti-SP100采用多重微球流式熒光法和免疫印跡法檢測，用速率法檢測ALT、AST和GGT，NPP底物-AMP緩沖液法檢測ALP，氧化法測定T-Bil。

2 結(jié)果

2.1自身抗體及肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果 與健康人對照組比較，PBC組血清肝功能指標(biāo)ALP、GGT、AST、ALT、T-Bil水平均顯著性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。Mayo評分≥5的PBC患者21例，<5的PBC患者16例。所有PBC患者AMA均為陽性，抗核抗體anti-GP210陽性15例，anti-SP100陽性6例。

表1 對照組及實(shí)驗(yàn)組臨床基本信息

2.2PBC與對照組血清sB7-H3和IL-6水平比較 與健康人對照組相比，PBC患者血清sB7-H3水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(4 218±166.0) pg/mL vs (5 467±227.3) pg/mL，t=4.548，P<0.000 1]。PBC患者血清IL-6水平也較健康人對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(10.88±0.240) U/L vs (11.96±0.296) U/L，t=2.847，P=0.005 5]。

2.3血清sB7-H3和IL-6與PBC各預(yù)后相關(guān)標(biāo)志之間的關(guān)系 PBC組Mayo評分≥5和Mayo評分<5患者的血清sB7-H3、IL-6濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.750，P=0.000 6；t=2.511，P=0.016 8)。PBC組anti-GP210陽性和陰性患者的血清sB7-H3濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.440，P=0.001 5)，而兩組間血清IL-6濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.569，P=0.125 6)。PBC組anti-SP100陽性和陰性組患者血清sB7-H3濃度、血清IL-6濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.923，P=0.062 6；t=1.333，P=0.191 1)。見表2。

2.4PBC患者血清sB7-H3、IL6與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 血清sB7-H3的濃度與ALT(r=0.433，P=0.039)、AST(r=0.579，P=0.005)、ALP(r=0.417，P=0.043)、T-Bil(r=0.648，P=0.001)呈正相關(guān)關(guān)系，而血清IL-6的濃度也與ALT(r=0.540，P=0.006)、AST(r=0.431，P=0.045)、ALP(r=0.506，P=0.012)、T-Bil(r=0.593，P=0.004)呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 不同組別血清中sB7-H3、IL-6水平比較

3 討論

IL-6為炎癥疾病的血清標(biāo)志物，屬于Th2型細(xì)胞因子，可參與調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，在很多自身免疫病中也具有重要的臨床意義[17]。PBC患者外周血IL-6水平可在治療第3個月時出現(xiàn)顯著下降，故本研究將IL-6的活性作為PBC患者重要的臨床標(biāo)志之一作為對比。本研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者血清中sB7-H3、IL-6含量顯著性升高，與健康人對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將sB7-H3和IL-6與PBC患者肝功能指標(biāo)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，均與ALT、AST、ALP和T-Bil顯著相關(guān)，這提示著sB7-H3和IL-6可能與肝臟病變的進(jìn)展存在相關(guān)性。

Mayo評分是判定PBC患者疾病嚴(yán)重程度以及預(yù)后好壞的重要指標(biāo)，Mayo評分高的患者預(yù)后較差，因此本研究選擇Mayo評分的中位數(shù)整數(shù)值作為患者分層的cut-off值，可以看出sB7-H3在Mayo評分高低的不同患者群展現(xiàn)出顯著的表達(dá)水平差異，而IL-6雖也有差異，但區(qū)分度明顯不及sB7-H3。

anti-SP100和anti-GP210是PBC 2個重要的特異性抗核抗體，盡管其對PBC具有高度特異性，但其預(yù)后價值一直存在爭議。本研究對sB7-H3與IL-6的血清學(xué)水平與這2個自身抗體之間的關(guān)系進(jìn)行初步探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，anti-GP210陽性組的sB7-H3水平較陰性組顯著升高，但anti-SP100陽性組的sB7-H3水平較陰性組有明顯增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因很可能是由于anti-SP100陽性組入組患者過少導(dǎo)致；anti-GP210和anti-SP100陽性組的IL-6水平與陰性組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明相比于IL-6，sB7-H3對于PBC的臨床預(yù)后可能存在一定的相關(guān)性。

綜上所述，PBC患者中sB7-H3濃度顯著高于對照患者，sB7-H3與Mayo評分、自身抗體anti-GP210以及患者肝功能指標(biāo)存在顯著的相關(guān)性。提示sB7-H3在PBC患者的預(yù)后評價中具有潛在的臨床應(yīng)用價值。