周悅玲，李允武，朱秋毓，丁峰，王文姬

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 a.腎臟內(nèi)科，b.藥劑科，上海200011)

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，大量研究顯示該疾病患病率近年來呈上升趨勢，復(fù)發(fā)率亦較高[1]。尿液中存在多種與腎結(jié)石形成相關(guān)的代謝物質(zhì)，如鈣、草酸、枸櫞酸等，這些影響腎結(jié)石形成的促進因子與抑制因子在不同濃度和酸堿度下相互作用，決定著腎結(jié)石的發(fā)生及腎結(jié)石成分的多樣性，其中草酸鈣(calcium oxalate，CaOx)和磷酸鈣(calcium phosphate，CaP)是最常見的腎結(jié)石類型，磷酸鈣結(jié)石又主要分為透鈣磷石(brushite，Bru)和羥磷灰石(hydroxyapatite，HAP)[2]。腎結(jié)石的代謝評估是診治的重要環(huán)節(jié)，24 h尿液成分分析為評估患者代謝特征提供了較為全面的信息，多項國際指南均推薦將24 h尿液成分分析作為腎結(jié)石代謝評估的首要檢查[3-5]。研究人員利用化學(xué)熱力學(xué)和動力學(xué)模型對24 h尿液各項成分行進一步分析，建立了一系列方法對常見腎結(jié)石成分在尿液中的相對過飽和水平進行定量評估，該指標可直接反映尿液中各種晶體的形成風險，對腎結(jié)石患者的診斷及治療具有重要的臨床價值。

評估尿液相對過飽和水平的常用方法主要包括活度積比(activity product ratio)公式及EQUIL2、JESS(Joint Expert Speciation System)和Lithorisk等軟件方法[6-10]，其中活度積比和EQUIL2 2種方法因其經(jīng)濟、便捷等特點在國外應(yīng)用較廣。上述方法均基于國外人群背景建立，由于我國人群相較存在較大遺傳和代謝差異，且我國目前對腎結(jié)石患者尿液相對過飽和水平的研究較少，故上述方法在我國人群中應(yīng)用的一致性有待驗證。此外，不同評估方法所得結(jié)果存在數(shù)值差異，無法直接進行比較，不利于臨床隨訪監(jiān)測，因此建立常用方法結(jié)果間函數(shù)關(guān)系的回歸模型十分必要。本研究通過對本中心99例腎結(jié)石患者的相關(guān)資料進行回顧性分析，采用活度積比和EQUIL2法計算草酸鈣和磷酸鈣等常見成分在尿液中的相對過飽和水平，對上述方法所得結(jié)果的相關(guān)性和一致性進行驗證，為2種方法結(jié)果間的轉(zhuǎn)換提供參考依據(jù)，對評價腎結(jié)石患者尿液中含鈣晶體的形成風險具有一定應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2015年9月至2020年9月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院就診的腎結(jié)石患者99例。納入標準：①臨床明確診斷為腎結(jié)石患者；②年齡≥18歲；③有完善的24 h尿液成分分析結(jié)果且同一項目檢驗方法一致；④既往無腎結(jié)石藥物治療史。排除標準：①24 h尿液分析前3個月內(nèi)有明確泌尿系梗阻、泌尿系感染、急性腎損傷、泌尿系結(jié)石手術(shù)史；②存在消化道出血、腹瀉、惡性腫瘤等急慢性疾病。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(倫理批件號：SH9H-2020-MT12-1)。

1.2資料收集

1.2.1一般資料收集 回顧性收集患者一般人口學(xué)信息和既往病史，包括性別、年齡、出生日期、泌尿系結(jié)石相關(guān)病史，所有入選患者均無腎臟病史及泌尿系結(jié)石家族史。

1.2.2實驗室資料收集 回顧性收集患者24 h尿液成分分析資料，包括24 h尿液量、pH及尿液尿素、肌酐、尿酸、鈉、鉀、氯、鈣、磷、鎂、草酸、枸櫞酸等。

1.3主要儀器及試劑 DxC800全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，PHS-3C型pH計(上海儀電科學(xué)儀器公司)，e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，離子排阻色譜柱(RezexTM ROA-Organic Acid，250 mm×4.6 mm，美國Phenomenex公司)。

肌酐試劑盒(酶法)、尿素試劑盒(酶法)、尿酸試劑盒(酶法)及鈉、鉀、氯、鈣、磷、鎂試劑盒(間接離子選擇電極法)均購自美國貝克曼庫爾特公司，草酸、枸櫞酸試劑盒(高效液相色譜法)購自美國Waters公司。以上各項檢測項目均采用相應(yīng)配套校準品進行校準，所有樣本檢測室內(nèi)質(zhì)控均在控，所有檢測項目在上海市臨床檢驗中心定期室間質(zhì)評中表現(xiàn)良好。

1.4標本采集與處理 為患者提供統(tǒng)一的尿液收集桶(刻度精確至1 mL)，告知24 h尿液標本留取方法，于早晨7時起床排空膀胱后開始收集之后24 h內(nèi)的全部尿液標本，所有尿液不添加防腐劑。計量24 h尿液總量，標本混勻后取10 mL用于pH測定，另取10 mL進行分裝，-80 ℃凍存，標明患者編號、采集時間和尿液量，以備后續(xù)生化檢測。

1.5尿液標本檢測 新鮮的24 h尿液標本混勻后取10 mL，即刻采用PHS-3C型pH計測定尿液pH。其余檢測項目在檢測前先將尿液凍存標本恢復(fù)至室溫，2 500×g離心10 min后采用DxC800全自動生化分析儀和高效液相色譜儀測定尿液肌酐、尿素、尿酸、鈉、鉀、氯、鈣、磷、鎂、草酸、枸櫞酸等項目。測定尿液尿酸前需對樣本進行氫氧化鈉堿化處理，測定尿液草酸、枸櫞酸前需對樣本進行鹽酸酸化處理。

1.6尿液草酸鈣和磷酸鈣相對過飽和水平計算 應(yīng)用活度積比公式計算24 h尿液中草酸鈣活度積比[AP(CaOx) index EQ]、磷酸鈣活度積比[AP(CaP) index]、透鈣磷石活度積比[AP(Bru) index]和羥磷灰石活度積比[-lgAP(HAP) index][6-7]。用EQUIL2軟件計算24 h尿液中草酸鈣、透鈣磷石、羥磷灰石的相對過飽和水平(supersaturation，SS)和晶體自由能變化(delta Gibbs free energy，DG)[8]。本中心暫未建立尿硫酸鹽水平檢測方法，既往研究支持在無尿硫酸鹽結(jié)果的情況時可使用固定數(shù)值替代，結(jié)合多項研究的尿硫酸鹽參考區(qū)間及JESS軟件尿硫酸鹽默認值，確定以24 h尿硫酸鹽排泄量12 mmol/24 h計算尿硫酸鹽濃度代入EQUIL2軟件進行計算[11-14]?；疃确e比與EQUIL2方法關(guān)于尿液相對過飽和水平的評價指標及計算方法見表1。

表1 活度積比與EQUIL2方法關(guān)于尿液相對過飽和水平的評價指標及計算方法

2 結(jié)果

2.1研究對象臨床資料特征 本研究共納入99例腎結(jié)石患者，其中男性53例，女性46例。患者年齡分布如下：30歲以下14例，30～39歲10例，40～49歲16例，50～59歲28例，60～69歲21例，70歲及以上10例。48例(48.5%)患者24 h尿量低于泌尿系結(jié)石國際指南所推薦的2 500 mL/24 h[3-5]，24例(24.2%)患者尿鈉高于正常上限，29例(29.3%)患者存在高鈣尿癥，9例(9.1%)患者存在高尿酸尿癥，47例(47.5%)患者存在高草酸尿癥，14例(14.1%)患者存在低枸櫞酸尿癥。進一步對尿液中草酸鈣和磷酸鈣的相對過飽和水平分析發(fā)現(xiàn)，93例(93.9%)患者SSCaOx>1(或DGCaOx>0)，呈現(xiàn)出草酸鈣相對過飽和情況，其中10例(10.1%)患者AP(CaOx) index EQ>2.0(或DGCaOx>2.8)，提示草酸鈣晶體更易析出[15]；44例(44.4%)患者SSBru>1(或DGBru>0)，96例(97.0%)患者SSHAP>1(或DGHAP>0)，呈現(xiàn)出磷酸鈣相對過飽和情況。99例腎結(jié)石患者24 h尿液分析結(jié)果見表2。

2.2活度積比和EQUIL2相關(guān)指標間的關(guān)系 草酸鈣和磷酸鈣在尿液中的相對過飽和水平可直接反映尿液中草酸鈣和磷酸鈣晶體的形成風險。對活度積比和EQUIL2所得指標進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SSCaOx與AP(CaOx) index EQ的Spearman相關(guān)系數(shù)r為0.930(95%CI：0.896～0.953，P<0.001)，SSBru與AP(Bru) index的Spearman相關(guān)系數(shù)r為0.979(95%CI：0.969～0.986，P<0.001)，DGHAP與-lgAP(HAP) index的Pearson相關(guān)系數(shù)r為-0.968(95%CI：-0.979～-0.952，P<0.001)，提示2種方法在評估尿液中草酸鈣、透鈣磷石和羥磷灰石相對過飽和水平上均具有較強的相關(guān)性。進一步對各組指標進行線性回歸分析，以明確活度積比和EQUIL2法所得結(jié)果間的函數(shù)關(guān)系。結(jié)果顯示，SSCaOx與AP(CaOx) index EQ、SSBru與AP(Bru) index、DGHAP與-lgAP(HAP) index呈線性關(guān)系。在草酸鈣和羥磷灰石相對過飽和水平方面回歸模型擬合程度較高，而在透鈣磷石相對過飽和水平方面回歸模型擬合程度一般(表3，圖1)。

表3 活度積比和EQUIL2評估尿液中草酸鈣和磷酸鈣相對過飽和水平相關(guān)指標線性回歸模型

注：A，草酸鈣SSCaOx與AP(CaOx)index EQ線性回歸曲線；B，透鈣磷石SSBru與AP(Bru)index線性回歸曲線；C，羥磷灰石DGHAP與-lgAP(HAP) index線性回歸曲線。

2.3活度積比和EQUIL2法評估尿液中草酸鈣和磷酸鈣相對過飽和水平的一致性檢驗 對活度積比和EQUIL2評估尿液中草酸鈣和磷酸鈣相對過飽和水平進行Bland-Altman一致性檢驗。以2種方法測得值的均數(shù)為橫坐標，以2種方法測得值的差值為縱坐標，繪制散點圖，并以差值的均數(shù)±1.96倍標準差作出95%一致性界限(limits of agreement，LoA)。如圖2所示，SSCaOx與AP(CaOx) index EQ差值的95% LoA為-2.08～10.12；SSBru與AP(Bru) index差值的95% LoA為-8.27～4.20；DGHAP與-lgAP(HAP) index差值的95% LoA為-60.93～-35.94。Bland-Altman圖直觀顯示了2種方法所得結(jié)果的差值均主要分布于95% LoA內(nèi)，提示活度積比和EQUIL2在評估尿液草酸鈣和磷酸鈣相對過飽和水平上均具有較高的一致性。與此同時，也發(fā)現(xiàn)2種方法所得結(jié)果的差值隨均值成一定比例變化趨勢，提示2種方法所得數(shù)值存在一定差異，可根據(jù)回歸模型轉(zhuǎn)換后進行比較。

注：A，草酸鈣SSCaOx與AP(CaOx)index EQ指標一致性檢驗；B，透鈣磷石SSBru與AP(Bru)index指標一致性檢驗；C，羥磷灰石DGHAP與-lgAP(HAP) index指標一致性檢驗。

3 討論

腎結(jié)石的形成與尿液中多種因子的水平密切相關(guān)，各因子對晶體形成的影響不盡相同，因此根據(jù)各因子水平變化來預(yù)測腎結(jié)石形成風險較為困難。研究人員為解決這一難題提出了相對過飽和水平的概念，多項研究顯示草酸鈣、磷酸鈣、尿酸等腎結(jié)石常見成分在尿液中的相對過飽和水平與腎結(jié)石發(fā)生風險存在相關(guān)性，可用于預(yù)測腎結(jié)石的形成風險。Prochaska等[16]基于NHS Ⅰ、NHS Ⅱ、HPFS 3個大規(guī)模前瞻性研究隊列，開展了一項有關(guān)24 h尿液相對過飽和水平與腎結(jié)石形成風險間關(guān)系的橫斷面研究，各選取了數(shù)百名腎結(jié)石患者及非腎結(jié)石對照者的24 h尿液分析資料研究發(fā)現(xiàn)，尿液中草酸鈣和磷酸鈣的相對過飽和水平越高者患腎結(jié)石可能性越大，而尿酸相對過飽和水平越高的女性患腎結(jié)石的風險增高。Ferraro等[17]針對合并特發(fā)性高鈣尿癥的復(fù)發(fā)性腎結(jié)石患者研究發(fā)現(xiàn)，飲食干預(yù)1周后尿液草酸鈣相對過飽和水平的下降與腎結(jié)石復(fù)發(fā)風險降低相關(guān)。

活度積比、EQUIL2、JESS、Lithorisk等方法是目前用于評估常見腎結(jié)石成分的尿液相對過飽和水平的重要工具[6-10]，活度積比是基于實驗方法得出的計算公式，其他3種方法則是基于化學(xué)熱力學(xué)和動力學(xué)模型建立的計算機模擬軟件，由于JESS和Lithorisk是付費軟件，應(yīng)用范圍不及前兩者廣泛。上述分析方法均可用于評估草酸鈣和磷酸鈣在尿液中的相對過飽和水平，以預(yù)測尿液中草酸鈣和磷酸鈣晶體的形成風險。Tiselius等[6-7]利用各5項尿液指標建立了草酸鈣活度積比AP(CaOx) index和磷酸鈣活度積比AP(CaP) index計算公式，由于常見的磷酸鈣晶體包括透鈣磷石和羥磷灰石，故進一步推導(dǎo)出AP(Bru) index和-lgAP(HAP) index計算公式。EQUIL2通過對24 h尿液指標進行計算機模擬分析，得出尿液中草酸鈣、透鈣磷石、羥磷灰石、無水尿酸鹽、尿酸鈉的相對過飽和水平和晶體自由能變化，當某晶體成分SS>1或DG>0提示該成分呈過飽和狀態(tài)易于析出，反之則提示呈溶解狀態(tài)[8]。既往研究顯示，當AP(CaOx) index EQ>2.0或DGCaOx>2.8時，24 h尿液中可出現(xiàn)草酸鈣晶體析出[15]，而有關(guān)磷酸鈣晶體的研究數(shù)據(jù)尚不明確。

目前針對不同方法評估腎結(jié)石常見成分在尿液中相對過飽和水平的一致性研究仍較少，各方法所得結(jié)果暫無法直接進行比較，同時針對我國人口的研究數(shù)據(jù)較為缺乏，本研究可作為一定補充，為實現(xiàn)不同方法結(jié)果間的轉(zhuǎn)換提供了一定理論依據(jù)。本研究通過對99例腎結(jié)石患者的24 h尿液分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)患者存在草酸鈣相對過飽和情況，磷酸鈣中的羥磷灰石較透鈣磷石表現(xiàn)出更大比例的相對過飽和情況。活度積比和EQUIL2 2種方法在評估尿液草酸鈣和磷酸鈣相對過飽和水平上均通過了Bland-Altman一致性檢驗。相關(guān)和回歸分析則顯示了2種方法所得結(jié)果之間的函數(shù)關(guān)系，在草酸鈣和羥磷灰石的評估方面回歸模型擬合程度較高，而在透鈣磷石方面回歸模型擬合程度一般。Pak等[18-19]以實驗性方法測定活度積比作為基本對照，對JESS和EQUIL2 2種計算機軟件進行比較發(fā)現(xiàn)，JESS由于綜合考慮了多項可溶性化合物對晶體相對過飽和水平的影響，在評估草酸鈣相對過飽和水平方面優(yōu)于EQUIL2；此外，EQUIL2在評估透鈣磷石相對過飽和水平方面存在約80%的高估情況，JESS則相對更加準確，但在尿pH和尿鈣水平過高或過低時可能存在一定偏倚。Rodriguez等[20]對211例腎結(jié)石患者研究發(fā)現(xiàn)，4種方法在評估草酸鈣相對過飽和水平上具有高度相關(guān)性；在評估磷酸鈣相對過飽和水平方面除了AP(CaP) index相關(guān)性稍差以外，其他3種方法均具有高度相關(guān)性；在評估尿酸鹽相對過飽和水平上，3種計算機軟件均表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。此外，研究人員還對現(xiàn)有預(yù)測方法不斷進行優(yōu)化和創(chuàng)新。建立了JESS方法的學(xué)者提出，腎單位中液體所含有的各種物質(zhì)的過飽和水平或許較尿液更能反映腎結(jié)石的形成風險，但前者無法直接測定，因此研究人員利用計算機模擬生理過程，對血液和尿液成分進行綜合分析，計算出腎單位中液體的物質(zhì)水平，以預(yù)測成核和晶體形成風險[21]。

本研究也存在一定局限性。首先，研究對象來自單中心，且樣本量較小，可能無法反映我國腎結(jié)石患者整體情況，研究結(jié)果或許也不適用于其他國家或地區(qū)。其次，本研究未納入非腎結(jié)石人群，未對上述方法在評估非腎結(jié)石人群尿液晶體形成風險的適用性進行分析。第三，本研究僅針對活度積比和EQUIL2 2種方法進行分析，未對JESS、Lithorisk等其他方法在評估草酸鈣和磷酸鈣相對過飽和水平的應(yīng)用進行比較，后續(xù)研究中應(yīng)更全面探索適合我國人口特點的評估方法。此外，由于24 h尿液標本留取存在一定不便，致使在臨床實踐中存在患者配合意愿較低、留取不準確等情況，不利于對腎結(jié)石患者及高風險人群的監(jiān)測和管理，因此需要積極探索可用于替代24 h尿液進行分析的方法。一項針對我國無腎結(jié)石群體開展的研究發(fā)現(xiàn)，尿液中草酸鈣的相對過飽和水平在上午6～10時達到高峰，8～12時的尿液可替代24 h尿液用于評估草酸鈣相對過飽和水平[22]；Rodriguez等[23]對無腎結(jié)石健康者24 h不同時段的尿液分析發(fā)現(xiàn)相對過飽和水平在一天中波動較大，其中草酸鈣和磷酸鈣的相對過飽和水平在夜間達到高峰，而尿酸的相對過飽和水平高峰則出現(xiàn)在清晨；Hinck等[24]發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石患者夜間12 h尿液中草酸鈣、磷酸鈣、尿酸的相對過飽和水平與24 h尿液指標相關(guān)性較強。目前關(guān)于選取何時段尿液標本替代24 h尿液用來預(yù)測腎結(jié)石形成風險還有待更多研究證據(jù)。

本研究顯示活度積比和EQUIL2法在評估我國腎結(jié)石患者尿液草酸鈣和磷酸鈣等常見鈣鹽成分相對過飽和水平上具有較高的一致性，可用于評價腎結(jié)石患者尿液中含鈣晶體的形成風險。同時，本研究還初步探索了活度積比和EQUIL2法關(guān)于評價草酸鈣以及常見磷酸鈣成分(透鈣磷石、羥磷灰石)尿液相對過飽和水平相關(guān)指標間的函數(shù)關(guān)系，可作為不同方法結(jié)果間比較的參考，對于腎結(jié)石患者的臨床診療和隨訪管理具有一定應(yīng)用價值。