孟慶昊,楊斯桀,高選

(1.山東大學生殖醫(yī)學研究中心(山東大學附屬生殖醫(yī)院)，濟南250002；2.國家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心，濟南250002)

精液常規(guī)分析是了解男性生育力最基本的重要檢測技術(shù)，是男科實驗室和輔助生殖實驗室最常規(guī)的檢測項目，而精子濃度和前向運動精子百分率是其中的重要指標。人工分析由于效率低、受技術(shù)員主觀判斷的影響大，現(xiàn)已逐漸被計算機輔助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)取代。CASA系統(tǒng)通過攝像機與顯微鏡連接，跟蹤和確定單個精子的活動，根據(jù)設(shè)定精子運動的位移、精子大小和灰度及精子運動的有關(guān)參數(shù)，對采集到的圖像進行動態(tài)處理分析[1]。對于精子濃度高的標本，精子間重疊嚴重，會導(dǎo)致拍攝的精子濃度低于實際濃度。同時，精子之間距離過近，發(fā)生碰撞的概率增大，導(dǎo)致前向運動精子百分率假性增高。此外，精子濃度過高或者速率過大也會導(dǎo)致軌跡跟蹤出錯，錯配概率增大，導(dǎo)致運動精子百分率升高[2]。生理鹽水易于獲得、可以維持精子內(nèi)外滲透壓和電解質(zhì)平衡，因此實驗室實際操作中通常對高濃度精液標本采用生理鹽水稀釋，但其對CASA的檢測結(jié)果影響報道較少。本研究探討以生理鹽水稀釋高濃度精液標本，采用CASA方法檢測對精子濃度、前向運動精子百分率的影響。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取2020年9月至2020年12月于山東大學附屬生殖醫(yī)院進行精液常規(guī)檢查的精子濃度>100×106/mL的門診患者精液標本118例，排除以下情況標本：①黏稠精液；②白細胞精液癥；③鏡下可見紅細胞；④禁欲時間<2 d或>7 d。

1.2標本采集及精液分析 囑患者禁欲2～7 d，手淫法取精，將全部精液收集于清潔、干燥的精液采集器(深圳博銳德公司)內(nèi)，于30 min內(nèi)37 ℃保存送至實驗室，將精液置于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)液化。采用乳膠質(zhì)控珠進行精子濃度的室內(nèi)質(zhì)控，實驗期間每日室內(nèi)質(zhì)控均在控，2個濃度水平的變異系數(shù)分別為4.01%、3.76%。參加廣東省精子庫2020年度室間質(zhì)評，精子濃度與活動力的室間質(zhì)評成績均為100%。待精液液化后用一次性吸管將精液充分混勻，用移液器取7 μL充池(一次性精液分析玻片，20 μm，廣東友寧公司)。該批次的一次性精液分析玻片進行了質(zhì)量驗證，滿足質(zhì)量要求。采用SCA-H-01精子分析儀(西班牙Microptic公司)對精液進行計算機輔助常規(guī)分析，檢測精子濃度、前向運動精子百分率等精液常規(guī)參數(shù)。

標本液化后30 min內(nèi)用生理鹽水進行1∶1、1∶3、1∶7稀釋并分析；8 000×g、5 min進行離心后，精漿中精子數(shù)為0～1個/HP，可以避免殘留精子對稀釋結(jié)果的影響；從118例標本中選取標本量充足的100例標本，取1 mL標本離心(8 000×g，5 min)取精漿，加做自身精漿1∶3稀釋對照。標本稀釋后10 min內(nèi)完成精子濃度及前向運動精子百分率分析，每份標本至少拍攝200個精子，記錄精子濃度及前向運動精子百分率。

2 結(jié)果

2.1不同比例生理鹽水稀釋后的CASA檢測結(jié)果 通過CASA，以生理鹽水1∶1、1∶3、1∶7稀釋后的精子濃度值隨稀釋比例的增高逐漸增高，均高于以精液原液直接檢測的濃度值，1∶1與原液、1∶3與1∶1比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；1∶7與1∶3比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；以生理鹽水1∶1、1∶3、1∶7稀釋后的前向運動精子百分率隨稀釋比例的增高逐漸降低，均低于精液原液直接檢測的前向運動精子百分率，1∶1與原液、1∶3與1∶1比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；1∶7與1∶3比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 精液原液與生理鹽水1∶1、1∶3、1∶7稀釋后精子濃度、前向運動精子百分率的比較(n=118)

2.2生理鹽水與自身精漿在1∶3稀釋比例下的CASA檢測結(jié)果 通過CASA，生理鹽水1∶3稀釋的精子濃度高于自身精漿1∶3稀釋的精子濃度(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；生理鹽水1∶3稀釋的前向運動精子百分率低于自身精漿1∶3稀釋的前向運動精子百分率(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 生理鹽水與自身精漿稀釋后精子濃度與前向運動精子百分率的比較

3 討論

雖然精液常規(guī)分析在檢驗醫(yī)學中的開展時間很長，但目前仍無標準化的質(zhì)量控制體系及行業(yè)標準，而精子濃度和前向運動精子百分率作為精液分析中最主要的指標，檢測結(jié)果對于男科醫(yī)生診斷不育癥至關(guān)重要。由于精子濃度的生物變異很大，故對于不同濃度水平標本應(yīng)采取不同處理方式，WHO明確要求對于高濃度精液標本要進行稀釋檢測[3]。

胡凱等[4]認為高濃度精液標本以生理鹽水、精漿作為稀釋液時，在一定稀釋濃度下，不會對精子濃度、前向運動精子百分率造成影響。本研究采用生理鹽水稀釋，發(fā)現(xiàn)稀釋檢測的精子原液濃度隨稀釋倍數(shù)的增加而增加，該結(jié)論與葉明桃等[5]研究不一致。分析當精子濃度高時，精子間存在相互重疊，部分被重疊的精子CASA軟件無法識別，導(dǎo)致檢測的精子濃度低于實際的精子濃度。隨著稀釋倍數(shù)增加，每個視野中的精子數(shù)減少，精子間重疊現(xiàn)象減少，所計算出的精子濃度更接近真實濃度。本研究發(fā)現(xiàn)對于濃度大于100×106/mL的精液標本，生理鹽水1∶3稀釋和1∶7稀釋后精子濃度間的差異無統(tǒng)計學意義。研究表明精子濃度在(20～50)×106/mL時人工常規(guī)精液分析(SRA)和CASA法測定結(jié)果無差異[1，6-10]，因此建議對于濃度>100×106/mL的高濃度精液標本選擇1∶3的稀釋比例，旨在控制稀釋的精子濃度在(20～50)×106/mL的范圍內(nèi)，使結(jié)果更接近真值。

本研究還發(fā)現(xiàn)用生理鹽水稀釋高濃度精液標本，隨稀釋倍數(shù)的增加所檢測出的前向運動精子百分率會降低，與葉明桃、謝杏儀等[5，11]同樣使用生理鹽水稀釋高濃度精液的研究結(jié)論不一致。當精子濃度偏高時，精子之間距離過近，發(fā)生碰撞的概率增大，部分沒有活動能力的精子也被撞動，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高[2]。隨著稀釋倍數(shù)的增加，精子發(fā)生碰撞的概率不斷減小，稀釋后前向運動精子百分率的檢測數(shù)據(jù)便會降低。因此，本實驗顯示高濃度精液在不稀釋的情況下檢測的前向運動精子百分率結(jié)果偏高，同時也發(fā)現(xiàn)，生理鹽水1∶3稀釋和1∶7稀釋后精子前向運動精子百分率間的差異無統(tǒng)計學意義，因此，作為輔助生殖技術(shù)方式選擇的輔助指標，建議1∶3比例稀釋后檢測前向運動精子百分率。

在1∶3稀釋比例下以自身精漿稀釋的對照實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水與自身精漿稀釋的高濃度精液標本的CASA結(jié)果也有統(tǒng)計學差異，采用生理鹽水稀釋的精子濃度值明顯高于自身精漿稀釋，而生理鹽水稀釋的運動精子百分率明顯低于自身精漿稀釋，與葉明桃、Parker等[5，12]研究的結(jié)論不一致；推測因為精漿中存在果糖等物質(zhì)可維持精子的運動，正常精液分離出的精漿可刺激弱精子癥患者的精子，使活動力低下精子提高活力，未脫離精漿的精子可從精漿中獲得營養(yǎng)物質(zhì)以支持能量代謝及運動[13]，而生理鹽水只含有維持滲透壓和電解質(zhì)平衡的鹽離子，其特性會使非黏稠的高濃度精液的CASA結(jié)果有偏差，因此，若精液量充足，用精漿稀釋精液后進行CASA 測定可減少誤差,使結(jié)果更準確,更能反映就診患者的真實情況[6]。

本研究還存在一定局限性，對于弱精子癥的患者，稀釋后對結(jié)果的影響還需要進一步探索。另外，可以進一步分析不同深度的計數(shù)池和不同廠家的計數(shù)池是否也得出類似的結(jié)論。

綜上所述，對于已液化的高濃度精液標本，精漿仍是最優(yōu)的稀釋液。對于高濃度、精液量不足的精液標本，可用生理鹽水替代精漿進行稀釋，但應(yīng)注明以便臨床醫(yī)生更好地判斷實際情況。